4-wymiarowe śledzenie in vivo hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych w dorosłym szpiku kostnym nazębnym myszy

Podsumowanie

Natura interakcji między krwiotwórczymi komórkami macierzystymi i progenitorowymi (HSPC) a niszami szpiku kostnego jest słabo poznana. Niestandardowe modyfikacje sprzętowe i wieloetapowy protokół akwizycji pozwalają na wykorzystanie mikroskopii dwufotonowej i konfokalnej do obrazowania znakowanych ex vivo HSPC umieszczonych w obszarach szpiku kostnego, śledząc interakcje i ruch.

Streszczenie

Dzięki delikatnej równowadze między spoczynkiem a proliferacją, samoodnawianiem się i produkcją zróżnicowanego potomstwa, hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) utrzymują obrót wszystkich dojrzałych linii komórek krwi. Koordynacja złożonych sygnałów prowadzących do określonych losów HSC opiera się na interakcji między HSC a skomplikowanym mikrośrodowiskiem szpiku kostnego, które jest nadal słabo poznane^[1-2].

Opisujemy, jak łącząc nowo opracowany uchwyt na próbki do stabilnego pozycjonowania zwierząt z wieloetapowymi technikami obrazowania konfokalnego i dwufotonowego in vivo, można uzyskać stosy 3D o wysokiej rozdzielczości zawierające HSPC i ich otaczające nisze oraz monitorować je w czasie za pomocą wielopunktowego obrazowania poklatkowego. Obrazowanie w wysokiej rozdzielczości umożliwia wykrywanie znakowanych ex vivo hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) znajdujących się w szpiku kostnym. Co więcej, wielopunktowe obrazowanie 3D w trybie poklatkowym, uzyskane przy szybszych ustawieniach akwizycji, dostarcza dokładnych informacji o ruchu HSPC i wzajemnych interakcjach między HSPC a komórkami zrębu.

Śledzenie HSPC w odniesieniu do komórek osteoblastycznych GFP dodatnich jest pokazane jako przykładowe zastosowanie tej metody. Technika ta może być wykorzystana do śledzenia dowolnej odpowiednio oznakowanej komórki hematopoetycznej lub zrębu w przestrzeni szpiku kostnego myszy calvarium.

Wprowadzenie

Pomimo tego, że nisze komórek macierzystych są rozpoznawane od dziesięcioleci³ i dobrze scharakteryzowane w wielu tkankach, takich jak opuszka węchowa, włókno mięśniowe, wybrzuszenie mieszka włosowego czy strefa podkomorowa OUN^4-7, interakcje między hematopoetycznymi komórkami macierzystymi (HSC) a mikrośrodowiskiem szpiku kostnego (BM) są nadal słabo poznane ze względu na trudności w bezpośredniej obserwacji pojedynczych komórek przez kość, a także niezwykle płynną naturę samej tkanki. Wykazano w wielu badaniach funkcjonalnych opartych na ablacji lub nadekspresji określonych genów w HSC lub komórkach zrębu samego mikrośrodowiska, że skomplikowana sieć różnych typów komórek i sygnałów regulacyjnych jest odpowiedzialna za regulację delikatnej równowagi między spoczynkiem, proliferacją, ekspansją i różnicowaniem HSC^1-2. Wzajemne oddziaływanie między HSC a ich niszami można dogłębnie zrozumieć tylko poprzez bezpośrednią obserwację. Jest to możliwe do osiągnięcia dzięki opracowaniu zaawansowanych protokołów obrazowania, łączących dostępną technologię nie tylko w zakresie mikroskopii, ale także rozwiązań w zakresie uchwytów na próbki i oprogramowania do akwizycji.

Obrazowanie na żywo w rozdzielczości pojedynczej komórki przeszczepionych hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) w przedziale BM kości kalwarycznej myszy wykazało, że wszczepianie HSPC zlokalizowane jest w pobliżu naczyń SDF-1 i VCAM-1-dodatnich^8-9 i że więcej niedojrzałych komórek znajduje się w odległości 15 - 20 mikronów od komórek osteoblastycznych GFP-dodatnich (transgeniczna linia myszy Col2.3-GFP, w której promotor kolagenu 1α o ograniczonym dostępie do osteoblastów napędza ekspresję GFP), podczas gdy Ich potomstwo jest bardziej dystalne¹⁰. Podobne obserwacje uzyskano z wypreparowanych i złamanych kości udowych¹¹ oraz z przerzedzonych kości piszczelowych¹². Obrazowanie szpiku kostnego kości kalwarycznej pozostaje najmniej inwazyjnym podejściem do uzyskania bezpośredniej wizualizacji HSPC w ich naturalnym mikrośrodowisku.

