Artykuł metodologiczny

Analizator komórek oparty na impedancji w czasie rzeczywistym jako narzędzie do wyznaczania szlaków molekularnych zaangażowanych w neurotoksyczność i neuroprotekcję w linii komórek neuronalnych

DOI:

10.3791/51748

⸱

9 sierpnia 2014

 ,  , 
1University Clinics for Child and Adolescent Psychiatry, University of Zürich

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ulepszone testy neurotoksyczności in vitro pomogłyby w identyfikacji nowych związków neuroprotekcyjnych. Przedstawiono przydatność analizatora komórkowego opartego na impedancji w czasie rzeczywistym do określania cytotoksyczności i cytoprotekcji w liniach komórek neuronalnych oraz do wyznaczania udziału szlaków drugiego przekaźnika, uzyskując w ten sposób wgląd w mechanizm neuroprotekcji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele zaburzeń związanych z mózgiem ma w swojej patofizjologii udział w śmierci komórek neuronalnych. Ulepszone modele in vitro do badania neuroprotekcyjnego lub neurotoksycznego działania leków i związanych z nimi szlaków pomogłyby w uzyskaniu wglądu w molekularne mechanizmy neuroprotekcji/neurotoksyczności i mogłyby potencjalnie ułatwić opracowywanie leków. Jednak wiele istniejących testów toksyczności in vitro ma poważne ograniczenia – większość z nich ocenia neurotoksyczność i neuroprotekcję w jednym punkcie czasowym, nie pozwalając na obserwację przebiegu w czasie i kinetyki efektu. Ponadto ogromne znaczenie miałaby możliwość gromadzenia w czasie rzeczywistym informacji na temat dalszych szlaków sygnałowych zaangażowanych w neuroprotekcję. W obecnym protokole opisujemy zastosowanie analizatora komórkowego opartego na impedancji w czasie rzeczywistym do określenia neuroprotekcyjnego działania agonistów receptora serotoniny 2A (5-HT2A) w linii komórek neuronalnych w warunkach bezznacznikowych i w czasie rzeczywistym przy użyciu pomiarów impedancji. Ponadto wykazaliśmy, że inhibitory szlaków drugiego przekaźnika mogą być wykorzystywane do wyznaczania cząsteczek biorących udział w działaniu neuroprotrotekcy. Opisujemy również przydatność tej techniki do określenia, czy wpływ na proliferację komórek przyczynia się do obserwowanego efektu neuroprotekcyjnego. System wykorzystuje specjalne płytki mikroelektroniczne zwane E-Plates, które zawierają naprzemienne złote układy mikroelektrod na dolnej powierzchni studni, służąc jako czujniki ogniw. Odczyt impedancji jest modyfikowany przez liczbę przylegających komórek, żywotność komórek, morfologię i adhezję. Bezwymiarowy parametr o nazwie Cell Index pochodzi z pomiarów impedancji elektrycznej i służy do reprezentowania stanu ogniwa. Ogólnie rzecz biorąc, analizator komórek oparty na impedancji w czasie rzeczywistym pozwala na bezznacznikową ocenę neuroprotekcji i neurotoksyczności w czasie rzeczywistym oraz ocenę zaangażowania szlaków drugiego przekaźnika, przyczyniając się do bardziej szczegółowej i wysokoprzepustowej oceny potencjalnych związków neuroprotekcyjnych in vitro w celu wyboru kandydatów terapeutycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Śmierć komórek nerwowych odgrywa kluczową rolę w patofizjologii wielu zaburzeń związanych z mózgiem1. Dostępność wiarygodnych i wysokoprzepustowych testów toksyczności in vitro ma kluczowe znaczenie dla uzyskania lepszego wglądu w mechanizmy neurotoksyczności i pomocy w wyborze cząsteczek neuroprotekcyjnych jako kandydatów terapeutycznych w procesie opracowywania leków2. Istnieje jednak wiele ograniczeń w stosunku do najczęściej stosowanych testów neurotoksyczności in vitro. Oceniają neurotoksyczność/neuroprotekcję w jednym punkcie czasowym, który nie pozwala na rozwiązanie kinetyczne; Często stosuje się znacznik lub sondę, które mogą zakłócać szlaki sygnałowe i ograniczać dodatkowe badania w tej samej populacji komórek, a także często są pracochłonne, a w wielu przypadkach nie zapewniają wglądu mechanistycznego. W niniejszym badaniu pokazujemy przydatność analizatora komórkowego opartego na impedancji w czasie rzeczywistym do określania neurotoksyczności i neuroprotekcji w linii komórek neuronalnych w czasie rzeczywistym i w warunkach wolnych od znaczników oraz do zapewnienia wglądu w dalsze mechanizmy poprzez analizę szlaków drugiego przekaźnika zaangażowanych w efekt.

