Artykuł metodologiczny

Wysokorozdzielcza czasoprzestrzenna analiza dynamiki receptorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek

DOI:

10.3791/51784

⸱

25 lipca 2014

 ,  ,  , 
1Institute of Pharmacology and Toxicology and Bio-Imaging Center/Rudolf Virchow Center, DFG-Research Center for Experimental Biomedicine, University of Würzburg, Germany

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia do wizualizacji i śledzenia pojedynczych receptorów na powierzchni żywych komórek, a tym samym do analizy bocznej ruchliwości receptora, wielkości kompleksów receptorowych, a także do wizualizacji przejściowych interakcji receptor-receptor. Protokół ten można rozszerzyć na inne białka błonowe.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia pojedynczych cząsteczek staje się potężnym podejściem do analizy zachowania cząsteczek sygnałowych, w szczególności w odniesieniu do tych aspektów (np. kinetyka, współistnienie różnych stanów i populacji, przejściowe interakcje), które są zazwyczaj ukryte w pomiarach zespołowych, takich jak te uzyskane za pomocą standardowych metod biochemicznych lub mikroskopowych. W ten sposób dynamiczne zdarzenia, takie jak interakcje receptor-receptor, mogą być śledzone w czasie rzeczywistym w żywej komórce z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną. Protokół ten opisuje metodę opartą na znakowaniu za pomocą małych i jasnych fluoroforów organicznych oraz mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) w celu bezpośredniej wizualizacji pojedynczych receptorów na powierzchni żywych komórek. Takie podejście pozwala na precyzyjną lokalizację receptorów, pomiar wielkości kompleksów receptorowych i uchwycenie dynamicznych zdarzeń, takich jak przejściowe interakcje receptor-receptor. Protokół zawiera szczegółowy opis sposobu przeprowadzenia eksperymentu z pojedynczą cząsteczką, w tym przygotowania próbki, akwizycji obrazu i analizy obrazu. Jako przykład przedstawiono zastosowanie tej metody do analizy dwóch receptorów sprzężonych z białkiem G, tj. receptora βkwasu 2-adrenergicznego i γ-aminomasłowego typu B (GABAB). Protokół można dostosować do innych białek błonowych i różnych modeli komórek, metod transfekcji i strategii znakowania.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Receptory znajdujące się na powierzchni komórki wyczuwają środowisko zewnątrzkomórkowe i reagują na różne bodźce, takie jak substancje zapachowe, jony, małe neuroprzekaźniki i duże hormony białkowe. Płynna natura błon komórkowych umożliwia ruchy receptorów i innych białek błonowych. Jest to niezbędne do tworzenia kompleksów białkowych i występowania przejściowych interakcji białko-białko, takich jak te wykorzystywane przez receptory do łączenia się w jednostki funkcjonalne i przekazywania sygnałów do wnętrza komórki. Na przykład sugeruje się, że receptory sprzężone z białkiem G (GPCR), które stanowią największą rodzinę receptorów na powierzchni komórki1, tworzą di-/oligomery, co wydaje się być zaangażowane w precyzyjnie dostrojoną regulację transdukcji sygnału i może mieć ważne konsekwencje fizjologiczne i farmakologiczne2-5.

Mikroskopia jednocząsteczkowa ma ogromny potencjał bezpośredniego obrazowania z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną dynamicznego zachowania poszczególnych receptorów znajdujących się na powierzchni żywych komórek, w tym ich powiązania w celu tworzenia dimerów i kompleksów molekularnych wyższego rzędu6-10. Ma to kilka zalet w porównaniu ze standardowymi metodami biochemicznymi i mikroskopowymi, które zwykle informują o średnim zachowaniu tysięcy lub milionów cząsteczek.

Znakowanie białek za pomocą wystarczająco jasnego i fotostabilnego fluoroforu jest niezbędne dla mikroskopii jednocząsteczkowej. Protokół ten wykorzystuje niedawno wprowadzony znacznik SNAP11 do kowalencyjnego przyłączania małych i jasnych fluoroforów organicznych do receptorów na powierzchni komórki. SNAP jest znacznikiem białkowym o masie 20 kD pochodzącym z enzymu naprawy ludzkiego DNA Alkilotransferazy O-6-alkiloguaniny-DNA, który może być nieodwracalnie znakowany pochodnymi benzyloguaniny sprzężonej z fluoroforem (fluorofor-BG). CLIP, kolejny zmodyfikowany znacznik pochodzący z SNAP, może być zamiast tego znakowany za pomocą sprzężonych z fluoroforem pochodnych benzylocozyny12.