W przypadku obrazowania żywej próbki istnieje nieodłączna potrzeba utrzymywania próbki tak nieruchomo, jak to tylko możliwe, aby uniknąć niepotrzebnych artefaktów spowodowanych ruchem próbki. Oddychanie powoduje ruchy oscylacyjne głowy myszy, których należy unikać podczas obrazowania szpiku kostnego calwariowego. Konwencjonalne uchwyty stereotaktyczne, używane na przykład do obrazowania mózgu i elektrofizjologii, nie nadają się do obrazowania kalwarii, ponieważ zasłaniają kości czołowe. Zaczynając od uchwytu na mysz używanego w celu zminimalizowania stresu podczas obrazowania na żywo i badań elektrofizjologicznych¹³, opracowano 2-składnikowy uchwyt, z małym elementem przymocowanym do głowy myszy, aby stworzyć okno obrazowania połączone z większym ramieniem, zapewniając stabilny chwyt z ciężką płytą podstawy, która mocno przylega do stolika mikroskopu. Przymocowanie głowicy do czaszki myszy umożliwia swobodne oddychanie, jednocześnie unieruchamiając głowę na miejscu i odpowiednio eliminując ruchy spowodowane oddychaniem. Mechanizm "zamka i klucza" łączący głowicę z korpusem uchwytu pozwala na zminimalizowanie rozmiaru okienka, a także zwiększenie dokładności pozycjonowania, upraszczając w ten sposób operację, a dopasowanie płyty podstawy do stolika pozwala na dokładne ustawienie na mikroskopie. Aby dokładnie monitorować ruchliwe komórki, zaprojektowano wielopunktowy protokół poklatkowy, który umożliwia śledzenie komórek w czasie z 5-minutowymi odstępami między punktami czasowymi. W tym przypadku HSC znakowane DiD są wstrzykiwane do myszy reporterowych z osteoblazycą col2.3GFP^10,14 i obrazowane około 20 godzin później. Szczegółowo opisano uchwyt na mysz, który został zaprojektowany, oraz ustawienia obrazowania wymagane do wykonania szybkiego, wielopunktowego obrazowania poklatkowego tych samych obszarów w okresie wielu godzin.

Protokół

Wszystkie procedury związane z wykorzystaniem zwierząt są przeprowadzane zgodnie z lokalnymi przepisami. Nasza praca jest zatwierdzona przez brytyjskie Ministerstwo Spraw Wewnętrznych, a także panel oceny etycznej Imperial College. Dozwolone procedury są opisane w dokumentacji licencyjnej projektu i są zgodne z wytycznymi, które zapewniają dobrostan zwierzęcia przez cały czas. Należy zapewnić przestrzeganie przepisów dotyczących doświadczeń na zwierzętach obowiązujących w kraju, w którym praca jest wykonywana.

1. Etykietowanie i wstrzykiwanie HSPC:

1. Zbieraj komórki zgodnie z opisem Lo Celso^14-15.
2. Przygotować komórki w stężeniu 10-6 komórek/ml w PBS. UWAGA: Użyj hemocytometru lub informacji dostarczonych przez sorter komórek, aby policzyć komórki; liczba komórek, które mają być znakowane i wstrzykiwane, różni się w zależności od typu komórki (barwienie, na przykład 10 000 - 20 000 HSC, 100 000 - 300 000 HPC); w przypadku pracy z mniej niż 10⁵ komórkami, ponownie zawiesić w 100 μl PBS; ważne jest, aby komórki w PBS nie zawierały surowicy, ponieważ surowica hamuje barwienie.
3. Dodać DiD do zawiesiny komórkowej w końcowym stężeniu 5 μM i natychmiast wymieszać zawiesinę, aby upewnić się, że barwnik nie wytrąci się z roztworu i nie oznaczy komórek.
4. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C, a następnie przemywać wirując w temperaturze 500 x g przez 5 minut, dekantując płyn i ponownie zawieszając osad w odpowiedniej objętości do wstrzyknięcia dożylnego (~100 - 150 μl)
5. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl PBS i zebrać do strzykawki insulinowej. UWAGA: strzykawka insulinowa jest zalecana zamiast konwencjonalnej strzykawki, ponieważ nie ma martwej przestrzeni igły, a zatem umożliwia podanie myszy całej zawiesiny komórkowej.
6. Wstrzyknij komórki śmiertelnie napromieniowanej myszy poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej. UWAGA: Napromienianie ma znany, znaczny wpływ na mikrośrodowisko szpiku kostnego (zarówno składników krwiotwórczych, jak i zrębowych), które rozwija się z czasem. Dlatego bardzo ważne jest utrzymanie stałego czasu napromieniania, wstrzykiwania komórek (od 4 do 24 godzin od napromieniania w celu uzyskania najlepszego wszczepienia) i obrazowania. W tym przypadku napromienianie wykonuje się 6 godzin przed wstrzyknięciem, a obrazowanie wykonuje się 20 godzin po wstrzyknięciu.
   1. Umieść mysz w ciepłej komorze (37 °C), aż żyła ogonowa będzie wyglądać na rozszerzoną na naczynia krwionośne.
   2. Przesuń mysz do ogranicznika i ostrożnie wsuń igłę do żyły ogonowej.
   3. Wstrzyknąć komórki do żyły - nie należy napotkać oporu przed wstrzyknięciem.
   4. Pozostaw mysz O/N, aby umożliwić komórkom migrację do przestrzeni szpiku kostnego.