Poprzednie badania potwierdziły trafność analizatora komórek w czasie rzeczywistym do określenia cytotoksyczności, jak również wpływu na proliferację komórek w liniach komórkowych w porównaniu ze standardowymi technikami3,4,5,6. Na przykład zaobserwowano dobrą korelację między odczytami standardowego testu żywotności komórek WST-1 a wartościami indeksu komórkowego w kilku punktach czasowych w warunkach podstawowej proliferacji i po dwóch różnych paradygmatach toksyczności w komórkach HeLa3. W komórkach A549 i MDA-MB-231 proliferacja i cytotoksyczność wywołane stabilizatorem mikrotubul paklitakselem wykazywały bardzo podobne wartości w ocenie za pomocą pomiarów wskaźnika komórkowego i standardowo stosowanego testu sulforodaminy B (SRB)4. W linii komórek neuronalnych unieśmiertelnionych neuronów hipokampa pomiary wskaźnika komórkowego HT-22 zostały zweryfikowane pod kątem ich zdolności do wykrywania proliferacji komórek, cytotoksyczności glutaminianu i cytoprotekcji przed szeroko stosowanym testem bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)2,5-difenylotetrazoliu (MTT)5. W tym samym badaniu wyniki testu MTT i pomiary indeksu komórkowego również dobrze korelowały w pomiarze proliferacji neuronalnych komórek progenitorowych, cytotoksyczności po deprywacji czynników wzrostu i ratowaniu cytotoksyczności przez inhibitor pankaspazy QVD5. Cytotoksyczność indukowana w komórkach NIH 3T3 przez wandetanib (receptor czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego i inhibitor receptora naskórkowego czynnika wzrostu) wykazała podobne wyniki mierzone za pomocą wartości indeksu komórkowego lub testu wychwytu czerwieni obojętnej6.

Ostatnio korzystaliśmy z systemu analizatora komórek w czasie rzeczywistym do oceny neuroprotekcyjnych efektów agonisty receptora serotoninowego 2A (5-HT2A) (±)-2,5-dimetoksy-4-jodoamfetaminy (DOI) w linii komórek neuronalnych (komórki SK-N-SH) i przeprowadziliśmy badania przesiewowe pod kątem udziału szlaków drugiego przekaźnika poprzez monitorowanie wpływu ich chemicznego hamowania na obserwowaną neuroprotekcję7. Co ciekawe, receptor 5-HT2A ma zarówno halucynogennych, jak i niehalucynogennych agonistów (takich jak odpowiednio DOI i lisuride), które mogą aktywować zarówno wspólne, jak i odrębne szlaki drugiego przekaźnika.

