Procedura małej objętości do pomiaru stężenia wirusa z wody

Podsumowanie

Opracowano podejście do identyfikacji optymalnych warunków koncentracji wirusa dla małych objętości próbek wody przy użyciu kolców ludzkiego adenowirusa. Opisane tutaj techniki są wykorzystywane do identyfikacji parametrów stężenia dla innych celów wirusowych i stosowane do eksperymentów z stężeniem wirusa na dużą skalę.

Streszczenie

Małe stężenie wirusów (objętości próbek 1-10 L, tutaj symulowane z wzbogaconymi próbkami wody o pojemności 100 ml) jest skutecznym, opłacalnym sposobem identyfikacji optymalnych parametrów stężenia wirusa. Wirusy mogą być zagęszczane z wody za pomocą filtracji (elektrododatniej, elektroujemnej, waty szklanej lub wykluczenia wielkości), a następnie wtórnego zatężania ekstraktem wołowym w celu uwolnienia wirusów z powierzchni filtra, a na końcu stężenia trzeciorzędowego, co daje 5-30 ml objętościowego koncentratu wirusa. W celu określenia optymalnych procedur zatężania oceniono dwa różne filtry elektrododatnie (filtr szkło/celuloza [1MDS] i filtr nano-tlenek glinu/szkło [NanoCeram]), a także różne techniki zatężania wtórnego; Technika Celite, w której oceniano trzy różne rozmiary cząstek celite (drobną, średnią i dużą), a następnie porównano tę technikę z uznaną metodą flokulacji organicznej. Oceniano również różne dodatki elucyjne pod kątem ich zdolności do zwiększania uwalniania cząstek adenowirusa (AdV) z powierzchni filtrów. Delita drobnocząsteczkowy osiągnął poziomy AdV40 i 41 podobne do uznanej metody flokulacji organicznej, gdy podczas zagęszczania wtórnego dodano kolce wirusa. Filtr szkło/celuloza odzyskał wyższe poziomy zarówno AdV40, jak i 41, w porównaniu z filtrem z nanotlenku glinu/włókna szklanego. Chociaż nie jest to statystycznie istotne, dodanie 0,1% elanowego ekstraktu wołowego z polifosforanu sodu pozwoliło odzyskać o 10% więcej cząstek AdV w porównaniu z niemodyfikowanym ekstraktem wołowym.

Wprowadzenie

Ludzkie wirusy jelitowe są ważnymi czynnikami wywołującymi choroby przenoszone przez wodę ^1-3, ale zazwyczaj występują w niewielkich ilościach w skażonych wodach środowiska, co utrudnia ich wykrycie bez stężenia. Procedury stosowane do koncentracji wirusów zazwyczaj obejmują etap filtracji, po którym następuje elucja filtra i wtórne zagęszczenie eluatu z filtra. Powszechna procedura filtracji opiera się na użyciu naładowanych membran, takich jak filtry elektrododatnie (ostatnio omówione w ^4,5). Filtry te polegają na wychwytywaniu wirusów zawieszonych w wodzie za pomocą oddziaływań elektrostatycznych między powierzchnią filtra (naładowaną dodatnio) a docelowymi cząstkami wirusa (naładowanymi ujemnie). Dwa filtry elektrododatnie, które są dostępne na rynku, opierają się na tej technologii, filtry szkło/celuloza i filtry nano-tlenku glinu/włókna szklanego. Koszty filtrów szkło/celuloza są do 10 razy wyższe niż w przypadku nanotlenku glinu/włókna szklanego, co ogranicza użycie filtrów szkło/celuloza do rutynowego monitorowania wirusów. Ostatnie badania wykazały, że różnice między tymi dwoma filtrami są nominalne w odzyskiwaniu enterowirusów z otaczającej wody ^6,7, co uzasadnia zastosowanie tańszej alternatywy filtra. Badano inne opcje filtrów, takie jak filtry elektroujemne i filtry z watą szklaną, jednak albo wymagają one wstępnego uzdatniania wody źródłowej (filtry elektroujemne), albo nie są dostępne na rynku (filtry z waty szklanej). Rozwój procedur koncentracji wirusa koncentrował się głównie na optymalizacji technik zatężania pierwotnego (filtrów) w celu poprawy odzyskiwania wirusa z wody. Jednak procedury wtórnego zatężania, które zwykle zmniejszają objętość eluantu z 1 l do mililitrów, mogą również mieć znaczący wpływ na powrót do zdrowia wirusa ⁸.