2. Przygotowanie myszy do obrazowania

1. Przed użyciem należy złożyć w autoklawie jedną parę cienkich kleszczy i jedną parę cienkich nożyczek, a także nakrycie głowy i przechowywać w sterylnym środowisku.
2. Uzupełnij środek znieczulający tak świeży, jak to możliwe (0,38 ml ketaminy + 0,25 ml medetomidyny + 4,47 ml wody). UWAGA: inne zatwierdzone środki znieczulające, w tym izofluran i inne do wstrzykiwań, również będą skuteczne. Opisany koktajl należy podawać dootrzewnowo w dawce 0,1 ml na 10 g masy ciała, z dodatkami 30 - 50 μl podawanymi co 45 minut do 1 godziny.
3. W razie potrzeby włącz laser dwufotonowy, a następnie uruchom mikroskop i oprogramowanie, kalibrując stolik po wyświetleniu monitu. Włącz lasery i pozwól im się rozgrzać i ustabilizować, przygotowując mysz do obrazowania.
4. Znieczulić mysz za pomocą przygotowanej mieszaniny znieczulenia (krok 2.2) dla wybranego środka znieczulającego poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe. Monitoruj początek głębokiego znieczulenia za pomocą odruchu pedałowania teraz i w regularnych odstępach czasu przez cały czas trwania protokołu. UWAGA: mysz musi być uważnie monitorowana przez cały czas trwania zabiegu, a jeśli znieczulenie wydaje się rozjaśniać (zwykle po 45 - 60 minutach), należy podać dawkę uzupełniającą (jak opisano w 2.2). Spodziewaj się pewnych różnic między myszami w różnym wieku i różnej płci. Ważne jest, aby omówić protokół znieczulenia z lokalnym lekarzem weterynarii, aby upewnić się, że podjęto odpowiednie środki ostrożności w celu zapewnienia dobrostanu myszy.
5. Przetrzyj górną część skóry głowy 70% etanolem na chusteczce, upewniając się, że etanol nie dostanie się do oczu myszy.
6. Za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek ostrożnie usuń środkową część skóry głowy, aby odsłonić obszar kalwarii, który ma być zobrazowany: wykonaj małe nacięcie z tyłu głowy między uszami, podnosząc skórę do góry za pomocą kleszczy. Trzymając skórę do góry, wsuń nożyczki pod skórę i delikatnie przetnij wzdłuż zewnętrznej strony żądanego obszaru obrazowania.
7. Wytrzyj odsłoniętą kość sterylnym wacikiem zwilżonym sterylnym PBS, aby była wilgotna.
8. Przymocuj metalową głowicę do czaszki myszy, aby była gotowa do obrazowania.
   1. Wymieszaj odpowiednią ilość cementu dentystycznego w łódce do ważenia, aż stanie się pastą i szybko nałóż na dolną powierzchnię nakrycia głowy, które przymocuje się do czaszki.
   2. Zanim cement stwardnieje, umieść nakrycie głowy na czaszce myszy, uważając, aby cement dentystyczny nie dostał się na obszar obrazowania, a następnie poczekaj, aż stężeje.
   3. Nałóż niewielką ilość hydrożelu Intrasite, który utrzymuje wilgotność czaszki.
9. Przymocuj głowicę do uchwytu i zabezpiecz ją za pomocą, upewniając się, że rowki mieszczą się w nacięciach uchwytu.
10. Usuń hydrożel z czaszki za pomocą sterylnych patyczków kosmetycznych i wyczyść sterylnym PBS przed przeniesieniem do mikroskopu.
11. Włóż uchwyt do stolika mikroskopu, umieść matę grzewczą pod myszą, włóż sondę termometru doodbytniczego i zabezpiecz wszystko na miejscu na stoliku taśmą klejącą.
12. Umieść małą kroplę maści okulistycznej na oczach myszy, aby upewnić się, że nie wyschną podczas znieczulenia. UWAGA: myszy nie wolno pozostawiać bez opieki w żadnym momencie procesu obrazowania pod narkozą.

