Method Article

Ekspresja rekombinowanej celulazy Cel5A z Trichoderma reesei w roślinach tytoniu

DOI:

10.3791/51711

⸱

June 13th, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Molecular Biotechnology, Bio7, RWTH Aachen University, 2Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rośliny tytoniu zostały użyte do produkcji celulazy grzybowej, TrCel5A, za pomocą systemu ekspresji przejściowej. Ekspresję można było monitorować za pomocą fluorescencyjnego białka fuzyjnego, a aktywność białka scharakteryzowano po ekspresji.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enzymy rozkładające celulozę, celulazy, są przedmiotem zarówno badań, jak i zainteresowań przemysłowych. Przewaga tych enzymów w organizmach trudnych do hodowli, takich jak grzyby budujące strzępki i bakterie beztlenowe, przyspieszyła stosowanie technologii rekombinowanych w tej dziedzinie. Metody ekspresji roślin są pożądanym systemem do produkcji enzymów i innych białek użytecznych w przemyśle na dużą skalę. W niniejszym artykule przedstawiono metody przejściowej ekspresji endoglukanazy grzybowej, Trichoderma reesei Cel5A, w Nicotiana tabacum. Pokazano udaną ekspresję białka, monitorowaną przez fluorescencję przy użyciu białka fuzyjnego mCherry-enzym. Dodatkowo do badania aktywności przejściowo eksprymowanego T. reesei Cel5A wykorzystuje się zestaw podstawowych testów, w tym SDS-PAGE, Western blotting, zymografię, a także testy fluorescencji i degradacji substratów na bazie barwników. Opisany tutaj system może być wykorzystany do wytworzenia aktywnej celulazy w krótkim czasie, tak aby ocenić potencjał do dalszej produkcji w roślinach za pomocą konstytutywnych lub indukowalnych systemów ekspresji.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Degradacja biomasy lignocelulozowej i jej przekształcenie w paliwo płynne zostało przewidziane jako metoda zmniejszenia zależności od paliw kopalnych. Jedną z istotnych przeszkód w tworzeniu ekonomicznie opłacalnych systemów przetwarzania biomasy jest enzymatyczna degradacja celulozy i hemicelulozy1. Systemy ekspresji roślinnej wykazują duży potencjał w zakresie produkcji enzymów na skalę przemysłową. Systemy rolnicze mające na celu ekonomiczne i ilościowe zbieranie roślin są już ugruntowane, tak jak to miało miejsce przez tysiące lat. Produkcja celulazy w roślinach jest pożądana ze względu na takie czynniki, jak łatwość autohydrolizy2 oraz poten....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wzrost dzikich roślin typu N. tabacum

  1. Aby wyhodować rośliny N. tabacum L. cv. Petit Havana SR1 na glebie, umieść nasiona tytoniu w odpowiednich doniczkach wypełnionych normalną ziemią doniczkową do kiełkowania. Po 2 tygodniach przenieś sadzonki do pojedynczych doniczek. Inkubuj rośliny w szklarni o stałej temperaturze 22 °C (okres ciemny) lub 25 °C (okres jasny) i wilgotności względnej powietrza 70%. Zapewnij oświetlenie w 16/8 godzinnym cyklu światło/ciemność (np. lampy Philips IP65 400 W; 180 μmol·sec-1·m-2; λ= 400-700 nm) i wodę.

2. Przejściowa ekspresja białek....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TrCel5A i TrCel5A-mCherry zostały pomyślnie wyrażone w roślinach tytoniu przy użyciu systemu ekspresji przejściowej (Rysunki 1A i 1B). Badanie wzorca ekspresji białka fuzyjnego TrCel5A-mCherry ujawniło zdrowe liście (ryc. 1C), które wykazywały powszechną ekspresję białka w zielonym świetle (ryc. 1D).

Ekstrakcja całkowitych rozpuszczalnych białek została przeprowadzona na roślinach tytoniu, które miały liście zawierające przejś.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rekombinowana ekspresja celulaz jest dziedziną dużego zainteresowania ze względu na pragnienie bardziej wydajnych systemów produkcji biopaliw1. Rośliny oferują wiele możliwości udanej produkcji celulazy, a cechy takie jak ekonomiczne techniki zbioru i metody autohydrolizy są bardzo pożądanymi właściwościami przy produkcji biopaliw na dużą skalę. Co więcej, zastosowanie różnych lokalizacji do produkcji białek pozwala, w razie potrzeby, na modyfikacje potranslacyjne20. Modyfikowanie roślin w celu umoż.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez inicjatywę BMBF Forschungsinitiative "BioEnergie 2021 – Forschung für die Nutzung von Biomasse" oraz Klaster Doskonałości "Dostosowane do potrzeb paliwa z biomasy", który jest finansowany przez Inicjatywę Doskonałości przez niemiecki rząd federalny i rządy krajów związkowych w celu promowania nauki i badań na niemieckich uniwersytetach.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4-metylolumbelliferyl β-D-celobiozydSIGMA-ALDRICHM6018
Kwas octowyROTH3738
Acetosyringon (skoncentrowany)ROTH6003
Antybiotyk - kanamycynaROTHT832
Antybiotyk - ryfampicynaROTH4163
Antybiotyk - karbenicylinaROTH6344
Przeciwciało - królicze anty His(6) pAbROCKLAND600-401-382
Przeciwciało - koza anty królik AP, FC pAbDIANOVA111-055-008
Azo-karboksymetylocelulozaMEGAZYMES-ACMC
β-cyklodekstrynaSIGMA-ALDRICHC4805
Chlorek wapnia dwuwodnySIGMA-ALDRICHC5080
KarboksymetylocelulozaROTH3333.1
Celulaza z Trichoderma reesei ATCC 26921SIGMA-ALDRICHC2730
Czerwień kongijskaSIGMA-ALDRICH75768
Coomasie brylantowy niebieski G 250ROTH9598.2
D(+)-glukozaROTH8337
EtanolROTHK928
Bibuła filtracyjna - bibuła RotilaboROTHCL67
NBT/BCIPSIGMA-ALDRICH72091
Bufor MESROTH4256
MetanolROTH8388
Cytrynian soduROTH3580
Dodecylosiarczan soduSERVA20765
Wodorotlenek soduROTH6771
Gleba, Einheitserde classic Spektrometr PATZER GMBH
- Infinite M200TECAN
SacharozaSIGMA-ALDRICHS-5390
4-hydroksybenzhydrazyd SIGMA-ALDRICHH9882
Źródło światła UV buforowane fosforanem ROTH1058
- BLAK RAYUVP
Vibratome - VT1000SLeica

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Garvey, M., Klose, H., Fischer, R., Lambertz, C., Commandeur, U. Cellulases for biomass degradation: comparing recombinant cellulase expression platforms. Trends in Biotechnology. 31, 581-593 (2013).
  2. Klose, H., Günl, M., Usadel, B., Fischer, R., Commandeur, U.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Transient ExpressionTobacco PlantsAgrobacterium InfiltrationProtein PurificationSDS PAGEWestern BlottingZymographyFluorescence AssayEnzymatic ActivityCellulase Cel5A

Related Articles