Protokół opisany w tym manuskrypcie wyjaśnia, jak transfekować i oznaczać11 receptorów oznaczonych SNAP małymi organicznymi fluoroforami i używać mikroskopii całkowitego wewnętrznego odbicia fluorescencji (TIRF) do wizualizacji pojedynczych receptorów lub kompleksów receptorów na powierzchni żywych komórek10. Zgłoszony protokół skutkuje >90% skutecznością znakowania zewnątrzkomórkowego białka na powierzchni komórkiznakowanego SNAP 10. Podano dalsze informacje na temat wykorzystania danych dotyczących pojedynczych cząsteczek do analizy wielkości i ruchliwości kompleksów receptorowych, a także do wychwytywania przejściowych interakcji receptor-receptor. Schematyczny przebieg pracy całego protokołu przedstawiono na rysunku 1. Jako przykład opisano transfekcję komórek jajnika chomika chińskiego (CHO) z receptorami sprzężonymi z białkiem G (GPCR) znakowanymi SNAP, a następnie znakowanie pochodną fluoroforu BG, a także jej zastosowanie do ilościowego określania i monitorowania di-/oligomeryzacji receptora. Protokół ten można rozszerzyć na inne białka powierzchniowe komórki i znaczniki fluorescencyjne (np. CLIP), a także na inne metody transfekcji i znakowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie próbki

