Przeszczep skóry ogona jest potężnym modelem do badania zależnego od limfocytów T odrzucania i indukcji tolerancji podczas allogenicznych odpowiedzi immunologicznych u myszy. Zaletami tego protokołu są drobne inwazyjne zabiegi chirurgiczne oraz łatwość monitorowania bez konieczności poświęcania myszy biorcy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przeszczep skóry ogona w celu zbadania allogenicznych odpowiedzi limfocytów T CD4 u myszy
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badanie odpowiedzi limfocytów T i ich konsekwencji podczas rozpoznawania alloantygenu wymaga modelu, który umożliwia rozróżnienie limfocytów T dawcy i gospodarza, łatwe monitorowanie przeszczepu i dostosowanie systemu do odpowiedzi na różne pytania immunologiczne. Medawar i współpracownicy ustalili allogeniczny przeszczep skóry ogona u myszy w 1955 roku. Od tego czasu model przeszczepu skóry jest stale modyfikowany i dostosowywany do odpowiedzi na konkretne pytania. Użycie skóry ogona sprawia, że model ten jest łatwy do oceny pod kątem odrzucenia przeszczepu, nie wymaga ani intensywnego przygotowania, ani głębokiego znieczulenia, ma zastosowanie do zwierząt o różnym pochodzeniu genetycznym, zniechęca do martwicy niedokrwiennej i pozwala na interwencję chemiczną i biologiczną.
Ogólnie rzecz biorąc, zarówno limfocyty T CD4+, jak i CD8+ są odpowiedzialne za odrzucenie przeszczepów allogennych, ponieważ rozpoznają niedopasowane główne antygeny zgodności tkankowej z różnych szczepów myszy. Opisano kilka modeli aktywacji allogenicznych limfocytów T u myszy przeszczepionych skórze. Identyfikacja cząsteczek głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) klasy I i II w różnych szczepach myszy, w tym myszy C57BL/6, była ważnym krokiem w kierunku zrozumienia i zbadania alloodpowiedzi za pośrednictwem limfocytów T. W opisanym tutaj modelu przeszczepu ogona i skóry trzypunktowa mutacja (I-Abm12) w rowku prezentującym antygen cząsteczki MHC klasy II (I-A b) jest wystarczająca do wywołania silnej allogenicznej aktywacji limfocytów T CD4 + u myszy C57BL / 6. Przeszczepy skóry od myszyI-A bm12 na myszach C57BL / 6 są odrzucane w ciągu 12-15 dni, podczas gdy przeszczepy syngeniczne są akceptowane do 100 dni. Brak limfocytów T (myszy CD3-/- i Rag2-/-) umożliwia akceptację przeszczepu skóry do 100 dni, co można przezwyciężyć, przenosząc 2 x 104 limfocyty T typu dzikiego lub transgenicznego. Adoptywnie przeniesione limfocyty T proliferują i wytwarzają IFN-γ u myszy Rag2-/-, którym przeszczepiono I-Abm12.
Wprowadzenie
Przeszczepianie organów stałych, takich jak skóra, serce i nerki, jest obecnie standardową procedurą w praktyce medycznej na całym świecie1. Pomyślnie przeszczepione narządy mogą zostać odrzucone przez aktywację układu odpornościowego biorcy, który rozpoznaje główne antygeny zgodności tkankowej dawcy. Dlatego pacjenci po przeszczepie wymagają leczenia lekami immunosupresyjnymi2. Allogeniczny przeszczep skóry u myszy został opracowany przez Medawara i współpracowników w 1955 roku i był pomocny w identyfikacji docelowych cząsteczek opisanych później jako główny kompleks zgodności tkankowej (MHC) klasy I i II. Od tego czasu model przeszczepu skóry jest stale modyfikowany i dostosowywany do badania roli podzbiorów limfocytów T oraz znaczenia interwencji chemicznej i biologicznej w hamowaniu odrzucania przeszczepu2-4. Skóra z ucha i tułowia jest trudniejsza do przygotowania i jest bardziej podatna na niedotlenienie i martwicę niż skóra ogona5; Jednak procedura przeszczepu jest podobna. Ponadto monitorowanie przeszczepów skóry ogona jest łatwe ze względu na charakterystyczną strukturę włosów skóry.