Zaletą prezentowanej techniki jest to, że pozwala ona na zbieranie w czasie rzeczywistym informacji o przeżywalności komórek w ciągu kilku dni, na wytyczanie zaangażowanych ścieżek drugiego przekaźnika, na ocenę możliwego wpływu efektów proliferacji na neuroprotekcję, oraz na wybór optymalnego czasu dla dodatkowych badań punktu końcowego na tej samej populacji komórek. Schemat ideowy przepływu pracy w bieżącym protokole przedstawiono na rysunku 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie

  1. Umieścić stację analizatora komórek w czasie rzeczywistym w inkubatorze do hodowli tkankowych ustawionym na temperaturę 37 °C i 5% CO2 . Wszystkie czynności związane z hodowlami komórkowymi i zabiegi farmakologiczne należy przeprowadzać w kapturze do hodowli tkankowych w sterylnych warunkach.
  2. UWAGA: Linie komórek neuronalnych wymagające innych ustawień temperatury w porównaniu ze standardowymi warunkami hodowli powinny być odpowiednio dostosowane. W przypadku słabo przylegających linii komórkowych należy użyć środków powlekających, aby ułatwić interakcję komórek ze złotymi mikroelektrodami na dnie studzienek E-Plate 96.
  3. Przygotować 1000-krotne roztwory podstawowe związków farmakologicznych do leczenia hodowli komórkowych (środki neuroprotekcyjne lub inhibitory szlaków drugiego przekaźnika w odpowiednim rozpuszczalniku – dimetylosulfotlenku lub sterylnej wodzie) i przechowywać je w temperaturze -20 °C. Rozpuszczalnik należy stosować jako nośnik w kolejnych zabiegach.
  4. Hodowla ludzkich komórek nerwiaka zarodkowego SK-N-SH w pożywce DMEM/F12 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) (pożywką proliferacyjną) w kolbach do hodowli komórkowych o powierzchni 175cm2 do gęstości około 75%. Utrzymuj liczbę pasaży komórkowych w zakresie (około 10 pasaży), aby zapewnić spójność między eksperymentami pod względem szybkości proliferacji komórek i odpowiedzi na cytotoksyczność. Preferowane są niższe numery przejścia.
  5. Przemyć przylegającą warstwę komórek SK-N-SH PBS i trypsynizować 0,05% roztworem trypsyny-EDTA przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Odwirować komórki przy 170 × g przez 5 minut w celu usunięcia trypsyny. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki proliferacyjnej. Policz komórki za pomocą licznika komórek Scepter i dostosuj liczbę komórek do 300 000 komórek/ml, rozcieńczając komórki pożywką proliferacyjną.

2. Posiewanie i proliferacja komórek SK-N-SH

  1. Dodać 100 μl pożywki proliferacyjnej do każdego dołka E-Plate 96 i pozostawić na 30 minut w okapie do hodowli tkankowych w temperaturze pokojowej w celu zrównoważenia. Umieścić E-Plate 96 w stacji analizatora komórek w czasie rzeczywistym w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.
  2. Uruchom oprogramowanie do analizy komórek w czasie rzeczywistym. Na stronie Układ wybierz studzienki wchodzące w skład eksperymentu i wprowadź w polach edycji informacje o typie komórki, numerze komórki, nazwach i stężeniach związków chemicznych użytych do leczenia komórek.
    UWAGA: Do celów niniejszego protokołu zaleca się co najmniej 4 powtórzenia dla każdego zabiegu.
  3. Na stronie oprogramowania Schedule (Harmonogram) określ "Kroki" zawarte w eksperymencie, wybierając liczbę przebiegów mierzących indeks komórek i interwał między przebiegami dla każdego kroku. Ponieważ krok 1 jest z góry określony dla pomiaru tła, wybierz "Dodaj krok" i ustaw krok 2, aby mierzyć indeks komórki co 15 minut przez 96 godzin.
    UWAGA: W przypadku zabiegów, w których spodziewane są efekty z szybką kinetyką, należy ustawić przemiatanie w krótszych odstępach czasu.
  4. Kliknij przycisk Start, aby zainicjować automatycznie określony Krok 1 i zmierzyć impedancję tła nośnika. Wartość ta jest automatycznie odejmowana przez oprogramowanie w każdym punkcie danych po dodaniu komórek do studzienek.
  5. Użyć przygotowanej wcześniej w kroku 1.5) zawiesiny komórkowej 300 000 komórek/ml w pożywce proliferacyjnej. 30 000 komórek / studzienkę do badań toksyczności komórkowej / neuroprotekcji i 15 000 komórek / studnię do badań proliferacji komórek. Wyjąć E-Plate i dodać 100 μl zawiesiny komórek na studzienkę do badań toksyczności komórek/neuroprotekcji oraz dodać 50 μl zawiesiny komórek i 50 μl pożywki proliferacyjnej na studzienkę do badań proliferacji komórek. Liczba komórek posianych w studzience musi być empirycznie zoptymalizowana dla każdej linii komórkowej.
  6. Delikatnie zakręć płytką E-Plate 96, aby równomiernie pokryć ogniwa. Pozostaw E-Plate 96 na 30 minut w okapie do hodowli tkankowej w temperaturze pokojowej, aby komórki mogły równomiernie osiąść na dnie studzienek.
  7. Włóż E-Plate 96 do stacji analizatora komórek w czasie rzeczywistym i rozpocznij krok 2 na stronie Harmonogram. Monitoruj wartości indeksu komórek przez cały czas trwania eksperymentu, wyświetlając krzywe komórek na stronie Wykres oraz nieprzetworzone dane indeksu komórek na stronie Indeks komórek w oprogramowaniu.