  1. Czyszczenie szkiełek nakrywkowych
    nuta: Praca pod wyciągiem.
    1. Użyj czystej pęsety, aby umieścić szklane szkiełka nakrywkowe (o średnicy 24 mm) w uchwycie na szkiełko nakrywkowe, które oddziela poszczególne szkiełka nakrywkowe.
    2. Umieścić zatyczkę z szkiełkami nakrywkowymi w zlewce i dodawać chloroform, aż szkiełka nakrywkowe zostaną przykryte. Przykryj zlewkę folią aluminiową, aby zmniejszyć parowanie i poddać sonikatacji w kąpieli sonikatora przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Wyjąć uchwyt szkiełka nakrywkowego ze zlewki i pozostawić szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia.
    3. Powtórzyć krok 1.1.2 z 5M roztworem NaOH zamiast chloroformu.
    4. Umieścić uchwyt szkiełka nakrywkowego w nowej zlewce i przemyć trzykrotnie wodą destylowaną. Oczyszczone szkiełka nakrywkowe umieścić na szklanej płytce do hodowli komórek wypełnionej 100% etanolem.
  2. Przygotowanie próbek kalibracyjnych
    1. Rozpuść barwnik fluorescencyjny w odpowiednim rozpuszczalniku.
    2. Przygotować seryjne rozcieńczenie barwnika fluorescencyjnego w stosunku 1:10 w zakresie od 1 pM do 1 nM w wodzie sterylizowanej filtrem (0,22 μm).
    3. Weź oczyszczone szkiełka nakrywkowe przechowywane w 100% etanolu i umyj wodą sterylizowaną z filtrem. Umieścić 20 μl każdego rozcieńczenia barwnika fluorescencyjnego na oddzielnym, oczyszczonym szkiełku nakrywkowym. Pozostaw szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia pod sterylnym kapturem. Szkiełka nakrywkowe należy chronić przed światłem i kurzem do czasu użycia. Użyj tych próbek, aby oszacować intensywność pojedynczych cząsteczek fluorescencyjnych (patrz krok 3).
  3. Transfekcja
    1. Hodowla komórek CHO w zmodyfikowanej mieszaninie Eagle F-12 (DMEM/F12) firmy Dulbecco w stosunku 1:1 uzupełnionej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny w temperaturze 37 °C, w 5% CO2 . nuta: Używaj pożywek wolnych od czerwieni fenolowej przez cały czas trwania eksperymentu, aby zminimalizować autofluorescencję.
    2. Weź oczyszczone szkiełka nakrywkowe ze 100% roztworu etanolu, przemyj je sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i umieść jedno szkiełko nakrywkowe w każdym dołku 6-dołkowej płytki do hodowli komórek.
    3. Trypsynować, policzyć i wysiać komórki CHO o gęstości 3 x 105 komórek/basenik na 6-dołkowej płytce do hodowli komórkowej zawierającej szkiełka nakrywkowe. Pozwól komórkom rosnąć w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ) przez 24 godziny, aby osiągnąć ok. 80% konfluencji, która jest optymalną gęstością komórek do transfekcji.
    4. Dla każdej studzienki rozcieńczyć 2 μg pożądanego plazmidowego DNA (np. znakowanego SNAP receptora 2-adrenergicznego β) i 6 μl Lipofectamine 2000 w dwóch oddzielnych probówkach zawierających 500 μl pożywki OptiMem. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    5. Połączyć roztwory z kroku 1.3.4 w jedną probówkę i wymieszać w celu uzyskania mieszaniny transfekcyjnej. Inkubować mieszaninę transfekcji w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
    6. Podczas inkubacji (1.3.5) pobrać komórki CHO i dwukrotnie przemyć je wstępnie ogrzanym (37 °C) PBS. Zastąp PBS 1 ml / studzienkę pożywki DMEM/F12 bez czerwieni fenolowej uzupełnionej 10% FBS, ale bez antybiotyków.
    7. Dodać kroplami całą mieszaninę transfekcji (1 ml) z kroku 1.3.5 do każdej studzienki i delikatnie kołysać płytką w przód i w tył, aby zapewnić całkowite wymieszanie.
    8. Inkubować przez 2 do 4 godzin w temperaturze 37 °C, w 5% CO2 i natychmiast po tym przejść do następnego etapu. nuta: Te warunki transfekcji zostały zoptymalizowane w celu osiągnięcia gęstości receptorów <0,45 cząstki/μm2, które są odpowiednie do obrazowania pojedynczych cząsteczek. W przypadku korzystania z różnych komórek, konstruktów lub odczynników mogą być wymagane korekty.
  4. Znakowanie białek
    1. Rozcieńczyć 1 μl roztworu podstawowego fluoroforu-BG w 1 ml pożywki DMEM/F12 uzupełnionej 10% FBS w celu uzyskania końcowego stężenia 1 μM. Wyjąć transfekowane komórki z inkubatora i przemyć je dwukrotnie wstępnie podgrzanym (37 °C) PBS. Zastąp PBS 1 ml 1 μM roztworu fluoroforu-BG i inkubuj przez 20 minut w temperaturze 37 °C 5% CO2 w inkubatorze.
    2. Po inkubacji przemyć komórki trzykrotnie pożywką DMEM/F12 uzupełnioną 10% FBS, za każdym razem po czym następuje 5-minutowa inkubacja w temperaturze 37 °C. Weź szkiełko nakrywkowe (z oznaczonymi komórkami) za pomocą pęsety i umieść je w komorze obrazowania.
    3. Przemyć dwukrotnie buforem obrazowania o pojemności 300 μl. Dodać 300 μl świeżego buforu do obrazowania i natychmiast przystąpić do obrazowania (część 2).

2. Akwizycja obrazu

UWAGA: Użyj mikroskopu z pełnym wewnętrznym odbiciem fluorescencji (TIRF), wyposażonego w obiektyw o wysokiej aperturze numerycznej (np. 100-krotne powiększenie/apertura numeryczna 1,46), odpowiednie lasery (np. lasery diodowe 405 nm, 488 nm, 561 nm i 645 nm), kamerę EMCCD (electron multipling charge coupled device), inkubator i kontrolę temperatury do wizualizacji pojedynczych cząsteczek fluorescencyjnych.

  1. Ustaw żądane parametry mikroskopu, tj. linię lasera, kąt TIRF (ten parametr kontroluje głębokość penetracji pola ulotnego), czas ekspozycji, liczbę klatek na sekundę i liczbę obrazów na film10. Grzałka/inkubator i regulator temperatury powinny być zawsze włączone, aby uniknąć dryftów temperatury i kondensacji wilgoci.
  2. Nałóż kroplę olejku immersyjnego na obiektyw 100X mikroskopu. Umieść komorę obrazowania z oznaczonymi komórkami na uchwycie próbki mikroskopu i ustaw ostrość komórek za pomocą oświetlenia w jasnym polu.
  3. Przełącz na podświetlenie TIRF. Utrzymuj moc lasera na jak najniższym poziomie, aby umożliwić wyszukiwanie pożądanej komórki, ale jednocześnie zminimalizować fotowybielanie.
  4. Zaznacz żądaną komórkę i dostosuj ostrość. Ustaw moc lasera na poziomie umożliwiającym wizualizację pojedynczych fluoroforów. Uzyskaj sekwencję obrazów i zapisz plik sekwencji obrazów RAW jako .tiff.

