Mikrodysekcja jest szeroko stosowana do badania DNA, RNA i białek w tkance. Mikroskopia laserowa (LCM) jest najczęściej stosowaną metodą, ale od niedawna dostępna jest nowa technika mielenia, mezodysekcja. Pokazujemy ekstrakcję RNA z mezorozpreparowanych szkiełek tkankowych zatopionych w parafinie w formalinie ziarniniaków Mycobacterium tuberculosis.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Nowatorskie podejście do mikrodysekcji w celu odzyskania specyficznych transkryptów Mycobacterium tuberculosis z ziarniniaków płuc zatopionych w parafinie utrwalonej w formalinie
W tym artykule
Informacja o sprostowaniu
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Podsumowanie
Streszczenie
Mikrodysekcja jest używana do badania tkanek na poziomie DNA, RNA i białek od ponad dekady. Laserowa mikroskopia wychwytywająca (LCM) jest obecnie najpowszechniejszą techniką mikrodysekcji. W tej technice laser jest używany do ogniskowego stopienia membrany termoplastycznej, która pokrywa odwodnioną sekcjętkanki 1. Kompozyt wycinka tkanki jest następnie podnoszony i oddzielany od membrany. Chociaż technika ta może być z powodzeniem stosowana do badania tkanek, jest czasochłonna i kosztowna. Co więcej, pomyślne zakończenie zabiegów z wykorzystaniem tej techniki wymaga użycia lasera, co ogranicza jego zastosowanie. Nowe, bardziej przystępne cenowo i praktyczne podejście do mikrodysekcji, zwane mezodyssekcją, jest możliwym rozwiązaniem pułapek LCM. Technika ta wykorzystuje system MESO-1/MeSectr do mielenia żądanej tkanki z próbki tkanki zamontowanej na szkiełku, przy jednoczesnym dozowaniu i zasysaniu płynu w celu odzyskania żądanej próbki tkanki do ściernego wiertła młynarskiego. Przed rozpoczęciem procesu preparacji użytkownik wyrównuje szkiełko zatopione w parafinie w formalinie (FFPE) ze szkiełkiem referencyjnym barwionym hematoksyliną i eozyną (H&E). Następnie operator zaznacza żądany obszar rozwarstwienia i przystępuje do preparacji odpowiedniego segmentu. Program generuje zarchiwizowany obraz sekcji. Główną zaletą mezodysekcji jest krótki czas potrzebny do wypreparowania szkiełka, który w tym eksperymencie trwa średnio dziesięć minut od ustawienia do wygenerowania próbki. Dodatkowo system jest znacznie bardziej ekonomiczny i przyjazny dla użytkownika. Niewielką wadą jest to, że nie jest tak precyzyjna jak mikroskopia laserowa. W tym artykule pokazujemy, w jaki sposób mezodysekcja może być wykorzystana do ekstrakcji RNA ze szkiełek z ziarniniaków FFPE wywołanych przez Mycobacterium tuberculosis (Mtb).
Wprowadzenie
Próbki tradycyjnie były ręcznie mikropreparowane z całej tkanki lub szkiełek za pomocą igły i skalpela. Wymaga to wyraźnego oddzielenia interesującego fragmentu tkanki od otaczających go odcinków tkanek2. Wraz z obecnymi postępami w technologii profilowania molekularnego pojawiła się rosnąca potrzeba oceny tkanki na poziomie komórkowym. Ze względu na ograniczenia ręcznej mikrodysekcji, opracowano techniki, w tym LCM, aby umożliwić większą precyzję izolacji. Technika ta pozwala badaczowi na wyizolowanie określonych populacji komórek z różnych typów komórek i szkiełek, które można następnie wykorzystać do dalszych testów, takich jak profilowanie ekspresji genów. Chociaż LCM jest bardzo skuteczny w dalszych testach, nie jest pozbawiony ograniczeń. Po pierwsze, LCM jest kosztownym i czasochłonnym procesem. Dodatkowo, ze względu na niestabilny charakter RNA, często trudno jest uzyskać wysokiej jakości RNA z próbek LCM2. Ze względu na wady LCM, nadal potrzebne są nowe postępy w technologii mikrodysekcji, aby uczynić ją bardziej dostępną dla większej liczby badaczy w przystępny i wrażliwy na czas sposób.