Ten artykuł przedstawia szczegółową procedurę przeszczepu skóry ogona MHC klasy II, która pozwala na badanie różnych aspektów odrzucania i tolerancji przeszczepu allogenicznego za pośrednictwem limfocytów T CD4+ u myszy. Naturalna trzypunktowa mutacja w cząsteczce I-AB MHLC klasy II (ZWANEJ I-ABM12)6-9 jest wystarczająca do wywołania odrzucenia alloprzeszczepów skóry u myszy C57BL / 68. Cząsteczka I-Abm12 aktywuje limfocyty T CD4 + z różnymi łańcuchami receptora komórek αβ-T (TcR) od myszy C57BL / 6, wśród których zidentyfikowano limfocyty T specyficzne dla Vα2Vβ8-TcR w celu wygenerowania myszy transgenicznejTcR10. Adoptywny transfer limfocytów T specyficznych dla Vα2Vβ8-TcR wykorzystano do ustanowienia modelu odrzucenia u myszy C57BL / 6 Rag2-/- z niedoborem odporności, którym przeszczepiono skórę I-Abm12.
Różnice genetyczne między dawcą a biorcą wpływają na wynik akceptacji i odrzucenia przeszczepu. Istnieją różne rodzaje przeszczepów: autoprzeszczepy to przeszczepy od samego biorcy; Synprzeszczepy i alloprzeszczepy to przeszczepy odpowiednio od osób identycznych genetycznie i niespokrewnionych. Akceptacja różnych allogenicznych przeszczepów narządów została wykazana przez interwencję chemiczną i biologiczną u pacjentów i modeli mysich11,3,4. W podstawowym podejściu, myszy C57BL / 6 leczone przeciwciałem anty-CD3 wykazały przedłużone przeżycie skóry ogonaI-A bm12 (dane niepublikowane). Wyczerpanie limfocytów T CD4 + i CD8 + przed przeszczepieniem u myszy biorców skutkowało akceptacją niedopasowanych przeszczepów MHC klasy I i II (wer. w 12). Co ciekawe, odrzucenie przeszczepów skóry zależy od obecności limfocytów T CD4 + (wer. w 12). W tym modelu celowanie w specyficzne interakcje między różnymi komórkami odpornościowymi poprzez blokowanie cząsteczek kostymulujących za pomocą przeciwciał lub supresję za pomocą regulatorowych limfocytów T może indukować tolerancję (dane niepublikowane). Rzeczywiście, zablokowanie zarówno CD40, jak i CD28 prowadziło do długoterminowej tolerancji alloprzeszczepu skóry13,14.
Przeszczep skóry ogona jest łatwy do wykonania i łatwy do monitorowania w porównaniu do przeszczepu innych narządów. Ponadto przeszczepy skóry ogona są łatwe do przygotowania i są mniej podatne na niedokrwienie niż inne tkanki skóry. W przeciwieństwie do środków znieczulających wstrzykiwanych, zastosowanie gazu znieczulającego (izofluoranu) podczas przeszczepu skraca zarówno zabieg, jak i czas rekonwalescencji biorcy. Zwijaniu się przeszczepu skóry ogona, które może prowadzić do niepełnego gojenia się rany i odrzucenia przeszczepu, zapobiega się poprzez zastosowanie kleju tkankowego. Co więcej, model przeszczepu skóry ogonaI-A bm12 aktywuje wyłącznie limfocyty T CD4 + zarówno u myszy immunokompetentnych, jak i z niedoborem odporności (o tym samym tle genetycznym), ułatwiając interpretację wyników.
Ten protokół opisuje niezawodny, powtarzalny i łatwo monitorowany model myszy, który pozwala na interwencję chemiczną i biologiczną. Model jest przeznaczony do badania odrzucenia i indukcji tolerancji przeszczepów skóry ogona.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
W tej publikacji wideo i protokole, wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem na zwierzętach zatwierdzonym przez Urząd Kantonalny Bazylea-Miasto, Szwajcaria. Jeśli to możliwe, wykonuj wszystkie zabiegi w sterylnych warunkach.
1. Przygotowanie do operacji
- Przed użyciem należy złożyć w autoklawie wszystkie narzędzia chirurgiczne i gazę.
- Podgrzej ciepłą podkładkę i ułóż narzędzia chirurgiczne na stole (Tabela materiałów/metod).