3. Kalibracja (pojedyncze fluorofory na szkle i kontrola receptorów monomerycznych/dimerycznych)

  1. Każdą próbkę kalibracyjną przygotowaną zgodnie z opisem w ppkt 1.2 zebrać w komorze obrazowania. Umieść każdą próbkę pod mikroskopem i wybierz próbkę zawierającą dobrze oddzielone plamki o ograniczonej dyfrakcji, które wybielają się w jednym kroku. nuta: Plamki te reprezentują pojedyncze cząsteczki barwnika fluorescencyjnego.
  2. Uzyskaj sekwencje obrazów TIRF zgodnie z opisem w kroku 2. Ważne: te same parametry obrazowania muszą być stosowane we wszystkich eksperymentach, w tym w eksperymentach kalibracyjnych.
  3. Wykonaj analizę wykrywania i śledzenia zgodnie z opisem w 4.1 - 4.2. Wyodrębnić intensywność każdej cząstki zgodnie z opisem w ppkt 4.2.6. Na podstawie tych danych oblicz średnią (μ) i odchylenie standardowe (σ) intensywności pojedynczych fluoroforów.
  4. Opcjonalnie: przeprowadzić tę samą analizę na komórkach transfekowanych monomerycznym receptorem powierzchniowym komórki (np. CD86), N-końcowym znakowanym jedną lub dwiema kopiami SNAP10 i znakowanym pochodną fluoroforu-BG. Postępuj zgodnie z procedurą opisaną powyżej dla pojedynczego fluoroforu na szkle. Oszacuj skuteczność etykietowania zgodnie z opisem w Calebiro, D. i wsp.10

