Izolacja RNA z trzustki myszy: tkanka bogata w rybonukleazę

Podsumowanie

Opisujemy procedurę izolowania RNA o wysokiej integralności z bogatej w rybonukleazy trzustki myszy.

Streszczenie

Izolacja wysokiej jakości RNA z tkanek bogatych w rybonukleazy, takich jak trzustka myszy, stanowi wyzwanie. Ponieważ podstawową funkcją trzustki jest wspomaganie trawienia, trzustka myszy może zawierać aż 75 mg rybonukleazy. Informujemy o modyfikacjach standardowych protokołów odczynnika do lizy tiocyjanianu fenolu / guanidyny w celu wyizolowania RNA z trzustki myszy. Tiocyjanian guanidyny jest silnym denaturantem białka i skutecznie zakłóca aktywność rybonukleazy w większości warunków. Jednak krytyczne modyfikacje standardowych protokołów są konieczne, aby skutecznie wyizolować RNA z tkanek bogatych w rybonukleazę. Kluczowe etapy obejmują wysoki stosunek odczynnika do lizy w tkankach, usunięcie niestrawionej tkanki przed separacją faz oraz włączenie inhibitora rybonukleazy do roztworu RNA. Korzystając z tych i innych modyfikacji, rutynowo izolujemy RNA o liczbie integralności RNA (RIN) większej niż 7. Wyizolowane RNA jest odpowiedniej jakości do rutynowej analizy ekspresji genów. Adaptacja tego protokołu do izolacji RNA z tkanek bogatych w rybonukleazę poza trzustką powinna być łatwo osiągalna.

Wprowadzenie

Izolacja RNA o wysokiej integralności jest wymagana do rutynowych eksperymentów biologii molekularnej, takich jak northern blotting ⁹, qRT-PCR ¹ lub profilowanie ekspresji genów ⁵. Większość współczesnych metod izolacji RNA opiera się na modyfikacjach protokołów tiocyjanianu guanidyny ^{2, 3}. Tiocyjanian guanidyny jest silnym denaturantem białka i skutecznie zakłóca aktywność rybonukleazy w większości warunków. Popularna metoda Chomczyńskiego i Sacchiego ³ polegała na połączeniu fenolu z roztworem lizy tiocyjanianu guanidyny, skracając czas izolacji do około 4 godzin. Wiele dostępnych na rynku odczynników do ekstrakcji RNA opiera się na metodzie Chomczyńskiego i Sacchiego ³.

Tkanki bogate w rybonukleazę, takie jak ludzka lub mysza trzustka, stanowią dodatkowe wyzwanie dla wyizolowania RNA. Trzustka myszy może zawierać do 75 mg rybonukleazy ⁶, z których część zostanie uwolniona podczas przerwania tkanki trzustkowej, co spowoduje autolizę tkanek. Modyfikacje protokołów tiocyjanianu guanidyny zostały z powodzeniem wykorzystane do wyizolowania RNA z trzustki o wysokiej integralności ^{2, 4, 7, 10}. Wlew odczynnika stabilizującego RNA do trzustki myszy ułatwił izolację RNA o wysokiej integralności ^{4, 7, 10}, jednak wlew roztworów do trzustki wymaga dużych umiejętności, może wymagać specjalistycznych narzędzi, takich jak mikroskop preparacyjny, a zaburzenie architektury tkanki podczas zabiegu może spowodować lizę komórek. Perfuzja tkanki za pomocą odczynnika stabilizującego RNA może zakłócać inne zastosowania, w tym izolację białek i barwienie histologiczne. Co więcej, technika ta nie nadaje się do izolowania RNA z ludzkiej trzustki. Inne protokoły wymagają przygotowania określonych rozwiązań przez badacza ².

Zgłaszamy protokół izolacji RNA z trzustki myszy o wysokiej integralności. Protokół wykorzystuje elementy wcześniej opublikowanych metod i jest w dużej mierze oparty na standardowych protokołach odczynników do lizy na bazie fenolu/tiocyjanianu guanidyny. Nie wymaga przygotowania specjalistycznych roztworów, ani nie wymaga infuzji odczynników do trzustki. Kluczowe etapy udanej izolacji RNA obejmują wysoki stosunek odczynnika do lizy na bazie fenolu/guanidyny do tkanki, usunięcie niestrawionej tkanki przed separacją faz i włączenie inhibitora rybonukleazy do otrzymanego roztworu RNA. Korzystając z tych i innych modyfikacji, zazwyczaj izolujemy RNA z RIN większym niż 7, aby użyć go do rutynowej analizy ekspresji genów.

