W tym protokole wideo śledzimy - z dużą prędkością i w trzech wymiarach - fluorescencyjnie znakowane lizosomy w żywych komórkach, używając metody śledzenia orbitalnego w zmodyfikowanym mikroskopie dwufotonowym.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Śledzenie orbitalne 3D w zmodyfikowanym mikroskopie dwufotonowym: zastosowanie do śledzenia pęcherzyków wewnątrzkomórkowych
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Celem tego protokołu wideo jest omówienie sposobu przeprowadzenia i analizy trójwymiarowego eksperymentu z fluorescencyjnym śledzeniem cząstek orbitalnych przy użyciu zmodyfikowanego mikroskopu dwufotonowego1. W przeciwieństwie do konwencjonalnych podejść (skanowanie rastrowe lub szerokie pole oparte na stosie klatek), śledzenie orbitalne 3D pozwala zlokalizować i śledzić z wysoką rozdzielczością przestrzenną (10 nm) i czasową (pasmo przenoszenia 50 Hz) przemieszczenie 3D poruszającej się cząstki fluorescencyjnej w skali długości setekmikronów2. Metoda opiera się na algorytmie sprzężenia zwrotnego, który steruje sprzętem dwufotonowego laserowego mikroskopu skaningowego w celu wykonania kołowej orbity wokół śledzonego obiektu: mechanizm sprzężenia zwrotnego utrzyma obiekt fluorescencyjny w środku, kontrolując przemieszczenie wiązki skanującej3-5. Aby zademonstrować zalety tej techniki, obserwowaliśmy szybko poruszającą się organellę, lizosom, w żywej komórce6,7. Komórki posiano zgodnie ze standardowymi protokołami i barwiono przy użyciu dostępnego na rynku barwnika lizosomowego. Omówimy pokrótce konfigurację sprzętową i bardziej szczegółowo oprogramowanie sterujące, aby przeprowadzić eksperyment śledzenia orbitalnego 3D wewnątrz żywych komórek. Szczegółowo omawiamy parametry wymagane do sterowania mikroskopem skaningowym i umożliwienia ruchu wiązki w zamkniętej orbicie wokół cząstki. Kończymy, pokazując, w jaki sposób ta metoda może być skutecznie wykorzystana do śledzenia szybkiego ruchu znakowanego lizosomu wzdłuż mikrotubul w 3D w żywej komórce. Lizosomy mogą poruszać się z prędkościami w zakresie 0,4-0,5 μm/s, zwykle wykazując skierowany ruch wzdłuż sieci mikrotubul8.
Wprowadzenie
Do tej pory opracowano wiele podejść do śledzenia cząstek fluorescencyjnych w trzech wymiarach za pomocą mikroskopu. Większość podejść opiera się na użyciu szybkich kamer, idealnie nadających się do śledzenia w dwóch wymiarach, zwykle w połączeniu z niestandardowymi modyfikacjami optyki emisyjnej mikroskopu w celu uzyskania śledzenia w kierunku osiowym. Laserowe mikroskopy skaningowe (konfokalne lub dwufotonowe) mogą konwencjonalnie śledzić cząstkę fluorescencyjną, wykonując sekwencję czasową stosów z, chociaż proces ten jest zwykle czasochłonny i daje rozsądną rozdzielczość czasową (10 Hz) tylko wtedy, gdy śledzona cząstka jest utrzymywana w środku małego obszaru obrazowania rastrowego przez aktywny mechanizm sprzężenia zwrotnego2.
Idea unieruchomienia cząstki jest podstawą metody śledzenia orbitalnego. Zamiast skanowania rastrowego wykonywana jest kołowa orbita wokół cząstki fluorescencyjnej. Intensywność fluorescencji wzdłuż orbity precyzyjnie lokalizuje położenie cząstki4.
Zlokalizowana pozycja cząstki może być następnie wykorzystana do uruchomienia skanerów mikroskopowych i ponownego wyśrodkowania orbity na pozycji cząstki. Skanery galwanometryczne mikroskopu są napędzane napięciem analogowym. Składowa prądu przemiennego tego napięcia pozwala na wykonanie orbity za pomocą skupionej wiązki laserowej, tzn. fala sinusoidalna i cosinusoidalna przyłożone do zwierciadeł skanujących X i Y pozwoli na wykonanie orbity kołowej. Przesunięcie sygnału DC ułatwia zmianę położenia środka orbity. Po określeniu okresu orbitalnego i skonfigurowaniu kształtu fali dla sygnału AC, system sprzężenia zwrotnego musi zaktualizować tylko składową DC sygnału.