Wtórne stężenie wirusów jelitowych zazwyczaj opiera się na czynniku flokulującym, takim jak niektóre rodzaje ekstraktu z wołowiny (flokulacja organiczna) lub flokulacja odtłuszczonego mleka ^9-12, aby usunąć cząsteczki wirusa z powierzchni filtrów. Ostatnio inna procedura wtórnego zatężania z użyciem ekstraktu z wołowiny w połączeniu z dodatkiem celitu (drobnej cząstki) okazała się obiecująca w odzyskiwaniu adenowirusa, enterowirusa i norowirusa ^8,13,14. Koncentracja celitu działa na podobnych zasadach jak w przypadku metody flokulacji organicznej, ponieważ cząsteczki wirusa przyczepiają się do cząstek (kłaczków lub kelitu) i są z nich uwalniane poprzez zmianę pH roztworu zawiesiny. Porównania między tymi dwiema technikami koncentracji drugorzędowej oceniano w odzyskiwaniu kolczastego adenowirusa (AdV) typu 40 i 41 ⁸. W badaniu tym stwierdzono, że dwie techniki koncentracji drugorzędowej były statystycznie podobne w odzyskiwaniu adenowirusów. Jednak metoda flokulacji organicznej wymaga 30 minut inkubacji przy pH 3,5, podczas gdy technika kelityczna wymaga krótszej inkubacji (10 minut) przy pH 4,0. Flokulacja organiczna wymaga również użycia drogiego sprzętu laboratoryjnego (wirówek) do zbierania cząstek kłaczków podczas zagęszczenia trzeciorzędowego, natomiast technika kelitowa wykorzystuje tylko podstawowy sprzęt laboratoryjny (filtracja próżniowa) do oddzielania cząstek celitu od zawiesiny.

Pewne kombinacje filtrów i technik wtórnej elucji mogą również wpływać na odzyskiwanie wirusa. W jednym z badań stwierdzono, że pewne kombinacje technik koncentracji pierwotnej (filtry elektrododatnie) i wtórnej (flokulacja celitowa lub organiczna) miały znaczący wpływ na powrót do zdrowia adenowirusa ¹³. Wyniki te sugerują, że konieczna jest optymalizacja w celu optymalnego odzyskania docelowego wirusa z danej matrycy wodnej przy użyciu tych technik. Optymalizacja jest czasochłonnym, żmudnym procesem, którego wielu badaczy aktywnie unika, ponieważ oceniane są liczne zmienne (typ/marka filtra, roztwór elucyjny pH, kalituacja/flokulacja organiczna).

Na potrzeby tego badania opracowano procedurę pozwalającą na określenie optymalnych warunków koncentracji wirusa z wody przy użyciu wzbogaconych ludzkich szczepów adenowirusa 40 i 41. Przypuszczalnie, ponieważ każdy typ wirusa wykazuje unikalną morfologię kapsydu i specyficzny ładunek kapsydu, może być konieczne zoptymalizowanie protokołów koncentracji dla każdego celu wirusa w celu osiągnięcia optymalnej odbudowy wirusa. Niniejsze badanie przedstawia podejście do stężenia AdV 40 i 41 poprzez: 1) ocenę odzysku wirusa w wodzie z kranu przy użyciu elektrododatnich dysków filtracyjnych, a następnie 2) ocenę ustalonej metody flokulacji organicznej w porównaniu z techniką celitową jako stężenie wtórne oraz 3) ocenę elucyjnych dla stężenia trzeciorzędowego.