3. Deprywacja surowicy

  1. 24 godziny po posianiu komórek przerwij eksperyment i wyjmij E-Plate 96 ze stacji analizatora komórek w czasie rzeczywistym. Rozcieńczyć inhibitory drugiego przekaźnika z zapasów 1,000X pożywką bez surowicy DMEM/F12 – do 200× końcowego stężenia. Na 30 minut przed rozpoczęciem cytotoksyczności należy potraktować komórki 1 μl inhibitorami drugiego szlaku przekaźnikowego, które mają być badane pod kątem ich udziału w neurotoksyczności/neuroprotekcji, w celu zahamowania odpowiednich szlaków. Zwróć E-Plate 96 do stacji i wznów eksperymentalne pomiary wskaźnika komórki.
  2. Po 30 minutach ponownie przerwij eksperyment. Ostrożnie całkowicie usunąć pożywkę proliferacyjną z dołków E-Plate 96 za pomocą pipety (lub pipety wielokanałowej), uważając, aby nie naruszyć przylegającej warstwy komórek, kierując krawędź końcówki pipety do rogu studzienki. Dodać 200 μl/studzienkę pożywki DMEM/F12 bez surowicy (pożywka deprywująca surowicę). Zapewnij szybką wymianę pożywki do hodowli komórkowych, aby zminimalizować mechaniczne poruszenie komórek.
  3. Rozcieńczyć związki, które mają być testowane pod kątem ich działania neuroprotekcyjnego, od 1,000X stock z bezsurowicowym podłożem DMEM/F12 do 200× końcowego stężenia. Dodać 1 μl związków do zbadania pod kątem ich działania neuroprotekcyjnego i 1 μl inhibitorów szlaków drugiego przekaźnika w poszczególnych studzienkach zgodnie z planem eksperymentalnym.
  4. W komórkach do badań proliferacji nie należy zmieniać podłoża. Rozcieńczone związki, które mają być badane od 1,000X do 200× końcowego stężenia w pożywce proliferacyjnej, traktować 1 μl na studzienkę i kontynuować hodowlę w pożywce proliferacyjnej.
  5. Wznów eksperyment, aby kontynuować pomiary indeksu komórek co 15 minut przez 96 godzin, jak wcześniej ustawiono.