Oprogramowanie zdolne do odczytu sygnału fluorescencyjnego zebranego z detektorów jest wymagane do sterowania skanerami i detektorami, do obliczania pozycji cząstki i aktualizowania przesunięcia DC. Aby obrazowanie ze sprzężeniem zwrotnym zakończyło się sukcesem, wymagany jest staranny dobór parametrów orbity (rozmiar i czas), a parametry te muszą być dostosowane w oparciu o charakterystykę cząstek fluorescencyjnych, które należy śledzić.
Fizyczne i matematyczne podstawy tej techniki zostały opisane w ostatnich4,5 zarówno dla zastosowań 2D, jak i 3D. W tym protokole pokrótce opisujemy główne komponenty sprzętowe układu, a bardziej szczegółowo wybór parametrów i przygotowanie próbki wymagane do typowego eksperymentu, co pozwala nam śledzić przemieszczenie lizosomu w wysokiej rozdzielczości czasowej w żywej komórce.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie próbki
- Utrzymuj komórki CHOK1 w kolbach do hodowli tkankowych za pomocą DMEM uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą i 100 I.U/ml penicyliny, 50 μg/ml streptomycyny. Inkubować komórki w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
- Zbierz, a następnie umieść komórki CHOK1 w mikrodołku o średnicy 14 mm i grubości powierzchni 0,16 mm. Komórki nasienne dla optymalnej gęstości do obrazowania, około 60-70% konfluencji.
- Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Umyj komórki trzykrotnie w HBSS (Hank Buffered Saline Solution) i inkubuj komórki w roztworze zawierającym 50 nM Lysotracker DND26 green i 150 nM tubuliny tracker green. Inkubować komórki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Etap opcjonalny: Przed inkubacją należy wykonać dodatkowe barwienie barwnikiem barwiącym macierz mitochondrialną (25 nM).
- Umyj komórki trzy razy w HBSS, aby usunąć niezwiązany barwnik. Dodaj świeżą pożywkę wzrostową DMEM przed obrazowaniem komórek.
2. Konfiguracje mikroskopów
Mikroskop do śledzenia cząstek opisany w protokole wideo jest zamontowany na ramie dostępnego na rynku mikroskopu odwróconego (Rysunek 4). Jednak komercyjne moduły do śledzenia cząstek orbitalnych 3D są już dostępne.
- Użyj źródła światła wzbudzenia laserem femtosekundowym Coherent Chameleon-Ultra II Ti:Sa o regulowanej długości fali wyjściowej w zakresie od 690 nm do 1,040 nm.
- Upewnij się, że wiązka laserowa jest wyrównana w tylnym porcie mikroskopu za pomocą luster pokrytych podczerwienią. Wiązka laserowa jest tłumiona za pomocą obracającej się płytki półfalowej, po której następuje kalcytowy polaryzator liniowy. Osłabij wiązkę tak, aby średnia moc na próbce wynosiła od 0,5 do 2 mW.
UWAGA: Wiązka laserowa jest odbijana przez parę luster uruchamianych silnikiem galwanometrycznym, które umożliwiają kontrolę położenia i trajektorii skupionej wiązki w płaszczyźnie próbki. W typowej konfiguracji skolimowana wiązka laserowa wychodząca ze zwierciadeł galwanometru jest rozszerzana (10X) przechodząc przez ekspander wiązki, zanim wejdzie do tylnej części obiektywu mikroskopu po odbiciu od krótkoprzepustowego zwierciadła dichroicznego. - Zbierz światło fluorescencyjne z próbki, umieszczając obiektyw wodny o dużej aperturze numerycznej (60X, NA 1,2) na ścieżce światła. Wybierz kostkę filtra fluorescencyjnego zgodnie z żądanymi długościami fal emisji w konfiguracji jedno- lub dwukanałowej. Zastosuj filtry pasmowoprzepustowe emisji, aby dodatkowo wybrać zakres widmowy emitowanej fluorescencji.
- Umieść próbkę na zmotoryzowanym stoliku i wyreguluj precyzyjny ruch obiektywu mikroskopu za pomocą piezokontrolera obiektywu.
- Skieruj światło z kostki filtrującej do fotopowielaczy, gdzie sygnał jest rozróżniany i wysyłany do cyfrowej karty akwizycji danych I/O.
UWAGA: Przebiegi generowane komputerowo są wyjściem analogowym karty I/O i są dostarczane do elektroniki sterującej skanera. Sygnał wejściowy zliczający fotony z fotopowielaczy oraz sygnał wyjściowy do skanerów są mierzone i kontrolowane za pomocą karty I/O przez oprogramowanie Laboratorium Dynamiki Fluorescencji SimFCS.
3. Obrazowanie
- Umieść komórki na stole montażowym i ustaw ostrość za pomocą oświetlenia światłem przechodzącym.