Protokół

1. Przygotowanie

Poniższe praktyki są zgodne z zasadami ustalonymi przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt (IACUC).

1. Zaleca się izolowanie nie więcej niż 6 trzustek myszy w ciągu jednego dnia. Wszystkie narzędzia chirurgiczne należy oczyścić i zautoklawować, po jednym zestawie na zwierzę.
2. Oznacz wszystkie probówki do mikrowirówek. Cztery probówki po 2 ml na zwierzę.
3. Umieścić 8 ml odczynnika do lizy w 50 ml probówkach wirówkowych na lodzie. Uwaga: Podczas gdy zestaw do oczyszczania jest dostarczany z odczynnikiem fenolowym tiocyjanianu guanidyny, który nadaje się do izolacji trzustki, odczynnik do lizy jest używany ze względu na duże objętości, które są niezbędne na izolację.
4. Dozować około 10 ml następujących roztworów do probówek wirówkowych o pojemności 15 ml w celu oczyszczenia ostrzy homogenizatora. Etanol, 70% (2 probówki), woda klasy HPLC (1 probówka) i woda klasy HPLC zawierająca około 200 μl RNase Away lub równoważnej inaktywatora rybonukleazy.

2. Chirurgia, rozwarstwienie trzustki i homogenizacja

1. Umieść 1-2 ml izofrubranu w słoiku zawierającym bawełnianą gazę lub ręczniki papierowe. Myszy umieszcza się na platformie, która uniemożliwia im dotarcie do źródła izofluranu. Dodaj świeży izofluran do słoika przed znieczuleniem każdej myszy.
2. Delikatnie umieść mysz w słoiku zawierającym izofluran. Zakręć słoik i monitoruj efekty znieczulenia, delikatnie obracając słoik do przodu iz powrotem. Zwierzę jest znieczulane, gdy jest w stanie ustać o własnych siłach.
3. Aby potwierdzić znieczulenie, wyjmij zwierzę ze słoika i mocno uszczypnij palec u nogi. Jeśli mysz nie reaguje na uszczypnięcie palca, przejdź do kroku 2.5.
4. Jeśli mysz zareaguje na uszczypnięcie palca, powtórz kroki od 2.2 do 2.3.
5. Umieść znieczulone zwierzę na blacie stołu w pozycji leżącej. Zwichnij szyjkę macicy myszy, mocno kładąc lewą rękę na szyjce macicy myszy. Prawą ręką chwyć ogon myszy i szybko pociągnij w górę pod kątem około 45°, aby zwichnąć szyjkę macicy.
6. Przymocuj tuszę do powierzchni (płaskiego kawałka styropianu pokrytego ręcznikami papierowymi), wbijając każdą z czterech łap zwierzęcia w płaską powierzchnię za pomocą igieł podskórnych o rozmiarze 25.
7. Za pomocą sterylnych narzędzi chirurgicznych rozetnij środkową część myszy i szybko usuń trzustkę z myszy. Użyj kleszczy, aby przytrzymać trzustkę i odetnij ją od śledziony i jelita cienkiego za pomocą nożyczek sprężynowych. Uważaj, aby nie rozciągać trzustki podczas wyjmowania z myszy. Przerwanie tkanki może spowodować uwolnienie rybonukleazy. Uwaga: Czas potrzebny na usunięcie trzustki z myszy ma kluczowe znaczenie. Wprawna osoba powinna być w stanie wypreparować trzustkę w około 1 minutę lub krócej.
8. Umieść całą trzustkę w probówce o pojemności 50 ml zawierającej 8 ml lodowatego odczynnika do lizy. Zakryj probówkę i krótko wstrząśnij, aby zanurzyć tkankę w odczynniku i niezwłocznie przejdź do następnego kroku. Stosunek odczynnika do lizy do tkanki ma kluczowe znaczenie. Patrz sekcja Wyniki, aby zapoznać się z porównaniem integralności RNA wyizolowanego przy użyciu różnych objętości odczynnika do lizy.
9. Homogenizować przez 5 sek. Ważne jest, aby docisnąć łopatki homogenizatora do dna probówki wirówkowej, aby umożliwić wciągnięcie tkanki do ostrzy w celu wydajnej homogenizacji.