Jednym z takich postępów w technologii mikrodysekcji, obecnie dostępnym, jest technika znana jako mezodyssekcja. W tej technice maszyna jest używana do mielenia interesującego nas fragmentu tkanki z adnotacjami i zasysania go do topliwego wiertła młynarskiego3. Następnie próbkę tę można zassać do probówki zbiorczej i wykorzystać do dalszych zastosowań. Zaletą tego systemu jest to, że jest znacznie tańszy i wrażliwy na czas. Z naszego doświadczenia wynika, że system pozwala na wypreparowanie wycinka tkanki ziarniniaka płuca w ciągu dziesięciu minut. Z drugiej strony, tradycyjny LCM prawdopodobnie wymagałby godzin na ukończenie procesu. System umożliwia operatorowi załadowanie szkiełka referencyjnego, który może służyć jako narzędzie do porównania, a także jako narzędzie do adnotacji. Dodatkowo generowany jest raport przedstawiający obszar slajdu, który został przeanalizowany. Mezodysekcja ma dwie główne wady. Chociaż skutecznie wyodrębnia wiele komórek, trudno jest wyizolować pojedynczą komórkę. Ponadto precyzja generowanego obrazu nie jest tak wyraźna, jak w przypadku korzystania z innych mikroskopów obrazowych.
Gruźlica (TB) jest główną chorobą zakaźną zabijającą ludzkość na całym świecie i wynika z zakażenia Mtb. U większości osób narażonych na działanie aerozoli Mtb zakażenie jest utajone ograniczone. U co najmniej 10 milionów ludzi rocznie prowadzi do aktywnej gruźlicy4. Podczas utajonej infekcji Mtb jest zawarty w patologicznych zmianach płuc zwanych ziarniniakami. W związku z tym argumentowano, że wynik zakażenia Mtb jest określany na poziomie ziarniniaka5.
Tutaj pokazujemy, jak mezodysekcja może być używana do mikropreparowania ziarniniaków spowodowanych przez Mtb. Użyte preparaty pochodzą z tkanki płucnej FFPE pochodzących od zakażonych makaków rezusów. Na potrzeby tej demonstracji przeanalizujemy ziarniniaki w całości. Pokazujemy również, że RNA można wyekstrahować z odzyskanej tkanki. Technikę tę można zastosować do próbek tkanek z różnych innych próbek, a następnie wykorzystać do różnych dalszych testów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Kalibracja instrumentu do mezodysekcji za pomocą oprogramowania do obrazowania 2iD
Oprogramowanie do obrazowania 2iD będzie określane jako oprogramowanie lub program do końca tego artykułu. Ten krok jest potrzebny, aby poprawnie śledzić obraz, a także wyrównać wiele ramek slajdów.
- Włącz instrument i komputer.
- Otwórz oprogramowanie i wybierz "kalibruj przyrząd".
- Skalibruj skok stage za pomocą joysticka. Przesuń scenę do lewego górnego położenia. Naciśnij "ustaw" w kroku 1 w programie.
- Przesuń stolik do prawego dolnego położenia. Naciśnij "ustaw" w kroku 2 w programie.
- Skalibruj aspirację, naciskając najpierw "przycisk Z", aby podnieść zespół głowicy. Naciśnij przycisk "zasysanie impulsu" i przycisk "rozwarstwienie" na joysticku, aż drążek sterujący tłokiem osiągnie górną pozycję. Naciśnij "ustaw" w kroku 3 programu.
- Naciśnij przycisk "reset zasysania". Gdy tłok zatrzyma się w dolnym położeniu, naciśnij "set" w kroku 4.
- Kliknij zakładkę "skala".
- Umieść linijkę kalibracyjną po pustej stronie.
- W razie potrzeby ustaw ostroskop.
- Narysuj linię między dwoma paskami skali za pomocą myszy.
- Wprowadź odległość w polu oznaczonym krokiem 2. Naciśnij przycisk "oblicz".
- Kliknij zakładkę "celownik". Ustaw prędkość silnika na 1.
- Włóż xScisor do zespołu głowicy. Opuść zespół głowicy do pozycji gotowości osi z, naciskając przycisk "oś z". UWAGA: Zespół głowicy to duża konstrukcja na górze narzędzia do preparowania. xScisor będzie określany jako zużywalny bit młynarski w pozostałej części tego artykułu.
- Kliknij przycisk "włącz sekcję" na joysticku. UWAGA: Ten przycisk znajduje się w górnej części joysticka.
- Określ wizualnie środek obrotu. W tym celu należy przesunąć środek celownika nad środek obrotu za pomocą parametru zdefiniowanego w kroku 1 programu. Użyj strzałek w górę i w dół na paskach "x" i "oś y", aby dostosować piksele w celu wyrównania krzyżyka. Kliknij zakładkę "gotowe".
- Kliknij ikonę "strona główna". UWAGA: Jest to reprezentowane przez obraz domu znajdujący się w prawym górnym rogu.