- Otwórz bandaże na palcu. Nałóż wazelinę na opaskę na ranę za pomocą bawełnianego wacika (upewnij się, że gaza jest całkowicie zakryta).
- Zważyć myszy i podać środek przeciwbólowy Buprenorfina 0,05 mg/kg masy ciała. Uwaga: zapewni to analgezję natychmiast po przeszczepie.
2. Przygotowanie skóry ogona do przeszczepu
- Poddaj eutanazji myszy dawcy (np. I-Abm12) po uduszeniu CO2 i zdezynfekuj ogony roztworem dezynfekującym przed wycięciem.
- Umieść ogon czarnym paskiem w dół na czystej plastikowej desce i przetnij go wzdłużnie wzdłuż środkowej linii, wykonując powierzchowne nacięcie obejmujące tylko warstwę skóry.
- Oderwij skórę od ogona za pomocą kleszczy chwytających.
- Umieścić skórę ogona w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowych wypełnionym 10 ml HBSS.
3. Zabieg chirurgiczny
- Znieczulenie myszy biorcy (np. C57BL/6) poprzez wdychanie 3% roztworu izofluoranu w przezroczystym pudełku indukcyjnym. Uwaga: Mysz potrzebuje 3-5 minut, aby osiągnąć znieczulenie w płaszczyźnie operacyjnej. Używaj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
- Umieść mysz na ciepłej podkładce i nałóż 1,5% izofluoranu za pomocą maski na usta i oceń każdy zwierzęcy odruch poprzez szczypanie palców.
- Ogolić miejsce grzbietowe myszy biorcy (np. C57BL/6) i usunąć zanieczyszczające włosy za pomocą suchego wacika z gazy.
- Zdezynfekuj ogolone miejsce przeszczepu roztworem aseptycznym.
- Uszczypnij skórę kleszczami w środkowym/prawym miejscu grzbietu i za pomocą zakrzywionych nożyczek wykonaj okrągłe nacięcie o wymiarach około 1 x 0,6 cm.
- Jeśli wystąpi krwawienie, oczyść ranę sterylnym wacikiem.
- Oceń rozmiar nacięcia i wytnij przeszczep o szacowanej wielkości ze skóry ogona za pomocą skalpela.
- Przytnij rogi, aby zaokrąglić przeszczep.
- Załaduj przeszczep na skalpel, osusz nadmiar HBSS na sterylnym waciku i umieść go w łożu przeszczepu myszy biorcy.
- Unikaj nakładania się skóry dawcy i gospodarza i nakładaj klej tkankowy wyłącznie na strefę kontaktu.
- Nałóż plaster bez zagnieceń wokół talii myszy.
- Nałóż samoprzylepny, nieelastyczny bandaż, aby przymocować plaster do myszy (przesunięty o 3 mm).
- Naciąć nożyczkami około 3 mm w górnym brzusznym miejscu bandaża. Uwaga: Ma to na celu uniknięcie przytrzaśnięcia zębów myszy podczas fazy rekonwalescencji.
- Zdejmij znieczulającą maskę ustną i trzymaj przeszczepione myszy na poduszce grzewczej do momentu przebudzenia.
- Przeszczepione myszy należy umieścić w klatkach dopiero po całkowitym wyzdrowieniu i ocenić ich ruchliwość, aby upewnić się, że bandaż nie jest zbyt ciasny.
- Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne 70% etanolem przed przystąpieniem do następnej operacji.
4. Opieka pooperacyjna
- Dodać syrop zawierający paracetamol do wody pitnej (4 mg/ml) i podawać przez 7 dni.
- Przywróć mysz do pokoju ze zwierzętami, gdy już dojdzie do siebie.
- Ściśle monitoruj myszy pod kątem objawów klinicznych, w tym depresji lub innych zmian behawioralnych (jedzenie lub unieruchomienie), nieprawidłowego wyglądu (brak pielęgnacji) lub postawy (pilo-erekcja lub zgarbiona postawa) przez czas założenia bandaża (1 tydzień).
5. Usunięcie bandaża (6-7 dni po przeszczepie)
- Znieczulić myszy poprzez wdychanie 3% roztworu izofluoranu w przezroczystym pudełku indukcyjnym (patrz wyżej).