3. Usuwanie niestrawionej tkanki

Uwaga: Po homogenizacji, małe kawałki tkanki pozostaną w odczynniku do lizy. Ważniejsza jest szybka liza tkanki, pozostawiając część tkanki niestrawioną, niż nadmierna homogenizacja i ryzyko degradacji RNA.

1. Przenieść 2 ml odczynnika do lizy zawierającego trzustkę poddaną lizie do probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml. Zebrać dwie probówki mikrowirówkowe z homogenatem na izolację. Pozostały homogenat należy wyrzucić lub przechowywać w temperaturze -80 °C do przyszłych badań.
2. Odwirować w temperaturze 4 °C, 12 000 × g przez 5 minut w celu granulowania niestrawionej tkanki. Jest to krytyczny krok, ponieważ przeniesienie niestrawionej tkanki do kolejnych roztworów RNA prawdopodobnie zanieczyści próbkę rybonukleazą (krok 5.13).
3. Przenieść 1 ml supernatantu do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml. Natychmiast należy przystąpić do izolacji i przechowywać probówkę z kontrpróbą w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości. Umieść wszystkie probówki zawierające homogenat na mokrym lodzie, przechodząc do następnego kroku.
4. Pozostały odczynnik do lizy należy wyrzucić do odpowiedniego pojemnika na odpady chemiczne.

4. Czyszczenie ostrzy homogenizatora

1. Przed przystąpieniem do kolejnej izolacji należy oczyścić łopatki homogenizatora, umieszczając je w 10 ml 70% etanolu. Aktywuj homogenizator na około 20 sekund, aby usunąć wszelkie kawałki tkanki, które mogą zostać uwięzione w ostrzach.
2. Użyj końcówki do pipety o pojemności 200 μl, aby usunąć wszelkie kawałki, które pozostały w łopatkach homogenizatora.
3. Powtórzyć krok 4.1 w wodzie, ogólnej inaktywatorze Rnazy i 70% etanolu. Osusz wałek homogenizatora czystą chusteczką Kim.
4. Powtórzyć krok 2.1 dla izolacji trzustki pozostałych zwierząt, pozostawiając RNA wyizolowane od każdego zwierzęcia oddzielnie, zamiast łączyć RNA.

5. Izolacja RNA

Poniższa sekcja jest identyczna z protokołem zestawu do oczyszczania. Zaletą zestawu do oczyszczania jest to, że izoluje całkowity RNA, w tym małe RNA.

1. W przypadku użycia zamrożonego roztworu homogenatu rozmrozić na mokrym lodzie i odstawić w temperaturze pokojowej na 5 minut.
2. Dodać 200 μl chloroformu, zakryć probówkę i energicznie wstrząsać ręcznie przez 15 sekund. Pozostaw rurkę w pozycji RT na 2-3 minuty.
3. Wirować przez 15 minut przy 12 000 x g, 4 °C.
4. Przenieś górną warstwę wodną do probówki do mikrowirówki. Dodać 1,5 objętości izopropanolu i dokładnie wymieszać, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół.
5. Przenieść do 700 μl próbki do kolumny wirowej, którą umieszcza się w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml. Zamknąć pokrywę i odwirować przy 8 000 x g przez 15 sekund w temperaturze pokojowej.
6. Odrzuć przepływ.
7. Powtórzyć kroki 5.5-5.6, używając pozostałej części próbki.
8. Dodać 700 μl buforu RWT do kolumny wirowej. Wirować przez 15 sekund przy 8 000 x g. Odrzuć przepływ.
9. Odpipetować 500 μl buforu RPE do kolumny wirowej. Wirować przez 15 sekund przy 8 000 x g w celu umycia kolumny. Odrzuć przepływ.
10. Dodać 500 μl buforu RPE do kolumny wirowej. Wirować przez 2 minuty przy 8 000 x g w celu wysuszenia kolumny.
11. Przenieść kolumnę wirową do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Odmierzyć pipetę 80 μl wody wolnej od rybonukleazy bezpośrednio na membranę kolumny wirowej. Wirować przez 1 minutę przy 8 000 x g w celu elucji RNA.
12. Dodać 1 μl inhibitora Rnazy do roztworu RNA. Przechowywać w temperaturze -80 °C lub kontynuować do 5.13.
13. Aby zweryfikować integralność RNA, najpierw oblicz stężenie RNA i stosunek 260/280 za pomocą spektrofotometru.
14. Rozcieńczyć część roztworu RNA do około 500 ng/μl wodą klasy biologii molekularnej.
15. Określ integralność RNA (tj. RIN) za pomocą analizy elektroforezy kapilarnej. Do analizy wystarczy około 5 μl roztworu RNA.
16. Podwielokrotnić roztwór RNA (patrz rysunek 2) i przechowywać w temperaturze -80 °C.