Protokół

1. Przygotowanie szkła i obudów filtrów

1. O ile nie zaznaczono inaczej, sterylizować wszystkie naczynia szklane, obudowy filtrów i roztwory w temperaturze 121 °C przez 15 minut. Aby zapewnić sterylność, przed sterylizacją zakryj wszystkie otwory lub odsłonięte powierzchnie folią aluminiową lub papierem zabezpieczonym taśmą.
2. Zmontować aparat filtracyjny, mocując obudowę filtra (średnica 47 mm) do kolby Erlenmeyera z ramieniem bocznym o pojemności 1 l. Wymagane filtry zbiorcze: Elektrododatnie/elektroujemne filtry tarczowe o średnicy 47 mm.
3. Przygotować 1 l 1,5% ekstraktu wołowego (flokulującego; wytwarzającego cząsteczki kłaczków, gdy pH roztworu jest obniżone do 3,5 lub nieflokulującego; który nie agreguje się przy pH 3,5), z 0,05 M glicyny, rozpuszczając 15 g ekstraktu wołowego w 1 l wody dejonizowanej i dodając 3,75 g glicyny.
   UWAGA: Ekstrakty wołowe nieflokulujące będą wymagały dodania celitu przed trzecim zagęszczeniem.
4. Dodać dodatek elucji polifosforan sodu do ekstraktu wołowego w stężeniu 0,1%.
5. Dodaj 1 M roztwór kwasu solnego, kroplami, do mieszania ekstraktu wołowego, roztwór pH do pożądanego pH. Ekstrakt wołowy w autoklawie przez 15-30 min w temperaturze 121 °C.
6. Odmierz 0,1 g drobnego, średniego lub dużego cellitu (do stosowania tylko z ekstraktem wołowym bez flokulacji).
7. Przygotować podciśnienie/ssanie, podłączając kompatybilne rurki do kolby bocznej Erlenmeyera i do wylotu podciśnienia.

2. Przygotowanie roztworów i zapasów wirusów

1. Przygotować 1 l 1 M HCl.
2. Przygotować 1 l 1 M NaOH.
3. Przygotować 1x roztwór PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,47 mM K₂PO₄ i 4,3 mM NaH₂PO₄).
   1. Dostosuj pH 1x PBS do 9,0 za pomocą 1 M NaOH.
4. Przygotować i rozcieńczyć wirusa podstawowego do 10 4-10⁵ najbardziej prawdopodobnej liczby (MPN) ^ml-1, mieszając 1 ml wirusa podstawowego z 9 ml PBS (pH 7), jak opisano poprzednio ^8,13. Przechowywać w temperaturze -80 °C w 1 ml porcji.
   1. Sterylizuj zapas wirusa za pomocą filtrowania strzykawkowego (wielkość porów 0,22 μm) w celu usunięcia potencjalnych zanieczyszczeń.
5. Odchlorowana woda z kranu
   1. Odmierz 1 l sterylnej wody z kranu za pomocą sterylnego cylindra z podziałką i wlej do 2-litrowej zlewki zawierającej mieszadło magnetyczne.
   2. Dodać 0,7 g tiosiarczanu sodu i mieszać, aż granulki się rozpuszczą. W razie potrzeby dostosuj pH wody z kranu do 7-7,5, używając 1 M roztworu HCl lub 1 M NaOH.
   3. Rozmrozić nakłucie wirusa (1 ml) i dodać całą objętość kolca do 1 l odchlorowanej, sterylnej wody z kranu. Mieszaj przez 10 minut.
   4. Przygotować ślepą próbę metody (odchlorowana woda z kranu bez adenowirusa) przy każdym doświadczeniu i przetwarzać w taki sam sposób, jak w przypadku próbki wzbogaconej.

3. Przygotowanie aparatury filtrującej Millipore

1. Usuń sterylną osłonę z obudowy filtra. Upewnij się, że górna miska obudowy filtra jest prawidłowo dopasowana do dolnego sitka filtra, aby uniknąć wycieku próbki podczas filtracji.
2. Usunąć sterylną pokrywę z 1 l kolby Erlenmeyera. Upewnij się, że korek jednostki filtrującej ściśle przylega do górnego otworu kolby Erlenmeyera, tworząc dobre uszczelnienie.
3. Wyjmij górną miskę jednostki filtrującej z dolnego sitka filtra i umieść elektrododatni dysk filtra o średnicy 47 mm prostopadle na sicie za pomocą sterylnych kleszczyków. Przymocuj miskę obudowy filtra do dolnej osłony i zablokuj na miejscu, przekręcając w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara.

4. Filtracja wody z kranu (stężenie pierwotne)

1. Odmierz 100 ml wody z kranu z dodatkiem wirusa za pomocą sterylnego cylindra z podziałką.
2. Wlej 100 ml wzbogaconej wirusem wody z kranu do obudowy filtra zawierającej plisowany filtr szklano-celulozowy o średnicy 47 mm lub filtr tarczowy z nanotlenku glinu/włókna szklanego.
3. Pozwól, aby woda powoli przepływała przez filtr. Zastosuj delikatne odkurzenie, aby usunąć pozostałe pozostałości wody z kranu z powierzchni filtra.
4. W przypadku stosowania trypsyny dodaj 5 ml 0,25% trypsyny do powierzchni filtrującej i inkubuj przez 5 minut.
5. Umyj trypsynę z powierzchni filtra za pomocą 50 ml sterylnej wody dejonizowanej.