- Wytnij bandaż i plaster nożyczkami do tętnic i ostrożnie je usuń. Uwaga: unikać rozciągania miejsca przeszczepu.
- Monitorować przeszczepione myszy pod kątem objawów klinicznych (patrz 4.3) i oceny pod kątem odrzucenia przeszczepów skóry (Tabela 1). Uwaga: System oceny przeszczepu wykorzystuje różne tekstury włosów na skórze ogona w porównaniu ze skórą grzbietową. Pojawienie się przeszczepu i jego odrzucenie jest podzielone na 3 stopnie. Allogeniczne przeszczepy skóry (niedopasowane MHC II, np. I-Abm12) myszy immunokompetentnych C57BL/6 są zwykle odrzucane w ciągu 12-15 dni po przeszczepie (dane własne i 15-20).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W pierwszym podejściu myszom C57BL/6 przeszczepiono allografty I-Abm12 oraz syngrafty I-Ab. Po zdjęciu opatrunku przeszczepy wykazały oznaki gojenia rany bez zamknięcia strefy kontaktu u myszy C57BL/6 (Rysunek 1A). Po zdjęciu opatrunku zapalenie pośredniczone przez limfocyty T CD4+ doprowadziło do pojawienia się obszarów martwiczych (czerwone plamy) i odrzucenia allograftów I-Abm12 u myszy C57BL/6 w ciągu 13 dni po transplantacji (Rysunek 1B-C,...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przeszczep skóry jest szeroko stosowaną metodą badania odrzucenia i tolerancji zależnej od limfocytów T. Od czasu opracowania modelu przeszczepu skóry zastosowano kilka adaptacji i zmian. W opisanej procedurze przeszczep I-Abm12 skóry ogona wykonuje się przy użyciu gazu znieczulającego (izofluoranu). Zastosowanie znieczulenia gazowego skraca czas wykonania i rekonwalescencji myszy, co zmniejsza stres u przeszczepionych myszy. Zabieg wykorzystuje klej tkankowy do utrwalenia skóry ogona, która ma tendencję do zw...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty SNF PPOOA-_119204 i PPOOP3_144918 dla S.W.R. Dziękujemy E. Palmerowi i B.T.H. Hausmannowi za myszy i wiedzę techniczną.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Standardowy roztwór | Betadine Mundipharma | ||
| Wacik bawełniany | Carl Roth GmbH | 31025060 | |
| Dafalgan , UPSA | Bristol Myers Squibb UPSA | ||
| Hansaplast paski na palce | Beierdorf AG | REF.76861 | |
| Klej tkankowy Histoacryl | Braun | REF.1050052 | |
| Leukotape classic , 2 cm x 10 m | BSN Medical SAS | REF.02204-00 | |
| - PBS - Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, pH 7,4 | Invitrogen | 10010015 | GIBCO |
| Sterylna gaza, 5 x 5 cm, 8-warstwowa | MaiMed GmbH | 21010 | |
| Kleszczyki wąsko oznaczone | FST | 11003-12 | |
| Nożyczki do cienkiej tęczówki | zakrzywione FST | 14095-11 | |
| Nożyczki do cienkiej tęczówki | FST | 14094-11 | |
| Nożyczki Mayo | FST | 14010-15 | |
| Nożyczki do tętnic końcówka kulowa 11,5 cm | FST | 14080-11 | |
| Kleszczyki do tkanek | FST | 11021-14 | |
| Ostrze chirurgiczne nr 20 | Swann-Morton LTD | 3006 | Stal węglowa |
| Rękojeści ostrzy chirurgicznych | Swann-Morton LTD | ||
| Strzykawka, 1 ml | ARTSANA | Jednorazowy | |
| Temgesic, buprenorfina | ESSEX Chemie AG | 0,3 mg/ml | |
| Naczynia do hodowli tkankowych 10 cm, 60,1 cm2 | TPP | ||
| Wazelina | Vifor SA | ||
| Ciepła | podkładka Solis | Typ 223 |
Bibliografia
- Mahillo, B., Carmona, M., Álvarez, M., White, S., Noel, L., Matesanz, R. Global Data in Organ Donation and Transplantation. transplantation. 92 (10), 1069-1074 (2011).