3. Obrazowanie in vivo: stosy w wysokiej rozdzielczości i akwizycja poklatkowa

1. Skoncentruj się na czaszce za pomocą okularów.
   1. Napełnij okienko obrazowania oczyszczoną, sterylną wodą i za pomocą soczewki zanurzającej w wodzie opuść je tak, aby dotykało kropli wody.
   2. Ustaw ostrość na czubku czaszki za pomocą okularów mikroskopu, używając zewnętrznej lampy jako źródła światła.
   3. Umieść obszar obrazowania na szwie centralnym i przesuń się w kierunku tyłu głowy, aby znaleźć szew koronalny jako pozycję wyjściową.
2. Ustaw mikroskop tak, aby umożliwić skuteczne wzbudzenie i wykrycie odpowiednich fluoroforów określonych w tabeli wzbudzenia i emisji. UWAGA: podczas gdy tutaj używany jest pionowy konfokalny Leica SP5 z konwencjonalną głowicą skanującą galwanometru działającą na platformie oprogramowania LAS-AF, procedurę można łatwo odtworzyć na innych platformach mikroskopowych/programowych. Zastosowany tutaj obiektyw to Leica HCX IRAPO L 25x W/0.95 N.A., ale dostępne są równoważne obiektywy innych producentów z odpowiednim powiększeniem i wysoką N.A.
   1. Przełącz oprogramowanie w tryb przechwytywania zarówno obrazów XY, jak i stosu 3D Z, i ustaw szybkość obrazowania na 400 Hz i rozdzielczość na 512 x 512 pikseli. UWAGA: konfiguracja i sprzęt tutaj skutkują polem widzenia 620 μm i może się to różnić na innych platformach.
   2. Ustaw oprogramowanie tak, aby można było przechwycić wiele kanałów/ścieżek, a także upewnij się, że metoda zbierania jest ustawiona tak, aby zmieniać ustawienia między stosami, jeśli to możliwe, lub przynajmniej między klatkami. Ustaw 3 niezależne ustawienia przechwytywania, wyłączając podświetlenie laserowe po zakończeniu akwizycji każdego stosu. UWAGA: do tej procedury potrzebne będą trzy kanały, aby zmniejszyć przesłuchy między kanałami.
   3. Ustaw ustawienia pierwszego skanowania sekwencyjnego dla dwufotonowego sygnału kostnego SHG (wzbudzenie 840 nm; emisja 400 - 440 nm); otwórz migawkę lasera MP i upewnij się, że wzmocnienie i przesunięcie MP są prawidłowo ustawione, moc lasera wynosi 12,5 - 25% i laser jest włączony. Wybierz odpowiedni PMT jako jedyny detektor i zmień kolor na biały. Uwaga: Detektory NDD z odpowiednimi filtrami powinny być używane do wykrywania kości, jeśli są dostępne, aby uzyskać jaśniejszy, głębszy sygnał.
   4. Powtórz procedurę konfiguracji kanału zastosowaną dla kanału GFP dla połączonej autofluorescencji (wzbudzenie 543 nm; emisja 560 - 600 nm) i DiD (wzbudzenie 633 nm; emisja 650 - 720 nm) podczas drugiego skanowania ustawień, wykorzystując dwa odpowiednie PMT. Zmień kolor kanału na zielony dla autofluorescencji i czerwony dla DiD. Uwaga: użycie koloru zielonego jako kanału autofluorescencji umożliwia łatwiejsze wykrywanie komórek DiD dodatnich, gdy te dwa kanały są nałożone na siebie - komórki autofluorescencyjne pojawiają się jako żółte/pomarańczowe, ponieważ znajdują się w obu kanałach, podczas gdy komórki DiD pojawiają się tylko jako czerwone, ponieważ pojawiają się tylko w kanale DiD. Kanał autofluorescencji jest używany tylko do tego porównania i nie jest używany w żadnej końcowej analizie, jednak jeśli użytkownik sobie tego życzy, można go zmienić na inny kolor w celu wyświetlenia, aby uniknąć pomyłki z kanałem GFP.
   5. Na koniec należy skonfigurować trzecie i ostatnie skanowanie pod kątem GFP (wzbudzenie 488 nm; emisja 500 - 530 nm); w razie potrzeby upewnij się, że migawka jest otwarta, a następnie ustaw moc lasera linii laserowej 488 nm na około 15% lub poziom odpowiedni dla używanego lasera, wybierz odpowiedni PMT jako jedyny aktywny detektor i zmień jego pseudokolor na zielony.
   6. Aktywuj tryb obrazowania "na żywo", aby rozpocząć skanowanie podglądu wybranego kanału i dostosować wzmocnienie i przesunięcie detektora w celu uzyskania optymalnej ekspozycji. Powtórz tę czynność dla każdego skanowania w oknie sekwencyjnym.
   7. Zapisz ustawienia tych skanów wielokanałowych, aby łatwo je ponownie wykorzystać. UWAGA: pozwala to użytkownikowi na ponowne załadowanie ustawień w kolejnych sesjach.
3. Aktywuj przechwytywanie wielopozycyjne, określane jako "Oznacz i znajdź" w demonstrowanym oprogramowaniu, i zresetuj punkty współrzędnych.