Wyniki

Całkowita wydajność RNA z 1 ml homogenatu lizacyjnego wynosi 20-40 µg. Stosunki OD 260/280 zazwyczaj oscylują wokół 2,0, a wartości RIN są konsekwentnie wyższe niż 7,0. Jeśli wartość RIN wynosi ≤6, izolację należy powtórzyć. Okazyjnie uzyskuje się wartość RIN wyższą niż 8,0.

Dwie najczęściej stosowane metody uśmiercania myszy przed pobraniem trzustki to duszenie CO₂ lub inhalacja izofluranem. Obie techniki są uzupełniane przez zwichnięcie stawów kręgów szyjnych. Ponieważ istnieje mo...

Dyskusja

Wyizolowanie RNA z tkanek bogatych w rybonukleazę stanowi wielkie wyzwanie dla eksperymentów biologii molekularnej. W handlu dostępne są różne odczynniki i zestawy, które są oparte głównie na metodzie ekstrakcji RNA fenolu i guanidyny. Tiocyjanian guanidyny denaturuje białko, a tym samym zmniejsza aktywność rybonukleazy. Jednak sama wielkość rybonukleazy w trzustce wymaga dodatkowych modyfikacji standardowych protokołów izolacji RNA. Opisano tutaj protokół, który opiera się na standardowej metodzie tiocyjanianu guanidyny...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Generacja mocy 500	Fisher Scientific	14-261-03	Homogenizator
5424R	Eppendorf		Chłodzony mikrocentyfug
Odczynnik Trizol	Invitrogen	15596018	Odczynnik do lizy
Nożyczki sprężynowe Student Vannas	Fisher	91500-09	Służy do wycinania trzustki z przyczepionych tkanek
Nożyczki chirurgiczne, 6 cali	Fisher	08-951-20	Służy do wycinania kości myszy
Kleszcze z końcem	Fisher	1381239	Służy do trzymania trzustki podczas preparowania
Isoflurane USP	Abbott Labs	4/8/5210	Anesthetic
Rnase out (40 U/µ l)	Invitrogen	10777-019	Inhbitor
Rnazy Away	Ambion	10328-011	Ogólny inaktywator Rnazy
Woda klasy HPLC	Fisher	W5-4	Do mycia ostrzy homogenizatora
Woda klasy biologii molekularnej	Hyclon	SH30538.03	Elucja RNA
miRNeasy Mini zestaw	Qiagen	217004	Zestaw
do oczyszczaniaProbówki do mikrowirówek 2 ml, certyfikowane Rnazy Wolne od dnazy	USA Scientific Plastics	1620-2700
Probówki wirówkowe 15 ml	Falcon	352099
70% etanolu	Fisher
100%	Fisher
200 µ l Końcówki do pipet	Rainin	GPL200F	Do czyszczenia ostrzy homogenizatora
Chloroform	Fisher	BP1145-1
Nanodrop	Thermo	ND-1000	Spektrofotometr
Bioanalizator	Analizator elektroforezy kapilarnej	Agilent
RNA RNAlater	Odczynnik stabilizacji RNA	Ambion
RNeasy  Kolumny obrotowe	Kolumny przędzalnicze Qiagen		jako część zestawu miRNeasy Mini
Mice	Chales River	Strain C57BL/6	Ich wiek wahał się od 4 do 12 miesięcy.
Myszy	Szczep Jackson Lab	129	Ich wiek wahał się od 4 do 12 miesięcy.

etanolu do pomiaru integralności