- Halleck, F., et al. New perspectives of immunosuppression. Transplantation proceedings. 45 (3), 1224-1231 (2013).
- Wood, K. J., Bushell, A., Jones, N. D. Immunologic unresponsiveness to alloantigen in vivo. a role for regulatory T cells. Immunological reviews. 241 (1), 119-132 (2011).
- Sykes, M. Immune tolerance: mechanisms and application in clinical transplantation. Journal of Internal Medicine. 262 (3), 288-310 (2007).
- McFarland, H. I., Rosenberg, A. S. Skin allograft rejection. Current protocols in immunology. , (2009).
- McKenzie, I. F., Morgan, G. M., Sandrin, M. S., Michaelides, M. M., Melvold, R. W., Kohn, H. I. B6.C-H-2bm12. A new H-2 mutation in the I region in the mouse. The Journal of experimental medicine. 150 (6), 1323-1338 (1979).
- McIntyre, K. R., Seidman, J. G. Nucleotide sequence of mutant I-A beta bm12 gene is evidence for genetic exchange between mouse immune response genes. Nature. 308 (5959), 551-553 (1984).
- Stuart, P. M., Beck-Maier, B., Melvold, R. W. Provocation of skin graft rejection across murine class II differences by non--bone-marrow-derived cells. Transplantation. 37 (4), 393-396 (1984).
- Hausmann, B., Palmer, E. Positive selection through a motif in the alphabeta T cell receptor. Science. 281 (5378), 835-838 (1998).
- Bill, J., Ronchese, F., Germain, R. N., Palmer, E. The contribution of mutant amino acids to alloantigenicity. The Journal of experimental medicine. 170 (3), (1989).
- Monaco, A. P. Immunosuppression and tolerance for clinical organ allografts. Current Opinion in Immunology. 1 (6), 1174-1177 (1989).
- Rosenberg, A. S., Singer, A. Cellular basis of skin allograft rejection: an in vivo model of immune-mediated tissue destruction. Annual Review of Immunology. 10, 333-358 (1992).
- Kingsley, C. I., Nadig, S. N., Wood, K. J. Transplantation tolerance: lessons from experimental rodent models. Transplant international : official journal of the European Society for Organ Transplantation. 20 (10), 828-841 (2007).
- Larsen, C. P., et al. Long-term acceptance of skin and cardiac allografts after blocking CD40 and CD28 pathways. Nature. 381 (6581), 434-438 (1996).
- Tomura, M., Nakatani, I., Murachi, M., Tai, X. G., Toyo-oka, K., Fujiwara, H. Suppression of allograft responses induced by interleukin-6, which selectively modulates interferon-gamma but not interleukin-2 production. Transplantation. 64 (5), 757-763 (1997).
- Ring, G. H., et al. Interferon-gamma is necessary for initiating the acute rejection of major histocompatibility complex class II-disparate skin allografts. Transplantation. 67 (10), 1362-1365 (1999).
- Rosenberg, A. S., Finbloom, D. S., Maniero, T. G., Vander Meide, P. H., Singer, A. Specific prolongation of MHC class II disparate skin allografts by in vivo administration of anti-IFN-gamma monoclonal antibody. Journal of immunology. 144 (12), 4648-4650 (1950).
- Goes, N., Sims, T., Urmson, J., Vincent, D., Ramassar, V., Halloran, P. F. Disturbed MHC regulation in the IFN-gamma knockout mouse. Evidence for three states of MHC expression with distinct roles for IFN-gamma. Journal of immunology. 155 (10), 4559-4566 (1995).
- Surquin, M., et al. IL-4 deficiency prevents eosinophilic rejection and uncovers a role for neutrophils in the rejection of MHC class II disparate skin grafts. Transplantation. 80 (10), 1485-1492 (2005).
- Gaylo, A. E., Laux, K. S., Batzel, E. J., Berg, M. E., Field, K. A. Delayed rejection of MHC class II-disparate skin allografts in mice treated with farnesyltransferase inhibitors. Transplant immunology. 20 (3), 163-170 (2009).
- Bose, A., Inoue, Y., Kokko, K. E., Lakkis, F. G. Cutting edge: perforin down-regulates CD4 and CD8 T cell-mediated immune responses to a transplanted organ. Journal of immunology. 170 (4), 1611-1614 (2003).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
