Przewodnik po jednojednostkowym zapisie in vivo z optogenetycznie zidentyfikowanych korowych interneuronów hamujących

Podsumowanie

Tutaj opisujemy naszą strategię uzyskiwania stabilnych, dobrze izolowanych pojedynczych nagrań jednostkowych ze zidentyfikowanych interneuronów hamujących w znieczulonej korze myszy. Neurony wyrażające ChR2 są identyfikowane na podstawie ich reakcji na niebieskie światło. Metoda wykorzystuje standardowy zewnątrzkomórkowy sprzęt rejestrujący i służy jako niedroga alternatywa dla obrazowania wapnia lub wizualnie sterowanego łatania.

Streszczenie

Głównym wyzwaniem w neurofizjologii było scharakteryzowanie właściwości odpowiedzi i funkcji licznych typów komórek hamujących w korze mózgowej. Dzielimy się tutaj naszą strategią uzyskiwania stabilnych, dobrze izolowanych zapisów pojedynczych jednostek ze zidentyfikowanych interneuronów hamujących w znieczulonej korze myszy przy użyciu metody opracowanej przez Limę i współpracowników¹. Zapisy wykonuje się u myszy z ekspresją rodopsyny kanałowej-2 (ChR2) w określonych subpopulacjach neuronów. Członkowie populacji są identyfikowani na podstawie ich reakcji na krótki błysk niebieskiego światła. Technika ta – określana jako "PINP", czyli Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Population – może być realizowana za pomocą standardowego sprzętu do rejestracji zewnątrzkomórkowej. Może służyć jako niedroga i dostępna alternatywa dla obrazowania wapnia lub wizualnie sterowanego łatania, w celu ukierunkowania nagrań zewnątrzkomórkowych na komórki zidentyfikowane genetycznie. Poniżej przedstawiamy zestaw wskazówek dotyczących optymalizacji metody w codziennej praktyce. Udoskonaliliśmy naszą strategię specjalnie do celowania w komórki parwalbuminowo-dodatnie (PV+), ale odkryliśmy, że działa ona również w przypadku innych typów interneuronów, takich jak interneurony z ekspresją somatostatyny (SOM+) i kalretyniny (CR+).

Wprowadzenie

Scharakteryzowanie niezliczonych typów komórek, które składają się na mózg ssaków, było głównym, ale długo nieuchwytnym celem neurofizjologii. Na przykład właściwości i funkcje różnych typów komórek hamujących w korze mózgowej są tematami budzącymi duże zainteresowanie, ale nadal są stosunkowo nieznane. Dzieje się tak częściowo dlatego, że konwencjonalne techniki ślepego zapisu in vivo mają ograniczoną zdolność do rozróżniania różnych typów komórek. Zewnątrzkomórkowa szerokość kolca może być wykorzystana do oddzielenia przypuszczalnych neuronów hamujących parwalbuminowo-dodatnich od pobudzających komórek piramidowych, ale ta metoda jest obarczona błędami zarówno typu I, jak i typu II^2,3. Alternatywnie, zarejestrowane neurony mogą zostać wypełnione, odzyskane i wybarwione, aby później potwierdzić ich morfologiczną i molekularną tożsamość, ale jest to żmudny i czasochłonny proces. Ostatnio genetycznie zidentyfikowane populacje interneuronów hamujących stały się dostępne za pomocą obrazowania wapnia lub wizualnie sterowanych nagrań plastrów. W tych podejściach wirusowa lub transgeniczna ekspresja reportera wapnia (takiego jak GCaMP) lub białka fluorescencyjnego (takiego jak GFP) umożliwia identyfikację i charakterystykę typów komórek zdefiniowanych przez ekspresję promotora. Podejścia te wykorzystują mikroskopię 2-fotonową, która wymaga drogiego sprzętu, a także jest ograniczona do powierzchownych warstw korowych ze względu na właściwości rozpraszania światła przez tkankę mózgową.