4. Analiza danych

  1. W przypadku danych dotyczących neurotoksyczności/neuroprotekcji należy znormalizować indeks komórkowy do ostatniego punktu czasowego przed leczeniem farmakologicznym lub zmianą pożywki, aby zmniejszyć różnice między eksperymentami, wybierając "znormalizowany indeks komórkowy" i "normalizuj czas" na stronie wykresu.
  2. Zaznacz dołki na stronie Wykres dla interesujących warunków eksperymentalnych i kliknij "Dodaj", aby wykreślić znormalizowane krzywe indeksu komórki. Obserwuj kinetykę działania neurotoksycznego/neuroprotekcyjnego lub hamowania drugich przekaźników jako znormalizowane krzywe indeksu komórkowego w funkcji czasu.
  3. Należy obserwować krzywe indeksu komórkowego dla badanych terapii lekowych w pożywce proliferacyjnej w funkcji czasu, aby ocenić, czy wpływ na proliferację jest zaangażowany w działanie neuroprotekcyjne/neurotoksyczne.
  4. Wyeksportuj informacje eksperymentalne dla wszystkich punktów czasowych indeksu komórkowego ze strony oprogramowania do indeksu komórek do pliku Excel, aby rozpocząć ocenę statystyczną wyników
    UWAGA: Jako pierwszy krok w analizie statystycznej zestaw zmodyfikowanych programów MATLAB, które używają testu t Welcha, z wartością p wykreśloną półlogarytmicznie, wykorzystują odwróconą oś w stosunku do skali czasu (dostarczone jako dodatkowe pliki kodu). Programy te umożliwiają wykrywanie wartości p w czasie całego eksperymentu z analizatorem komórek w czasie rzeczywistym, a tym samym pomagają w wyborze punktów czasowych do bardziej szczegółowej analizy statystycznej. Zapoznaj się z materiałami uzupełniającymi, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat programów.
  5. W celu analizy statystycznej różnic w wartościach indeksu komórkowego w różnych warunkach leczenia w określonych punktach czasowych, wybierz wartości indeksu komórki w odpowiednich punktach czasowych z wyeksportowanego pliku Excel. Przeanalizuj wartości indeksu komórki dla wybranych punktów czasowych za pomocą jedno- lub dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie wykonaj test post-hoc przy użyciu oprogramowania statystycznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deprywacja surowicy prowadzi do spadku wartości indeksu komórkowego, który może być stale monitorowany za pomocą analizatora komórek w czasie rzeczywistym

Neurotoksyczne bodźce do komórek prowadzą do spadku wartości Indeksu Komórkowego, który może być monitorowany w czasie rzeczywistym za pomocą przedstawionej techniki, a którego dynamika zależy od konkretnego bodźca neurotoksycznego i badanego typu komórki. Rycina 2 pokazuje wzrost wskaźnika komórkowego, gdy ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół przedstawia użyteczność analizatora komórek w czasie rzeczywistym do ciągłej i bezznacznikowej oceny neuroprotekcyjnego/neurotoksycznego działania związków w liniach komórek neuronalnych oraz do uzyskania wglądu w szlaki drugiego przekaźnika zaangażowane w efekt.

Mimo że narzędzie analizatora komórek w czasie rzeczywistym do badania cytotoksyczności i wpływu leków na proliferację komórek jest ogólnie uznawane, tylko w kilku badaniach zastosowano go w typach komórek związanych z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Koszty publikacji obecnego artykułu wideo zostały sfinansowane przez "ACEA Biosciences".

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wsparcie finansowe dla eksperymentów przedstawionych w badaniu zostało zapewnione przez program Marie Heim-Vögtlin Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki.