2. Utwórz obraz referencyjny
- Umieść slajd H&E na scenie. Umieść nieprzezroczystą pokrywę na szkiełku. Steruj instrumentem, przesuwając joystick w żądany obszar suwaka H&E. Zapisz wygenerowany obraz. UWAGA: Do wykonania tego kroku można użyć zakładki "odniesienie do przechwytywania" lub zakładki "analiza".
3. Wyrównaj tkankę do sekcji
- Kliknij opcję "wypreparuj tkankę" na ekranie głównym.
- Wypełnij pola "operator", "numer dostępu do sekcji", "referencyjny numer dostępu", "numer kodu kreskowego xCisor", "numer partii płynu preparacyjnego", "rozmiar xCisor" i "opis" w zakładce "ustawienia".
- Kliknij zakładkę "znajdź tkankę".
- Zaimportuj wcześniej zapisany obraz referencyjny.
- Umieść na stoliku niebarwione szkiełko FFPE o grubości 5 mikronów. Przenieś stół montażowy do tego samego obszaru, który został przedstawiony na obrazie referencyjnym. Kliknij zakładkę "wstaw obraz".
- Kliknij zakładkę "wyrównaj". Użyj myszy i powiązanych strzałek, aby wyrównać obraz referencyjny do obrazu niepoplamionego.
4. Dodaj adnotację do slajdu
- Kliknij zakładkę "adnotacja".
- Użyj myszki, aby narysować okrąg wokół żądanego obszaru szkiełka, który zostanie poddany mikrosekcji.
5. Załaduj zużywalny bit młynarski
- Napełnij końcówkę młyna eksploatacyjnego żądanym buforem, w tym przypadku buforem PKD, pociągając kilkakrotnie tłok w górę iw dół płynnym ruchem. Upewnij się, że wykluczyłeś pęcherzyki powietrza.
- Podnieś oś Z, naciskając "przycisk osi Z".
- Załaduj ścierniwo do młyna do maszyny. W tym celu należy wsunąć eksploatacyjną końcówkę młyna do górnej części maszyny, tak aby biała linia na instrumencie zrównała się z czarną linią na eksploatacyjnym wiertle młynkowym. Naciśnij przycisk "reset aspiracji", aby umożliwić opuszczenie tłoka do właściwej pozycji. UWAGA: Przesuwanie ściernicy powinna być łatwa. Jeśli tak nie jest, upewnij się, że nacięcia są prawidłowo wyrównane.
- Opuść oś Z, ponownie naciskając przycisk "Oś Z".
6. Wypreparuj tkankę (Rysunek 4)
- Otwórz zakładkę "rozdziel".
- Ustaw prędkość silnika i zasysania na 1.
- Zaznacz pole "pokaż śledzenie". Uwaga: Dzięki temu użytkownik może zwizualizować wycięty obszar podczas procesu preparacji.
- Gdy będziesz gotowy do sekcji, przytrzymaj przycisk "włącz" oraz przycisk "aspiruj", przesuwając joystick w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby wypreparować tkankę.
- Kontynuuj analizę w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aż zakładka aspiratu stanie się "pełna", zmieni kolor na czerwony.
7. Opróżnij i usuń zużywalne wiertło młynarskie
- Umieść rurkę do mikrofuge o pojemności 0,5 μl pod końcówką ściernicy do materiałów eksploatacyjnych.
- Naciśnij szybko pręt sterujący "aspiracją", aby wyrzucić próbkę do probówki do mikrofuge.
- Naciśnij ze zwiększoną siłą, aby wysunąć zużyty frez do materiałów eksploatacyjnych.
- Wypłukać fragment tkanki, odciągając tłok do tyłu. Popchnij tłok do przodu, aby odciągnąć pozostałą próbkę do ściernego wiertła młyna. Fragment tkanki będzie teraz przechowywany w probówce do mikrofuge.
8. Liza próbki z trawieniem proteinazy K, a następnie obróbką cieplną
- Dodać 70 μl TE pH 8,5 zawierającego 5 μg proteinazy K do odzyskanej próbki tkanki.
- Umieścić próbkę w programowalnym grzałce-wytrząsarce.