Niedawno, i współpracownicy¹ opracowali nowatorskie zastosowanie optogenetyki do kierowania zapisów elektrofizjologicznych do genetycznie zidentyfikowanych typów neuronów in vivo, co określa się mianem "PINP" - czyli Identyfikacja Populacji Neuronów wspomagana przez fotostymulację. Zapisy wykonuje się u myszy z ekspresją rodopsyny kanałowej-2 (ChR2) w określonych subpopulacjach neuronów. Członkowie populacji są identyfikowani na podstawie ich reakcji na krótki błysk niebieskiego światła. W przeciwieństwie do wielu innych zastosowań optogenetycznych, celem nie jest manipulowanie funkcją obwodów, ale po prostu identyfikacja neuronów należących do genetycznie zdefiniowanej klasy, które można następnie scharakteryzować podczas normalnego funkcjonowania mózgu. Technika ta może być realizowana za pomocą standardowego zewnątrzkomórkowego sprzętu rejestrującego i dlatego może służyć jako dostępna i niedroga alternatywa dla obrazowania wapniowego lub wizualnie sterowanego łatania. Tutaj opisujemy podejście do PINPing określonych typów komórek w znieczulonej korze słuchowej, z oczekiwaniem, że bardziej ogólne punkty mogą być z pożytkiem zastosowane w innych preparatach i obszarach mózgu.

W korze mózgowej PINP jest szczególnie obiecujący do badania właściwości odpowiedzi in vivo interneuronów hamujących. Interneurony GABA-ergiczne obejmują mały, niejednorodny podzbiór neuronów korowych⁴. Ostatnio wykazano, że różne podtypy, charakteryzujące się ekspresją poszczególnych markerów molekularnych, pełnią różne role obliczeniowe w obwodach korowych^5-9. Wraz z ulepszaniem narzędzi genetycznych może w końcu być możliwe rozróżnienie morfologicznie i fizjologicznie oddzielnych typów, które mieszczą się w tych szerokich klasach. Dzielimy się tutaj naszą strategią uzyskiwania stabilnych, dobrze izolowanych jednojednostkowych zapisów ze zidentyfikowanych interneuronów hamujących w znieczulonej korze myszy. Strategia ta została opracowana specjalnie do celowania w komórki parwalbuminowo-dodatnie (PV+), ale odkryliśmy, że działa również w przypadku innych typów interneuronów, takich jak interneurony z ekspresją somatostatyny (SOM+) i kalretyniny (CR+). Chociaż PINPing jest koncepcyjnie prosty, w praktyce może być zaskakująco nieustępliwy. Metodą prób i błędów nauczyliśmy się wielu wskazówek i sztuczek, które mogą być przydatne dla innych próbujących tej metody.

Protokół

UWAGA: Poniższy protokół jest zgodny z wytycznymi National Institutes of Health, zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Oregon.

1. Ostra chirurgia

1. Znieczulić zwierzę koktajlem ketaminowo-medetomidynowym poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe (i.p.) (Tabela 1).
   UWAGA: Myszy użyte w tych eksperymentach są generowane przez skrzyżowanie zależnej od cre transgenicznej linii10 ChR2-eYFP z liniami sterującymi interneuronów (Pvalb-iCre11, PV+; Sst-iCre12, SOM+; Cr-iCre12, CR+). Dostarczanie wirusa ChR2 lub pokrewnych opsyn powinno działać równie dobrze, zakładając, że uzyskane są podobne poziomy ekspresji.
2. Przed rozpoczęciem operacji upewnij się, że zwierzę nie reaguje na delikatne szczypanie palca. W razie potrzeby podawaj ponownie środki znieczulające przez cały czas trwania eksperymentu, aby utrzymać tę głębokość znieczulenia. W przypadku stosowania środków znieczulających do wstrzykiwań, opcjonalnie należy wszczepić cewnik i.p. do wstrzyknięć podtrzymujących.
3. Zwierzę należy nawodnić solą fizjologiczną lub roztworem Ringera z mleczanami przez cały czas trwania eksperymentu (około 3 ml/kg/godz.), na przykład stosując odpowiednio rozcieńczony koktajl znieczulający do wstrzyknięć podtrzymujących (Tabela 1).
4. Umieść zwierzę w aparacie stereotaktycznym lub innym aparacie do trzymania głowy. Upewnij się, że czaszka jest dobrze zabezpieczona. Jest to niezbędne do utrzymania stabilnych zapisów pojedynczych komórek.
5. Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 36,5-37 °C.
6. Wykonaj drenaż cysterny, aby uzyskać dodatkową stabilność nagrywania. Za pomocą ostrza skalpela usuń tkankę z tylnej części czaszki, aby odsłonić cisterna magna. Zrób małe nacięcie w oponie twardej, aby odprowadzić płyn mózgowo-rdzeniowy. Używaj tylko samej końcówki ostrza i unikaj kontaktu z móżdżkiem lub pniem mózgu.
7. Za pomocą skalpela wykonaj małą kraniotomię (~2 mm²) nad obszarem zainteresowania kory mózgowej (w przypadku kory słuchowej około -2,3 mm za bregmą, 4,5 mm po boku linii środkowej).
8. Usunąć oponę twardą i przykryć odsłoniętą korę warstwą ciepłej agarozy o grubości 0,5 - 1 mm (1,5% agarozy w soli fizjologicznej, 0,9% NaCl; stosować w temperaturze ~37 °C). Utrzymuj agarozę wilgotną przez cały czas trwania eksperymentu, okresowo nakładając kilka kropli soli fizjologicznej.