5. Usuwanie wirusa z filtra

1. Wyjąć obudowę filtra z 2-litrowej kolby Erlenmeyera i umieścić ją w kolbie bocznej o pojemności 250 ml.
2. Odmierz 100 ml ekstraktu wołowego za pomocą cylindra miarowego. Powoli wlej 100 ml ekstraktu wołowego do obudowy filtra.
3. Pozwolić, aby ekstrakt wołowy przelał się przez filtr, wychwytując ekstrakt wołowy w małej (250 ml) kolbie Erlenmeyera. Zastosuj próżnię, aby przeciągnąć resztki ekstraktu wołowego z filtra.

6. Drugorzędna koncentracja celitu

1. Przenieść kolby zawierające wymyte wirusy na płytkę mieszającą. Dodaj sterylny magnetyczny pręt mieszający i umieść na talerzu mieszającym, mieszając, aby uzyskać lekki wir.
2. Dodać 0,1 g proszku celite do 100 ml ekstraktu z wołowiny i pozostawić celite do rozproszenia. Umieść sterylną sondę pH w ekstrakcie wołowym.
3. Dodaj kroplami 1 M HCl do ekstraktu wołowego, aby osiągnąć pH 4,0. Pozostaw do powolnego mieszania przez 10 minut.
4. Umieścić filtr wstępny o średnicy 47 mm na obudowie filtra (jak opisano powyżej) za pomocą kolby Erlenmeyera o pojemności 2 l.
5. Wlej 100 ml mieszanki ekstraktu wołowego i celitu przez filtr wstępny. Pozwól, aby ekstrakt wołowy się przelał. Zastosuj lekkie podciśnienie, aby przeciągnąć resztki ekstraktu wołowego z filtra.
6. Umieść metalowy zacisk rurki na końcu wylewki obudowy filtra. Przymocuj sterylną probówkę do zbierania polipropylenu o pojemności 15 ml do metalowego klipsa do probówki. Umieścić obudowę filtra z powrotem w kolbie Erlenmeyera.
7. Dodać 5 ml 1x buforu PBS o pH 9,0 nad kelitem zebranym na filtrze wstępnym.
8. Poczekaj, aż PBS przepłynie przez filtr wstępny. Zastosuj lekkie podciśnienie, aby przeciągnąć resztki PBS do 15 ml probówki zbiorczej.

7. Wtórne stężenie flokulacji organicznej

1. Przenieść zlewki zawierające wymytego wirusa na płytkę mieszającą. Dodaj sterylne mieszadło magnetyczne do 100 ml ekstraktu wołowego i wymieszaj, aby uzyskać lekki wir.
2. Umieść sterylną sondę pH w ekstrakcie wołowym.
3. Dodaj kroplami 1 M HCl do ekstraktu wołowego i dostosuj pH do 3,5. Mieszaj przez 30 min.
4. Wlać eluat do stożkowych probówek wirówek o pojemności 250 ml i odwirować przy 2 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
5. Odlewać supernatant uważając, aby nie uszkodzić osadu. Zawiesić osad w 5 ml 1x PBS, pH 9.
6. Odwirować zawiesinę o sile 4 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odlać supernatant i wyrzucić osad.
7. Ustawić pH na 7-7,5, przefiltrować, wysterylizować przez filtr strzykawkowy 0,22 μm i zamrozić w temperaturze -80 °C.

8. Ekstrakcja wirusowych kwasów nukleinowych

1. Ekstrahuj wirusowe kwasy nukleinowe za pomocą odpowiedniego zestawu handlowego zgodnie z instrukcjami producenta.

9. AdV 40/41 qPCR

1. Stosować startery i sondy, a także profile mieszania reakcyjnego i cykli termicznych, jak opublikowano ^8,13.
   UWAGA: Szacowana granica wykrywalności dla testu wynosi około 5 jednostek qPCR na reakcję.
2. Dodać składniki mieszanin amplifikacyjnych PCR w stężeniach w następujący sposób: 10 mM Tris (pH 8,3), 50 mM KCl, 4,5 mM MgCl₂, 10 mM dNTPs, 10 μM starterów i 1 μM sondy oraz 0,5 μl polimerazy, tak aby końcowe objętości 45 μl można było dodać do odpowiedniej liczby dołków w 96-dołkowej płytce reakcyjnej PCR.
3. Załadować 45 μl mieszaniny amplifikacyjnej PCR do każdego odpowiedniego dołka 96-dołkowej płytki do szybkiej reakcji PCR.
4. Dodać 5 μl wyekstrahowanej próbki DNA do odpowiednich dołków płytki PCR.
5. Przykryj płytkę z żaroodporną uszczelką pokrywy, obróć płytkę, aby przesunąć wszelkie kropelki na dno dołków płytki PCR.
6. Ustaw cykle amplifikacji PCR w następujący sposób: 95 °C przez 10 minut, a następnie 40 cykli po 95 °C przez 15 sekund i 60 °C przez 1 minutę.