- Całkowite roztwarzanie za pomocą programowalnej grzałki-wytrząsarki przy następującym ustawieniu: 60 °C przez 30 min przy 1 500 obr./min; 82 °C przez 15 min przy 1 500 obr./min i 25 °C przez 1 min przy 450 obr./min. Próbka jest teraz gotowa do dalszych zastosowań.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wspomniany protokół pokazuje, jak wykorzystać nową technikę mezodysekcji do ekstrakcji RNA z preparatów tkanek utrwalonych w FFPE. Skuteczność tego protokołu wykazano na preparatach FFPE z ziarniakami płuc od NHP zainfekowanych Mtb w różnych stadiach infekcji. Ryciny 1-3 przedstawiają obrazy urządzenia. Rycina 4 obrazuje przebieg procesu dysekcji oraz wynikowy obraz wygenerowany przez oprogramowanie. Tabela 1 przedstawia wyniki ekstrakcji RNA z ziarniaka od NHP ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Mezodysekcja to technika, którą można zastosować do ekstrakcji RNA z patologicznych szkiełków zmian chorobowych spowodowanych przez szeroką gamę patogenów. Konieczne jest, aby użytkownik śledził obraz i prawidłowo go wyrównywał. Aby to osiągnąć, przyrząd musi zostać skalibrowany zgodnie ze wskazówkami w oprogramowaniu do obrazowania. Podczas sekcji, jeśli szkiełko i obszar zainteresowania nie są wyrównane, użytkownik musi ponownie skalibrować instrument. Kolejnym krytycznym krokiem w procesie rozwarstwiania jest załadowa...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy ujawniają, że nie ma konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować następującym nagrodom/subnagrodom NIH za wsparcie tych badań: R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08 i P51OD011104.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| MeSectr | AvanSci Bio | Mezodissector | |
| 400 nm xScisors | AvanSci Bio | Dostępne inne rozmiary | |
| THOR | AvanSci Bio | Programowalna grzałka-wytrząsarka | |
| NanoDrop2000 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| RNeasy Zestaw do ekstrakcji FFPE | Qiagen | 73504 | |
| System FFPE Ovation RNA-Seq | Nugen | 7150 | |
| QIAquick PCR | Qiagen | 28104 |
Bibliografia
- Fend, F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. J Clin Pathol. 53 (9), 666-672 (2000).
- Esposito, G. Complementary techniques: laser capture microdissection--increasing specificity of gene expression profiling of cancer specimens. Adv Exp Med Biol. 593, 54-65 (2007).
- Adey, N., Bosh, D., Emery, D., Birch, L., Parry, R. Mesodissection of Paraffin Embedded Slide Mounted Tissue Sections. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (6), (2012).
- Fleischmann, R. D., Alland, D., Eisen, J. A., Carpenter, L., White, O., Peterson, J., et al. Whole-genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains. J Bacteriol. 184 (19), 5479-5490 (2002).
- Russell, D. G., Barry 3rd, C. E., Flynn, J. L. Tuberculosis: what we don't know can, and does, hurt us. Science. 328 (5980), 852-856 (2010).
- Mesodissection of fibrous tissue. AvanSciBio. , (2013).
- Paige, C., Bishai, W. R. Penitentiary or penthouse condo: the tuberculous granuloma from the microbe's point of view. Cell Microbiol. 12 (3), 301-309 (2010).
- Mehra, S., Alvarez, X., Didier, P. J., Doyle, L. A., Blanchard, J. L., Lackner, A. A., et al. Granuloma correlates of protection against tuberculosis and mechanisms of immune modulation by Mycobacterium tuberculosis. J Infect Dis. 207 (7), 1115-1127 (2013).
- Kaushal, D., Schroeder, B. G., Tyagi, S., Yoshimatsu, T., Scott, C., Ko, C., et al. Reduced immunopathology and mortality despite tissue persistence in a Mycobacterium tuberculosis mutant lacking alternative sigma factor, SigH. Proc Natl Acad Sci U S A. (12), 8330-8335 (2002).
- Mehra, S., Kaushal, D. Functional genomics reveals extended roles of the Mycobacterium tuberculosis stress response factor sigmaH. J Bacteriol. 191 (12), 3965-3980 (2009).
- Rohde, K. H., Veiga, D. F., Caldwell, S., Balazsi, G., Russell, D. G. Linking the transcriptional profiles and the physiological states of Mycobacterium tuberculosis during an extended intracellular infection. PLoS Pathog. 8 (6), (2012).
- Fontan, P. A., Voskuil, M. I., Gomez, M., Tan, D., Pardini, M., Manganelli, R., et al. The Mycobacterium tuberculosis sigma factor sigmaB is required for full response to cell envelope stress and hypoxia in vitro, but it is dispensable for in vivo growth. J Bacteriol. 191 (18), 5628-5633 (2009).
- Rustad, T. R., Harrell, M. I., Liao, R., Sherman, D. R. The enduring hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis. PLoS One. 3 (1), (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Sprostowanie
Formal Correction: Erratum: A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas
Posted by JoVE Editors on 7/01/2014. Citeable Link.
The corresponding author was changed for the article, A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas. The corresponding author was changed from:
Teresa A. Hudock
to:
Deepak Kaushal