2. Konfiguracja nagrywania

1. Przygotuj elektrodę wolframową (7-14 MΩ, średnica 127 μm, końcówka stożkowa 12°, pokryta żywicą epoksydową). Przyklej elektrodę do szklanej rurki kapilarnej i dodaj rurkę termokurczliwą do chwytania (rysunek 1).
2. Zamontuj elektrodę na zmotoryzowanym (lub hydraulicznym) mikromanipulatorze, ustawionym tak, aby poruszała się prostopadle do powierzchni kory mózgowej. Wsuń drut szlifowany pod skórę, przy czaszce. Unikaj kontaktu z mięśniami z boku głowy i z tyłu szyi, ponieważ mogą one generować artefakty elektromiograficzne.
3. Wzmocnij sygnał elektryczny za pomocą wzmacniacza zewnątrzkomórkowego odpowiedniego do nagrywania pojedynczej jednostki, najlepiej wyposażonego w tryb sprawdzania impedancji. Monitoruj bieżącą aktywność skokową (pasmo przepustowe 300 - 5,000 Hz) za pomocą dwóch oscyloskopów i zestawu zasilanych głośników. W tym przypadku zarejestrowane dane są digitalizowane w sposób ciągły z częstotliwością próbkowania 10 kHz; Spajki są wyodrębniane w trybie offline.
4. Przeprowadź elektrodę przez agarozę, aż końcówka dotrze do powierzchni kory. Obserwuj ten krok przez mikroskop. "Wyzeruj" tę pozycję na mikromanipulatorze.
5. Aby jak najlepiej przybliżyć głębokość zapisu, należy wizualnie potwierdzić, że końcówka elektrody wychodzi z powierzchni kory mózgowej na głębokości zera podczas wycofywania elektrody na końcu penetracji.
   UWAGA: Rozbieżność między odczytem manipulatora a obserwowanym położeniem elektrody wskazuje, że przesunął się on względem tkanki. Może to być spowodowane niestabilnością mózgu lub zwierzęcia lub dryfem manipulatora.
   1. Jako dodatkowe sprawdzenie, aby upewnić się, że ta zerowa wartość zadana odpowiada powierzchni kory mózgowej, monitoruj potencjały pola wywołane bodźcem podczas przechodzenia przez pierwsze kilkaset mikrometrów tkanki. Podczas monitorowania potencjałów pola należy obniżyć dolną granicę filtra pasmowo-przepustowego wzmacniacza zewnątrzkomórkowego do 10 Hz. Upewnij się, że polaryzacja potencjału pola lokalnego odwraca się na głębokości ~100 μm, w pobliżu granicy warstwy I/II¹³. Jest to wiarygodny punkt odniesienia dla kory słuchowej, ale może się różnić w przypadku innych obszarów kory mózgowej.
6. Zamontuj światłowód sprzężony ze źródłem światła niebieskiego (rysunek 2) na ręcznym mikromanipulatorze. Za pomocą mikroskopu umieść końcówkę włókna jak najbliżej powierzchni agarozy. Wyśrodkuj wiązkę w miejscu, w którym elektroda wejdzie w tkankę.
7. Reguluj moc wyjściową źródła światła za pomocą jednostki sterującej zdolnej do dostarczania ciągu impulsów TTL (logika tranzystorowo-tranzystorowa) o określonej szerokości i czasie trwania – np. Arduino (ilustracja 3), komputerowa karta I/O (jak pokazano) lub dostępny na rynku generator impulsów.
   1. Monitoruj sygnał na obu oscyloskopach.
8. Zmierz całkowitą moc świetlną (mW) na końcówce światłowodu za pomocą miernika mocy. Użyj tej wartości, aby obliczyć natężenie promieniowania (mW/mm²), dzieląc przez pole przekroju poprzecznego rdzenia światłowodu. Zacznij od wartości intensywności w zakresie 10 - 15 mW/mm² i w razie potrzeby zmniejsz, aż artefakty zostaną wyeliminowane.
9. Sprawdź, czy nie ma artefaktów świetlnych za pomocą elektrody w agarozie, gotowej do wniknięcia do tkanki. Uruchom ciąg impulsów wyszukiwania (np. impulsy świetlne 30 ms, interwał międzybodźcowy 500 ms (ISI)).
   1. Wyeliminuj przejściowe artefakty świetlne (ilustracja 4), zmieniając położenie światłowodu względem elektrody, aby zmienić kąt padania światła. Jeśli artefakty utrzymują się, spróbuj zmniejszyć moc światła. W rzadkich przypadkach, gdy artefaktów nie można całkowicie wyeliminować (a jedynie zminimalizować), wydłuż czas trwania impulsu poszukiwawczego. Może to pomóc w identyfikacji prawdziwych kolców neuronalnych.