Dziękujemy Pani Johannie Nyffeler za opracowanie zestawu zmodyfikowanych programów MATLAB do badań przesiewowych pod kątem statystycznie istotnych różnic w danych z analizatora komórek w czasie rzeczywistym oraz dr Yama Abassi za pomocną dyskusję.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
xCELLigence  Pakiet systemu RTCA SPACEA Biosciencesnr: 00380601030Składa się z analizatora RTCA, stacji RTCA SP i jednostki sterującej RTCA
E-plate 96ACEA BiosciencesNr: 05232368001Do hodowli komórek, wstawione do stacji RTCA
SK-N-SH komórki ATCC(we współpracy z LGC Standards)HTB-11Może być zastąpiony przez inną adherentną linię komórek neuronalnych DMEM
/F12 Sigma-AldrichD8437Pożywka do hodowli komórkowych
Surowica bydlęcaLife Technologies16140-063Suplementy proliferacji, ale nie pożywka do deprywacji surowicy
Kolba do hodowli tkanek T175Sarstedt83.1812.302Do hodowli komórek, które zostaną później posiane na E-Plate 96
0,05% Trypsyna-EDTALife Technologies25300-054Do trypsynizacji komórek hodowanych w kolbach do hodowli tkankowych
Licznik komórek Scepter 2.0Merck MilliporePHCC20060Automatyczny licznik komórek
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiLife Technologies10010-015Do mycia komórek
(±)-DOI chlorowodorekSigma-AldrichD101Agonista 5-HT2A do leczenia hodowli komórkowych
Chlorowodorek LY-294002Inhibitor Sigma-AldrichL9908PI3-K do leczenia hodowlami komórkowymi 
Maleinian lizuryduTocris Bioscience4052Związek o agonistycznej aktywności 5-HT2A do leczenia hodowli komórkowych
DimetylosulfotlenekSigma-AldrichD4540Do rozpuszczania LY-294002 i maleinianu lizurydu
SP płodu

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cavallucci, V., D'Amelio, M. Matter of life and death: the pharmacological approaches targeting apoptosis in brain diseases. Curr. Pharm. Des. 17 (3), 215-229 (2011).
  2. Bull, S. HPA CHaPD 001: Review of Environmental Chemicals and Neurotoxicity. Focus on Neurological Diseases. , Health Protection Agency. (2007).
  3. Ke, N., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. The xCELLigence system for real-time and label-free monitoring of cell viability. Methods Mol. Biol. 740, 33-43 (2011).
  4. Limame, R., et al. Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays. PLoS One. 7 (10), e46536(2012).
  5. Diemert, S., et al. Impedance measurement for real-time detection of neuronal cell death. J. Neurosci. Methods. 203 (1), 69-77 (2012).
  6. Kustermann, S., et al. A label-free, impedance-based real time assay to identify drug-induced toxicities and differentiate cytostatic from cytotoxic effects. Toxicol In Vitro. 27 (5), 1589-1595 (2013).
  7. Marinova, Z., Walitza, S., Grünblatt, E. 5-HT2A serotonin receptor agonist DOI alleviates cytotoxicity in neuroblastoma cells: role of the ERK pathway. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 44, 64-72 (2013).
  8. González-Maeso, J., et al. Hallucinogens recruit specific cortical 5-HT(2A) receptor-mediated signaling pathways to affect behavior. Neuron. 53 (3), 439-452 (2007).
  9. Tsuchioka, M., Takebayashi, M., Hisaoka, K., Maeda, N., Nakata, Y. Serotonin (5-HT) induces glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) mRNA expression via the transactivation of fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2) in rat C6 glioma cells. J. Neurochem. 106 (1), 244-257 (2008).
  10. Galante, D., et al. Differential toxicity, conformation and morphology of typical initial aggregation states of Aβ1-42 and Aβpy3-42 beta-amyloids. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 44 (11), 2085-2093 (2012).
  11. Sheline, C. T., Cai, A. L., Zhu, J., Shi, C. Serum or target deprivation-induced neuronal death causes oxidative neuronal accumulation of Zn2+and loss of NAD. Eur. J. Neurosci. 32, 894-904 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza impedancji w czasie rzeczywistymszlaki wt rych przeka nik wocena neuroprotekcjipomiar indeksu kom rkowegotechnologia E Platemonitorowanie bez u ycia znacznik wreceptor serotoninowy 2Awk ad w proliferacjanaliza statystyczna

Powiązane artykuły