4. Analiza obrazu

  1. Przygotowanie sekwencji obrazów
    1. Użyj oprogramowania do przetwarzania obrazu (np. ImageJ), aby przyciąć obrazy.
    2. Poszczególne klatki można zapisywać jako osobne obrazy .tiff w nowym folderze, wskazując na każdym obrazie numer ramki.
    3. Zmierz powierzchnię komórki, rysując obszar zainteresowania (ROI) wzdłuż konturu komórki i używając narzędzia do pomiaru w ImageJ lub podobnego narzędzia w innym oprogramowaniu. Wartość ta służy do obliczania gęstości cząstek, dzieląc całkowitą liczbę cząstek na początku filmu przez powierzchnię komórki.
  2. Wykrywanie i śledzenie cząstek
    nuta: Korzystaj z niekomercyjnego oprogramowania, takiego jak u-track13, pracującego w środowisku Matlab, aby automatycznie wykrywać i śledzić pojedyncze cząsteczki receptora.
    nuta: Algorytm u-track opiera się na podejściu opartym na śledzeniu wielu hipotez. Podejście to łączy cząstki między ramkami poprzez budowanie macierzy kosztów, w których przypisywane są indywidualne prawdopodobieństwa, że dana cząstka w jednej ramce odpowiada danej cząstce w następnej klatce, pojawia się, znika lub łączy się/rozdziela z/z innych cząstek. Ostatecznie wybierane jest rozwiązanie, które globalnie minimalizuje koszty, czyli takie, które ma największe prawdopodobieństwo. Pozwala to również na śledzenie chwilowo znikającej cząstki, co jest typowym zjawiskiem spowodowanym mruganiem fluoroforu. Najnowsza wersja u-track (2.1.0) posiada graficzne interfejsy użytkownika, które ułatwiają wykonywanie tych analiz.
    1. W wierszu polecenia Matlab wpisz "movieSelectorGUI", aby otworzyć interfejs wyboru filmu. Postępuj zgodnie z instrukcjami, aby utworzyć nową bazę danych filmów, zaczynając od poprzednio zapisanych oddzielnych obrazów (patrz 4.1.2).
    2. Podaj rozmiar piksela w nm, odstęp czasu w sekundach, aperturę numeryczną, głębię bitową kamery i długość fali emisji fluoroforu, wymagane do wykrywania i śledzenia cząstek. Zapisz bazę danych filmów.
    3. W interfejsie wyboru filmu uruchom analizę, wybierając "pojedyncze cząstki" jako typ obiektów. Pojawi się nowe okno, w którym można zdefiniować parametry używane do wykrywania i śledzenia cząstek. Zacznij od parametrów domyślnych. Później należy dostosować te parametry, jeśli jakość wykrywania i/lub śledzenia nie jest zadowalająca (np. niektóre cząstki nie są wykrywane lub ścieżki są fragmentowane). Opcjonalnie: w ustawieniach śledzenia zaznacz "Eksportuj wyniki śledzenia do formatu matrycy", aby przechowywać współrzędne i amplitudy wszystkich cząstek w jednej macierzy (pole o nazwie "trackedFeaturedInfo"). Szczegółowy opis tych parametrów można znaleźć w dokumentacji u-track.
    4. Uruchom algorytm wykrywania. Algorytm ten automatycznie określa położenie i intensywność nad tłem każdego punktu ograniczonego dyfrakcją (tj. pojedynczych receptorów/kompleksów receptorów) poprzez dopasowanie dwuwymiarowej funkcji Gaussa z odchyleniem standardowym równym funkcji rozrzutu punktowego mikroskopu wokół lokalnych maksimów intensywności. Następnie uruchom algorytm śledzenia. Przechowuj wyniki analiz w pliku .mat.
    5. Użyj procedury "movieViewer" zawartej w pakiecie u-track lub podobnych niestandardowych procedur, aby zwizualizować ścieżki i sprawdzić jakość wykrywania i śledzenia.
    6. Otwórz plik .mat, aby zobaczyć położenie i amplitudę (tj. intensywność) śledzonych cząstek w każdej klatce. Dane wygenerowane w kroku 4.2.4 są zawarte w polu tracksCoordAmpCG tablicy tracksFinal i/lub w trackedFeaturedInfo. Na podstawie całkowitej liczby wykrytych cząstek obliczyć gęstość cząstek, dzieląc tę wartość przez powierzchnię komórki zmierzoną w ppkt 4.1.3.
    7. Opcjonalnie: Użyć współrzędnych cząstek w czasie (patrz 4.2.6) do analizy ruchu cząstek receptora. Oblicz średnie przemieszczenia kwadratowe (MSD) i współczynniki dyfuzji (D) za pomocą Matlaba lub podobnego oprogramowania. Dla każdej cząstki i każdego rozpatrywanego przedziału czasowego (Δt) należy obliczyć średnie przemieszczenie kwadratowe (MSD), korzystając z następującego wzoru:
      figure-protocol-1
      gdzie Δt jest przedziałem czasu w ramkach, N jest liczbą analizowanych kroków, x i y są współrzędnymi x i y cząstki w układzie wskazanym przez indeks. Użyj wykresów MSD w czasie, aby ocenić rodzaj ruchu danej cząstki: Zależności liniowe wskazują na swobodną dyfuzję (tj. ruch Browna), dodatnia krzywizna (tj. krzywa wygląda jak parabola) sugeruje ruch skierowany, ujemna krzywizna wskazuje na ruch ograniczony14. W przypadku cząstek swobodnie dyfuzyjnych należy obliczyć współczynnik dyfuzji (D) każdej cząstki, dopasowując uzyskane dane MSD do następującego równania:
      figure-protocol-2
  3. Obliczanie wielkości cząstek metodą dopasowania gaussowskiego
    nuta: Gdy znany jest rozkład intensywności próbek kalibracyjnych (pojedyncze fluorofory na szkle i/lub znakowane fluorescencyjnie receptory monomeryczne), należy przeprowadzić mieszane dopasowanie Gaussa na rozkładzie intensywności cząstek na początku sekwencji obrazu, aby określić wielkość kompleksów receptorowych (tj. liczbę receptorów na cząstkę)10. Wykonaj te analizy za pomocą Matlaba lub podobnego oprogramowania.
    1. Oblicz intensywność każdej cząstki, uśredniając intensywność cząstki od pierwszej klatki do klatki przed wystąpieniem pierwszej zmiany intensywności (w większości przypadków spadku spowodowanego fotowybielaniem).
    2. Wykonaj mieszane dopasowanie Gaussa zgodnie z następującym równaniem:
      figure-protocol-3