3. Prosty PINP-in'

1. Przesuwaj elektrodę powoli przez mózg z szybkością około 1 μm/s. Użyj jednego oscyloskopu do monitorowania bieżącej aktywności. Z drugiej strony wyłącz impulsy laserowe.
2. Słuchaj słabego "haszu" impulsów wywołanych światłem na monitorze audio, który wskazuje, że elektroda zbliża się do ogniwa ChR2+ i często można ją dostrzec na długo przed pojawieniem się sygnału elektrycznego na oscyloskopie. Spowolnij tempo postępu.
   UWAGA: Jeśli ogniwo leży bezpośrednio na ścieżce elektrody, aktywność wywołana światłem będzie rosła (i będzie głośniejsza). Gdy elektroda zbliża się do pojedynczego interneuronu, haszysz rozpadnie się na małe, ale dobrze zdefiniowane kolce o jednolitym rozmiarze i kształcie.
3. Gdy tylko impulsy wywołane światłem będą wystarczająco duże, aby wyzwolić się pojedynczo na oscyloskopie, zacznij to robić. Dostosuj skalowanie na osi poziomej, aby obserwować dokładny kształt fali skokowej.
4. Zatrzymaj się i poczekaj, aż tkanka się uspokoi. Oprzyj się pokusie przesunięcia elektrody bliżej ogniwa. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla stabilnego nagrania. Jeśli po kilku minutach stosunek sygnału do szumu nie uległ poprawie – to znaczy tkanka osiadła, ale nie zbliżyła ogniwa do końcówki elektrody – przesuń się o 5 μm dalej i ponownie poczekaj.
   1. Powtarzaj ten proces do momentu, gdy szczyt lub dolina potencjału czynnościowego będą mogły być wiarygodnie uchwycone przy progu napięcia ustawionym znacznie powyżej poziomu szumu (np. +/-300 μV lub więcej).
      UWAGA: Istnieje niewielkie ryzyko wyników fałszywie dodatnich lub niejednoznaczności podczas PINPing interneuronów hamujących. Większość komórek może z łatwością podążać za ciągiem impulsów o czasie trwania 30 ms i interwałem między impulsami 500 ms lub szybszym, z niezawodnym opóźnieniem pierwszego skoku wynoszącym 2-5 ms (ilustracja 5). W szczególności większość ogniw PV+ może wytrzymać zapłon przez pełną 1 sekundę (ilustracja 6). Ponieważ są to neurony hamujące, aktywacja disynaptic (pośrednia) nie jest poważnym problemem.
5. Podczas nagrywania monitoruj bieżącą aktywność na pierwszym oscyloskopie. Uważnie obserwuj rozmiar i kształt kolców za pomocą drugiego oscyloskopu. Zwróć uwagę na jakość ich dźwięku w głośniku.
   1. Nasłuchuj uważnie nagłych zmian, które wskazują, że ogniwo albo zbliża się zbyt blisko elektrody (gdzie grozi przebiciem lub uszkodzeniem), albo oddala się. Jeśli kolce staną się duże i zniekształcone, wycofaj się; Jeśli staną się mniejsze, przesuń elektrodę. Poruszaj się powoli w krokach co 2 μm.
   2. Potwierdź jakość nagrania post-hoc, nakładając na siebie wszystkie przebiegi szczytowe, wyrównane do wartości szczytowej lub minimalnej. Zmień próg napięcia. W szerokim zakresie wartości progowych powinien istnieć tylko jeden spójny kształt spajka o jednolitej wysokości (Rysunek 5a).
6. Jeśli w którymkolwiek momencie sygnał zostanie zanieczyszczony kolcami z sąsiedniego neuronu, przejdź dalej. się powoli, nie licząc szansy, że elektroda wyjdzie poza zasięg sąsiedniej komórki, ale pozostanie w zasięgu docelowego neuronu. (Zwykle się to nie udaje).
7. Przesuwaj elektrodę przez całą głębokość kory (900+ μm) przy każdej penetracji. Jeśli po wielu penetracjach nie napotka się neuronów reagujących na światło lub odwrotnie, nagrania są rutynowo zanieczyszczone kolcami z sąsiednich komórek ChR2, wypróbuj nową elektrodę.
   UWAGA: Nawet w obrębie jednej partii impedancja i geometria końcówek poszczególnych elektrod mogą się znacznie różnić. Oba czynniki przyczyniają się do efektywnego "promienia nasłuchu" elektrody, który musi być wystarczająco duży, aby wykryć impulsy wywołane światłem podczas wyszukiwania, a jednocześnie wystarczająco ograniczony, aby umożliwić rejestrację pojedynczego interneuronu w izolacji.
8. Sprawdź impedancję elektrod zgodnie z potrzebami. Aby uniknąć uszkodzenia tkanki, zrób to z końcówką elektrody w górnej części warstwy agarozy, daleko poza mózgiem. W zakresie 7-14 MΩ dokładna impedancja nie jest pewnym predyktorem wydajności lub wydajności dla tego zastosowania. To powiedziawszy, jest to rozsądny wskaźnik proxy dla promienia słuchania: elektrody o niższej impedancji odbierają więcej jednostek; wyższa impedancja, mniej.
9. Pod koniec eksperymentu należy poddać zwierzę eutanazji za pomocą środków zatwierdzonych przez instytucję, takich jak przedawkowanie środka znieczulającego lub zwichnięcie szyjki macicy w głębokim znieczuleniu.