4. Zeskanuj obszar obrazowania kości, zaczynając od przecięcia szwu środkowego i koronalnego, zeskanuj głębokość obszaru szpiku kostnego za pomocą zarówno autofluorescencji (pseudo koloru zielonego), jak i DiD (pseudo-kolorowego czerwonego) z widokiem złożonym. UWAGA: komórki autofluorescencyjne będą obecne w obu kanałach i będą pomarańczowo-żółte na obrazie złożonym, podczas gdy komórki oznaczone DiD pojawią się jako komórki tylko na czerwono na obrazie złożonym.
5. Po wykryciu komórki oznacz ją jako nową pozycję współrzędnych (x, y i z) w narzędziu "Oznacz i znajdź", klikając ikonę "Dodaj nową pozycję" po lewej stronie okna "Zaznacz i znajdź".
6. Po sprawdzeniu bieżącego pola widzenia przesuń stolik o odległość jednego pola widzenia w lewo/w prawo/w dół/w górę. Powtórz ten proces dla każdego pola widzenia, stopniowo pracując wokół całego obszaru okna obrazowania na lewo od szwu centralnego, przesuwając się w kierunku nosa myszy. Gdy rozwidlenie szwu środkowego jest w zasięgu wzroku, przejdź na prawą stronę szwu i powtórz procedurę, skanując lewą stronę w odwrotnym kierunku (tj. w kierunku szwu koronalnego). Zaznacz współrzędne wszystkich nowych interesujących komórek za pomocą narzędzia "Oznacz i znajdź".
7. Po zakończeniu skanowania okna obrazowania użyj narzędzia "Zaznacz i znajdź", aby przejrzeć punkty (wybierz żądany punkt i przejrzyj każdy punkt z osobna). Ustaw górną i dolną część stosu Z wokół każdej komórki dla każdej pozycji (wiele platform oprogramowania pozwoli Ci wykonać niezależne stosy Z dla każdej pozycji, co zmniejszy przechwytywanie pustej przestrzeni). Dla każdego punktu ustaw ostrość w górę i w dół oraz ustaw górną i dolną pozycję Z dla przechwytywania stosu Z 3D i zaktualizuj pojedynczy punkt w polu "Oznacz i znajdź". Ustaw interwał Z-Stack na 5 μm i uśredniaj dla każdego kanału skanowania sekwencyjnego odpowiednią jakość: średnią liniową lub klatkową. UWAGA: Zwiększenie liczby skanów do średniej wydłuża czas pozyskiwania.
8. Uzyskaj wysokiej jakości stos referencyjny dla każdego interesującego miejsca, rozpoczynając całą procedurę skanowania (często określaną jako "Start", a nie "Przechwytywanie"). UWAGA: ten skan może służyć jako odniesienie dla przyszłego obrazowania z dużą prędkością.
9. Po zakończeniu skanowania w wysokiej jakości aktywuj ustawienie poklatkowe dla przechwytywania.
10. W ustawieniach poklatkowych ustaw przedział czasu na 5 minut, a całkowity czas pracy na żądaną długość (np. 5 godzin). "Zastosuj" te ustawienia do całego skanowania. UWAGA: aby skrócić ten czas skanowania, aby umożliwić 5-minutowy interwał poklatkowy, może być konieczne zmniejszenie liczby skanów używanych do uśredniania, Ogranicz rozdzielczość do 512 x 512 pikseli, przekonwertuj skanowanie na dwukierunkowe (z wymaganą korekcją fazy w celu wyrównania obu kierunków skanowania) i/lub zwiększ prędkość skanowania do 600 Hz lub więcej (więcej niż 600 Hz spowoduje powiększenie obszaru obrazowania dla demonstrowanej platformy oprogramowania). Ważne jest również, aby zauważyć, że podczas gdy początkowo do uzyskania wysokiej jakości stosu obrazów użyto trybu obrazowania sekwencyjnego, jednoczesna akwizycja jest używana do zwiększenia prędkości podczas obrazowania poklatkowego - może to spowodować lekkie przesłuchy między kanałami, co kładzie dodatkowe znaczenie na początkowe uchwycenie dokładnie oddzielonych stosów referencyjnych.
11. Rozpocznij obrazowanie (jak poprzednio, klikając przycisk "Start" w zademonstrowanym oprogramowaniu). UWAGA: upewnij się, że utrzymujesz odpowiedni poziom znieczulenia, podając kolejne, mniejsze dawki w razie potrzeby, uważając, aby nie przedawkować myszy, regularnie uzupełniaj wodę, aby obiektyw nie wysychał i monitoruj parametry życiowe i temperaturę poduszki grzewczej przez cały czas.
12. Po zakończeniu podnieś soczewkę z uchwytu, a następnie wyjmij uchwyt ze stolika mikroskopu, upewniając się, że przewody sondy doodbytniczej i maty grzewczej nie są uszkodzone.
13. Odkręć głowicę od stage uchwyt i ostrożnie wyjmij mysz. Usuń mysz za pomocą zwichnięcia szyjki macicy i usuń metalową część głowy, odrywając ją od czaszki. Zapisz dane na dysku i przenieś na serwer w celu późniejszej analizy. UWAGA: Głowicę najlepiej oczyścić, zanurzając ją w acetonie na kilka godzin i na koniec ścierając resztki cementu.