      gdzie φ(i) jest częstotliwością cząstek o intensywności i, n jest liczbą składowych, αn jest parametrem wpływającym na wysokość składowej n, μ i σ są średnią i odchyleniem standardowym intensywności pojedynczych fluoroforów odniesienia (obliczonych zgodnie z opisem w kroku 3). UWAGA: Określ maksymalną liczbę składników (nmax) dla każdej sekwencji obrazu, stopniowo zwiększając nmax, aż dodanie komponentu nie spowoduje już statystycznie lepszego dopasowania, jak oceniono za pomocą testu F.
    3. Opcjonalnie: Wykonaj mieszane dopasowanie gaussowskie na rozkładzie intensywności uzyskanym w ostatnich klatkach filmu (np. ostatnich 60 klatkach z 400 klatek). Zastąp μ i σ wartościami uzyskanymi po tym dopasowaniu, które zapewniają dokładniejsze oszacowania tych parametrów, a następnie powtórzyć krok 4.3.2.
    4. Oblicz pole pod krzywą (AUC) każdej składowej mieszanego pasowania Gaussa. Oblicz względną obfitość cząstek receptora o różnej wielkości (tj. monomeru, dimeru, trimera itp.), dzieląc wartość AUC każdego składnika przez AUC całego rozkładu.
    5. Fakultatywnie: Wykorzystać dane z różnych komórek i odpowiadające im gęstości cząstek (obliczone zgodnie z opisem w ppkt 4.2.6) w celu wygenerowania wykresów, na których rozkład cząstek o różnej wielkości jest skorelowany z gęstością cząstek10.
  4. Obliczanie wielkości cząstek metodą dopasowania stopniowego
    nuta: Użyj analizy dopasowania krokowego jako alternatywnej metody do określenia wielkości kompleksów receptorowych10. Podstawą tej analizy jest to, że wywołane światłem zniszczenie (fotowybielanie) pojedynczego fluoroforu powoduje jego natychmiastowy zanik – w związku z tym oczekuje się, że cząstki zawierające n fluoroforów będą stopniowo wybielać, wytwarzając profil intensywności z n krokami.
    1. Wyodrębnij profile intensywności każdej cząstki z pliku .mat wygenerowanego przez u-track lub podobne oprogramowanie do wykrywania/śledzenia (patrz 4.2.6).
    2. Użyj algorytmu dopasowania krokowego, takiego jak ten przedstawiony w odnośniku 10, aby policzyć liczbę etapów wybielania dla każdej cząstki.
    3. Opcjonalnie: wykorzystać wyniki do wygenerowania rozkładów pokazujących względną obfitość cząstek receptorowych o różnej wielkości i skorelować je z gęstością cząstek, jak opisano wcześniej dla wyników mieszanego dopasowania Gaussa (patrz 4.3).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany protokół może być stosowany do wielu różnych białek błonowych. Na przykład podano reprezentatywne wyniki uzyskane z receptoramiβ 2-adrenergicznymi i GABAB 10. Ponieważ sygnały fluorescencyjne z pojedynczych cząsteczek są słabe, minimalizacja fluorescencji tła jest pierwszym kluczowym krokiem do pomyślnych wyników. Dlatego ważne jest, aby używać dokładnie oczyszczonych szkiełek nakrywkowych (rysunek 2A), a także zminimalizować autofluorescencję próbki (np....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany protokół pozwala na analizę rozmieszczenia przestrzennego, ruchliwości i wielkości kompleksów receptorów na powierzchni komórki na poziomie pojedynczej cząsteczki. W porównaniu z zastosowaniem białek fluorescencyjnych, znakowanie małymi fluoroforami organicznymi, które są jaśniejsze i bardziej fotostabilne, ma tę zaletę, że umożliwia rozszerzoną wizualizację pojedynczych cząstek receptora. Ponieważ osiągane są ekstremalnie niskie poziomy ekspresji (<0,45 cząstki receptora/μm2), właściwości receptorów i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój tego protokołu był wspierany przez granty Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (Advanced Grant TOPAS dla M.J.L.) oraz Deutsche Forschungsgemeinschaft (Granty CA 1014/1-1 dla D.C. i SFB487 dla M.J.L.). T.S. był wspierany przez Fundację Alexandra von Humboldta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ChloroformAppliChem GmbHA1585UWAGA: substancja toksyczna i drażniąca, a także możliwy czynnik rakotwórczy
NaOHSigma-AldrichS8045UWAGA: mocna zasada i silnie odczynnik
Absolutny etanolSigma-Aldrich32205
Szkiełko nakrywkowe Marienfeld-Superior111640Średnica 24 mm, grubość 0,13-0,16 mm
Sterylny filtr 0,2 mmSarstedt83.1826.001
Komórki CHOATCC, USAATCC CCL-61Linia komórkowa jajnika chomika chińskiego
6-dołkowa płytka do hodowli komórkowejNunc140675
DMEM/F-12GIBCO, Life Technologies11039-021Pożywka wolna od czerwieni fenolowej
Surowica bydlęca płodu BiochromS 0115
Penicylina - streptomycyna Pan Biotech GmbHP06-07 100
Trypsin-EDTAPan Biotech GmbHP10-23100
Lipofectamina 2000Invitrogen, Life Technologies11668-019
Opti-MEM I Zredukowana surowicaMedium Invitrogen, Life Technologies31985-047
Benzyloguanina sprzężona z fluoroforem New England BioLabsS9136SSNAP-Surface Alexa Fluor 647. Przygotuj roztwór podstawowy o pojemności 1 mM w DMSO. Przechowywać w temperaturze -20&st;C.
DMSOAppliChem GmbHA1584
Bufor obrazowania:137 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7,3, sterylnie filtrowany
      NaClAppliChem GmbHA1371
      KClAppliChem GmbHA3582
      CaCl2AppliChem GmbHA2303
      MgCl2AppliChem GmbHA3618
      HEPESAppliChem GmbHA3724
Komora obrazowaniaSondy molekularne, Life TechnologiesA-7816Komora komórkowa Attofluor, do mikroskopii
TIRF-MLeicaModel: DMI6000B
Obiektyw TIRFLeica11 506 249 HCX PL Apo 100x/1.46 Olej CORR 
Kamera EM-CCD Roper ScientificPhotometrics Cascade 512B
Regulator temperaturyPeconTempcontrol 37-2 cyfrowe
oprogramowanie ImageJNIH, USAhttp://rsbweb.nih.gov/ij
oprogramowanie u-trackLaboratorium obliczeniowej biologii komórki, Wydział Biologii Komórki, Harvard Medical School, USAhttp://lccb.hms.harvard.edu/software.html
Matlab oprogramowanieThe MathWorks, Stany Zjednoczone