10. Analizy danych

1. Przeanalizować trzykrotne pomiary seryjnych 5-krotnych rozcieńczeń próbek w zakresie rozcieńczeń od 1:5 do 1:625 w celu określenia najbardziej prawdopodobnej liczby (MPN) cząstek wirusa, jak opisano wcześniej ^8,13.
2. Analizuj seryjne 5-krotne rozcieńczenia eksperymentalnych kolców adenowirusa w zakresie rozcieńczeń od 1:5 do 1:15,625 w celu określenia najbardziej prawdopodobnej liczby (MPN) cząstek wirusa.
3. Korzystając z kalkulatora EPA MPN (http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html), dostosuj kalkulator tak, aby uwzględniał rodzaj rozcieńczenia (1:5 lub 1:10), liczbę przeprowadzonych rozcieńczeń oraz liczbę powtórzonych próbek w serii rozcieńczeń.
4. Wykonaj transformację danych w logarytmie₁₀, a następnie znormalizuj do jednostki objętości (np. 1 ml, 100 ml itd.). Oblicz odzysk dla danego eksperymentu, dzieląc liczbę cząstek wirusa obecnych w koncentratach próbek przez liczbę cząstek wirusa obecnych w skokach doświadczalnych.
5. Oceń wpływ różnych zmiennych eksperymentalnych (np. różne typy kalorii, zakresy pH, różne typy filtrów i różne techniki stężeń wtórnych) na odzysk AdV, wykonując parametryczne lub nieparametryczne testy statystyczne (np. sparowany test t, jedno- lub dwuczynnikowa ANOVA) w zależności od rozkładu danych i projektu eksperymentalnego.

Wyniki

Wybór Celite

Przed wyborem najlepiej działającego wariantu przetestowano trzy różne rodzaje celitu. Celity o drobnych i średnich cząstkach pozwoliły uzyskać najwyższy odzysk adenowirusów. Zastosowanie celitów o większych cząstkach skutkowało niższym odzyskiem zarówno dla AdV40, jak i 41 (zakres 32%-100%) (Rycina 1). Średnie odzyski adenowirusa 40 wynosiły 144% ± 52% (drobne), 115% ± 28% (średnie) i 82% ± 53% (duże) cząstki celitu, a dla AdV41 odpowiednio 132% ± 39% (drobne), 8...

Dyskusja

Filtry elektrododatnie są przydatne w zagęszczaniu wirusów z wody; Filtry te mogą jednak różnić się strukturą i składem, co z kolei może zmienić ich skuteczność. Problem ten potęguje fakt, że struktury i ładunki kapsydu różnią się w zależności od szczepu wirusa, co wymaga dostosowania technik koncentracji w celu zapewnienia optymalnego powrotu ^{do zdrowia 15}. Dzięki prostym modyfikacjom istniejących technik zagęszczania (np. filtry elektrododatnie, elucja ekstraktu wołowego) można osiągnąć bardziej efe...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Adenowirus 40 zapas	ATCC	VR-931
Adenowirus 41 zapas	ATCC	VR-930
Tiosiarczan sodu	Fluka Chemical Co.	72051
Celites #577	Fluka Chemical Co.	22142
NanoCeram 47 mm	Argonide	N/A
1MDS 47 mm	3M	6408502
Filtr wstępny AP-20 47 mm	Millipore Corp.
Glicyna	Sigma	50046-1KG
Polifosforan sodu	Acros Organics	390930010
Trypsyna	Gibco	25200
PBS	Sigma	P5368
Kwas solny	Fisher	A481-212
BBL Ekstrakt z wołowiny	BD Biosciences	212303
Ekstrakt z wołowiny Difco	BD Biosciences	211520
ABI 7900 System PCR w czasie rzeczywistym	ABI	N/A
Obudowa filtra ze stali nierdzewnej	Millipore Corp.
Zestaw do ekstrakcji DNA krwi	Qiagen	51104
		MPN EPA	http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html

AP2004700XX2004720Kalkulator