Wyniki

Specjalnie wykonany, wysokoprecyzyjny uchwyt dla myszy, wyposażony w okno obrazowania sklepienia czaszki, umożliwia długotrwałe obrazowanie znakowanych HSPC oczyszczonych metodą FACS i wstrzykniętych myszom biorcom poddanym dawce letalnej napromieniowania (Rysunek 1A). Zazwyczaj po wstrzyknięciu od 15 do 20 tysięcy znakowanych komórek, następnego dnia w obszarze obrazowania szpiku kostnego w czaszce można rozpoznać od 8 do 15 komórek. Przedstawiono tutaj sposób pozyskiwania stosów 3D z rozdzielczością pojedynczych komórek w obszarach szpiku kostnego zawierających HSPC o grubości około 90 - 120 µm (Rysunek 1B), a następnie tworzenie filmów time-lapse 4D zidentyfikowanych HSPC (Rysunek 1C oraz film).

Nieoptymalne wyniki są uzyskiwane, jeśli cement dentystyczny nie zostanie odpowiednio przygotowany; na przykład woda może wyciekać przez nieszczelne obszary i mimo że można ją uzupełniać od góry uchwytu, każdy okres czasu, w którym soczewka nie jest zanurzona w wodzie, prowadzi do pojawienia się czarnych ramek. Pewien dryft obrazu jest nieunikniony ze względu na rozszerzalność termiczną materiałów uchwytu dla myszy, jednak może być on nasilony przez nieoptymalną adhezję cementu, prowadzącą do stopniowego odrywania się myszy, oraz przez zakłócenia w ustawieniu zestawu obrazującego, co prowadzi do nagłych przeskoków ostrości podczas obrazowania time-lapse. Dryft podczas wielopunktowego obrazowania time-lapse może być również spowodowany niedokładnościami w ruchach stolika przy powrocie do wcześniej obrazowanych pozycji. Artefakty w postaci dryftu i przeskoków w filmach time-lapse można skorygować, stosując algorytmy rejestracji obrazu.

Tabela 1. Ustawienia wzbudzenia i emisji.

Kanał kolorów	Wzbudzenie	Emisja
GFP	488 nm	500 – 530 nm
Autofluorescencja	543 nm	560 – 610 nm
DiD	633 nm	640 – 700 nm
SHG	840 nm (MP)	400 – 450 nm

Rycina 1. Obrazowanie 4D in vivo HSPC w sklepieniu czaszki myszy. (A) Schemat doświadczenia. (B - C) przykłady uzyskanych wyników. (B) Przekroje 2D ze stosu 3D (całkowita głębokość wynosi 114 μm), zawierające sygnał z kolagenu kostnego (biały), komórek znakowanych DiD (czerwony), komórek autofluorescencyjnych (żółty) oraz komórek osteoblastycznych (zielony). Paski skali: 100 μm. (C) Przekroje 2D z filmu 4D time-lapse pokazujące migrację znakowanej DiD komórki HSC (czerwona) w sąsiedztwie komórek osteoblastycznych (zielone). Linia przerywana zaznacza przesunięcie komórki. Paski skali: 50 μm (B) oraz 100 μm (C). UWAGA: Film uzyskany z akwizycji time-lapse w punkcie (C) jest prezentowany w trakcie artykułu wideo. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Co udało się osiągnąć?