Wyniki

Przedstawiamy naszą strategię uzyskiwania rejestracji pojedynczych jednostek z genetycznie sklasyfikowanych interneuronów hamujących w korze mózgu znieczurzonej myszy, z wykorzystaniem metody optogenetycznej opracowanej przez Lima et al.¹. Tabela 1 szczegółowo opisuje sugerowany koktajl anestetyczny: ketamina-medetomidyna-acepromazyna („KMA”). Rysunek 1 przedstawia mikroelektrodę wolframową przygotowaną do rejestracji. Rysunek 2 zawiera schemat obwodu...

Dyskusja

Chociaż PINP jest koncepcyjnie prosty, w praktyce może być wyzwaniem. Głównym wyznacznikiem sukcesu jest wybór elektrody. Parametrem krytycznym jest elektryczny promień odsłuchu. Musi być wystarczająco duży, aby wykryć impulsy wywołane światłem, gdy końcówka znajduje się jeszcze w pewnej odległości od ogniwa ChR2+, aby można było odpowiednio dostosować szybkość posuwania się. Jednocześnie musi być wystarczająco ograniczony, aby umożliwić dobrą izolację pojedynczej jednostki. Oznacza to, że elektroda nie może również zbie...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ChR2-EYFP Linia	Jackson Kolonie	12569
Linia Pvalb-iCre (PV) Kolonie	Jacksona	8069
Linia Sst-iCre (SOM)	Kolonie Jacksona	13044
Linia Cr-iCre (CR) Kolonie	Jacksona	10774
Agaroza	Sigma-Aldrich	A9793	Typ III-A, wysoki mikropunkt EEO
(opona twarda hak)	FST	10066-15
Nożyczki chirurgiczne	FST	14084-09
Skalpel	FST	10003-12 (rękojeść), 10011-00 (ostrza)
Maść okulistyczna Puralube	Foster & Smith	9N-76855
Koc homeotermiczny	Aparatura Harvard	507220F
Mikroelektrody wolframowe	Systemy AM	577200	12 MΩ Odporność na prąd przemienny, 127 μ m średnica, 12° stożkowa końcówka, rurka
ze szkła kapilarnego	Warner Instruments	G150TF-3
Rurka termokurczliwa	DigiKey	A332B-4-ND
Akcelerator Zapit	DVA	ZA/ZAA	Stosować ze standardowym klejem Super Glue.
Mikroelektroda Wzmacniacz prądu przemiennego 1800	AM Systems	700000
MP-285 Mikromanipulator z napędem	silnikowym Sutter	MP-285
4-kanałowe oscyloskopy cyfrowe	Tektronix	TDS2000C
Głośniki zasilane	Harman	Model JBL  Manipulator
	Scientifica	LBM-7
800 µ m Patch Cable	światłowodowy ThorLabs	FC/PC BFL37-800
Miernik mocy	ThorLabs	PM100D (miernik mocy), S121C (standardowy czujnik mocy)
475 nm Cree XLamp XP-E	DigiKey	XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND	LED moc i wydajność stale rosną, dlatego zalecamy sprawdzenie najnowszych produktów (www.cree.com).
Arduino UNO	DigiKey	1050-1024-ND