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
  2. Angers, S., Salahpour, A., Bouvier, M. Dimerization: an emerging concept for G protein-coupled receptor ontogeny and function. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 42, 409-435 (2002).
  3. Ferré, S., et al. Building a new conceptual framework for receptor heteromers. Nat Chem Biol. 5, 131-134 (2009).
  4. Milligan, G. G. protein-coupled receptor hetero-dimerization: contribution to pharmacology and function. Br J Pharmacol. 158, 5-14 (2009).
  5. Lohse, M. J. Dimerization in GPCR mobility and signaling. Curr Opin Pharmacol. 10, 53-58 (2010).
  6. Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y. Subunit counting in membrane-bound proteins. Nat Methods. 4, 319-321 (2007).
  7. Triller, A., Choquet, D. New concepts in synaptic biology derived from single-molecule imaging. Neuron. 59, 359-374 (2008).
  8. Hern, J. A., et al. Formation and dissociation of M1 muscarinic receptor dimers seen by total internal reflection fluorescence imaging of single molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 2693-2698 (2010).
  9. Kasai, R. S., et al. Full characterization of GPCR monomer-dimer dynamic equilibrium by single molecule imaging. J Cell Biol. 192, 463-480 (2011).
  10. Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 743-748 (2013).
  11. Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nat Biotechnol. 21, 86-89 (2003).
  12. Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chem Biol. 15, 128-136 (2008).
  13. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat Methods. 5, 695-702 (2008).
  14. Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: applications to membrane dynamics. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 26, 373-399 (1997).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Single molecule FluorescenceTIRF MicroscopyReceptor DynamicsReceptor ComplexesTransient InteractionsParticle TrackingMixed Gaussian FittingDiffusion CoefficientsOrganic FluorophoresCover Slip Cleaning

Powiązane artykuły