Protokół wykorzystuje wielowymiarowe obrazowanie poklatkowe do monitorowania migracji oczyszczonych, znakowanych ex vivo , przeszczepionych HSPC FACS w szpiku kostnym myszy w kształcie kości rzęsowej. Udało się zidentyfikować pojedyncze przeszczepione komórki, które były monitorowane przez dłuższy czas (hr) z dużą dokładnością. Artefakty ruchowe wywołane oddychaniem zostały zminimalizowane, a komórki były wielokrotnie odtwarzane w dłuższym czasie.

Jakie są kierunki na przyszłość?

Rozwój tej techniki może przyczynić się do eksperymentów regeneracyjnych, które umożliwią obrazowanie przez wiele dni, w ciągu tygodnia lub dłużej oraz stosowanie gazowych środków znieczulających, takich jak izofluran, w celu skrócenia i uproszczenia procesu rekonwalescencji myszy (Uwaga: eksperymenty regeneracyjne wymagają ściśle sterylnych warunków chirurgicznych i podawania odpowiednich leków przeciwbólowych). Opracowanie większej palety kolorów barwników in vivo , a także skuteczne znakowanie genetyczne komórek krwiotwórczych ułatwi również eksperymenty z wieloma znakowaniami, zapewni lepszy wgląd w interakcje komórka-komórka w szpiku kostnym i pozwoli na bardziej złożone eksperymenty w przyszłości. Dodatkowo, jednoczesne znakowanie wielu struktur szpiku kostnego i komponentów zrębu zapewni pełniejszy obraz zdarzeń zachodzących w niszach HSPC. Stabilność obrazu filmów poklatkowych można poprawić przed akwizycją poprzez dalszą stabilizację mikroskopu, a także zminimalizowanie gradientów temperatury w próbce i po akwizycji dzięki zastosowaniu algorytmów rejestracji obrazu.

Ograniczenia:

Opisana technika ma pewne ograniczenia. Przeżywalność myszy po podaniu środków znieczulających do wstrzykiwań jest nieprzewidywalna i bardzo łatwo jest doświadczyć powikłań w zależności od indywidualnej reakcji na znieczulenie. Ogólnie rzecz biorąc, im dłuższa sesja obrazowania, tym trudniej jest myszowi dojść do siebie po znieczuleniu, dlatego ważne jest, aby dokładnie zaplanować, czy mysz ma zostać odzyskana, najlepiej ograniczając czas trwania obrazowania poklatkowego. Stosowanie środków znieczulających do wstrzykiwań ogranicza czas, przez jaki może trwać każda sesja obrazowania. Chociaż możliwe jest przedłużenie znieczulenia poprzez odczytanie mniejszej dawki środka znieczulającego, trudno jest to zrobić dokładnie, a przedawkowanie myszy jest jedną z najczęstszych przyczyn przedwczesnego zakończenia obrazowania in vivo . Znieczulenie gazowe jest mniej toksyczne i pozwala na dłuższą wstępną sesję obrazowania, jednak szybki powrót myszy do zdrowia po >2 godzinach podawania izofluranu rzadko kończy się sukcesem. Kolejnym ograniczeniem tej techniki jest ograniczona rozdzielczość obrazów, które można uzyskać podczas wielopunktowego obrazowania poklatkowego, ze względu na konieczność szybkiego pozyskiwania obrazów. To, w połączeniu z ogniskowym dryfem lub skokami w terenie (omówionymi powyżej), może utrudnić śledzenie komórek.

Porównanie z metodami alternatywnymi:

HSPC są zwykle znakowane lipofilowym barwnikiem DiD, ale barwniki DiR i DiI są równoważnymi alternatywami, a inne barwniki komórkowe mogą być stosowane, o ile są wystarczająco jasne, jak omówiono w^[16]. Chociaż wykazano, że znakowanie ex vivo komórek za pomocą DiD nie wpływa na długoterminową funkcję HSC, ma ograniczenie polegające na tym, że DiD (lub jakikolwiek inny barwnik chemiczny) jest rozcieńczany po podziale komórki. Ponieważ HSC namnażają się w pierwszych dniach po przeszczepie, stosunek sygnału do szumu dla tych komórek gwałtownie się pogarsza. Endogenne znakowanie komórek za pomocą manipulacji genetycznej i ekspresji białek fluorescencyjnych jest realną metodą alternatywną, o ile białka fluorescencyjne ulegają ekspresji na wystarczająco wysokim poziomie, aby wygenerować sygnał wykrywalny przez kość czaszki. Istnieje wiele alternatywnych technik obrazowania HSPC w przestrzeni szpiku kostnego, z których każda ma swoje zalety i ograniczenia. Wprowadzenie światłowodowych urządzeń do obrazowania pozwoliło na obrazowanie rekonstytucji szpiku kostnego w kościach długich^[8], podczas gdy obrazowanie konfokalne po chirurgicznym odsłonięciu kości piszczelowej i ścieńczeniu szkliwa kostnego za pomocą wiertła chirurgicznego^[12] uzyskało szczegółowe obrazy HSPC znajdujących się w obwodowych obszarach kości długich. Metody te są jednak znacznie bardziej inwazyjne niż opisana tutaj i dlatego nie pozwalają na powtórzenie sesji obrazowania skupiających się na tym samym obszarze szpiku kostnego u tej samej myszy. Co więcej, możliwe jest, że techniki te mogą wpływać na obserwowane komórki, biorąc pod uwagę nieuniknioną reakcję na rozległe uszkodzenia otaczających tkanek. HSPC były obrazowane przez krótkie okresy czasu za pomocą szkiełek nakrywkowych umieszczonych na wyciętych, złamanych kościach udowych ^[11], jednak wpływ tego surowego przygotowania tkanki na HSPC nie jest jasny, a technika ta została wykorzystana wyłącznie do uzyskania obserwacji pojedynczego punktu czasowego. Nieruchome kości zostały pocięte na szeregowe sekcje, wybarwione, a uzyskane obrazy zrekonstruowane do modelu 3D, zapewniając doskonałą rozdzielczość 3D, zwłaszcza gdy stosowane są odlewy naczyniowe[^17], a ostatnio zastosowano laserową cytometrię skaningową (LaSC) do uzyskania pomiarów ilościowych dotyczących HSPC in situ, podkreślonych za pomocą barwienia immunologicznego^[18] ale nie są w stanie dostarczyć żadnych informacji czasowych o zachowaniu komórek. Techniki opisane w tej nowej technice zapewniają połączenie dobrej rozdzielczości w 3D, wystarczającego próbkowania czasowego do monitorowania komórek w 4D i są stosunkowo nieinwazyjne, co stanowi idealne podejście do osiągnięcia długoterminowego monitorowania HSPC oddziałujących z mikrośrodowiskiem szpiku kostnego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ketamina (Narketan 100 mg/ml)	Vetoquinol	407575 0107 C	Zamiast tego można zastosować inne środki znieczulające.
Medetomidyna (Domitor 1 mg/ml)	Elanco	134800-2	Zamiast tego można stosować inne leki przeciwbólowe.
Żywe rozwiązanie do etykietowania komórek DiD	Roche Products Ltd.	V22887	Dostępne są inne kolory, które w razie potrzeby mogą być używane.
Maść oftalmowa Lacrilube	Allergan	n/a	dostępna na receptę przez lokalnego weterynarza
Kemdent "Diamond Carve" cement szkło-jonomerowy	Associated Dental Products Ltd. przez Kemdent	SUN527	Używamy odcienia A3, ale można użyć dowolnego odcienia cementu.
PBS wielokrotny	ekwiwalent
Strzykawki insulinowe	Terumo Medical Corporation	SS10M3109	1 ml, 31 G
Ogranicznik myszy	Harvard Aparat	340031	Stożek (mały)
Autoklawowane kleszcze i nożyczki	Agar Scientific	AGT577 AGT5034	Nożyczki do przysłony - 90 mm; Pęseta Dumont HP (końcówka 0,06 mm)
Mieszadło do ważenia łodzi i cementu	VWR	611-1996/231-0370	ml łódka wagowa ()/ Drewniany depresor językowy
Pionowy mikroskop konfokalny Leica SP5 z zmotoryzowanym stolikiem i dwufotonowym laserem	Leica Microsystems		Zapytaj o ofertę
25-krotna soczewka obiektywowa do zanurzania w wodzie (ND = 0,95)	Soczewka
Leica Microsystems 11506323 HCX IRAPO LSpecjalnie zaprojektowany uchwyt na mysz	Imperial College Engineering Workshop		Szczegółowe informacje można znaleźć na rysunku 1
Poduszka grzewcza z sondą termometru doodbytniczego	Oprzyrządowanie BASi	FHC-40902 / FHC-40908 / FHC-4090502	Mata grzewcza / Skrzynka sterownicza / Sonda termometru

5