- Przełącz się na obrazowanie rastrowe, aby zidentyfikować komórki, które włączyły barwnik, i uwidocznić leżące pod nimi mikrotubule. Zidentyfikuj początkowy obszar, w którym występuje ruch pęcherzyków.
- Po zidentyfikowaniu izolowanego pęcherzyka ustaw następujące parametry śledzenia orbitalnego:
- Wybierz promień orbity, aby zdefiniować rozmiar okrągłego skanowania w zależności od rozmiaru śledzonej cząstki. W przypadku emitera punktowego ustaw promień orbity równy talii funkcji rozproszenia punktów (PSF) wiązki wzbudzenia, aby zmaksymalizować czułość i odpowiedź.
- Ustaw odległość osiową, aby zdefiniować odległość między dwiema orbitami, które są wykonywane w celu zlokalizowania położenia cząstek wzdłuż kierunku osiowego. Ustaw odległość osiową na 1,5-3 razy talię PSF.
- Zdefiniuj czas przebywania zgodnie z jasnością cząstki, aby ustawić czas spędzony w każdym punkcie orbity, który określi również szybkość fotowybielania. Czas przebywania wynosi od 10 do 100 μs.
- Ustaw liczbę punktów na każdej orbicie na 64 lub 128, aby uzyskać okresy orbity rzędu 4-32 ms i zapewnić wysoką rozdzielczość czasową do określania położenia cząstek.
- Zmień sygnał przesunięcia prądu stałego wysyłany do luster w celu wyśrodkowania wiązki na cząstce za pomocą graficznego interfejsu użytkownika za pomocą wyboru kursora na zeskanowanym obrazie rastrowym.
- Rozpocznij śledzenie, przełączając tryb mikroskopu z obrazowania rastrowego na skanowanie orbitalne.
- Aktywuj zbieranie informacji zwrotnych i danych.
4. Analiza trajektorii
- Użyj oprogramowania, aby wyświetlić fluorescencję zebraną w każdym punkcie na orbicie i w każdym punkcie czasowym w postaci "dywanu intensywności". Intensywność zebrana wzdłuż dywanu dostarcza informacji na temat interakcji cząstki z innymi jasnymi obiektami. Użyj oprogramowania, aby wyświetlić zarówno informacje o trajektorii (tj. przemieszczenie prądu stałego w czasie skanerów x,y i z-piezo), jak i intensywność fluorescencji zebraną z lampy fotopowielacza w czasie w postaci szeregów czasowych.
- Użyj reprezentacji szeregów czasowych i informacji o "dywanie intensywności", aby wybrać tylko obszar zainteresowania na trajektorii.
- Użyj oprogramowania, aby wyświetlić projekcję 2D wybranej części trajektorii cząstek. Wybierz odpowiednie elementy sterujące, aby oznaczyć kolorami trajektorię zgodnie z intensywnością fluorescencji cząstek.
- Wybierz opcję, aby wyświetlić trajektorię cząstek w 3D i oznaczyć ją kolorami zgodnie z intensywnością fluorescencji. Obróć trajektorię w 3D za pomocą elementów sterujących, aby zobrazować cechy ruchu lizosomu wzdłuż mikrotubul .
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zgodnie z niniejszym protokołem, szybkie śledzenie pojedynczych cząstek w 3D można przeprowadzić wewnątrz żywych komórek przy użyciu zmodyfikowanego mikroskopu dwufotonowego, aby śledzić przemieszczanie się znakowanych fluorescencyjnie lizosomów. Wykonany eksperyment polega na śledzeniu odizolowanego lizosomu poruszającego się wewnątrz komórki po procesie dojrzewania endosomów9. Lizosomy zabarwiono zielonym barwnikiem fluorescencyjnym i wzbudzono przy 930 nm, wykorzystując wzbudzenie dwufotonowe. Nasze dane wy...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Pomimo ogromnego postępu w technikach i oprzyrządowaniu mikroskopii fluorescencyjnej w ciągu ostatnich lat, osiągnięcie trajektorii cząstek fluorescencyjnych w trzech wymiarach z wysoką rozdzielczością czasową pozostało wyzwaniem w tej dziedzinie. Jeśli osiągnięto wysoką rozdzielczość czasową śledzącą cząstki w dwóch wymiarach, rozszerzenie do kierunku osiowego zwykle powoduje drastyczne zmniejszenie charakterystyki częstotliwościowej systemu10.
W tym protokole wideo skupiliśmy się ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ten projekt był wspierany przez granty NIH NIGMS 8P41 GM103540-28 i P50-GM076516
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Lysotracker DND 26 | Life Technologies | L-7526 | |
| Lokalizator rurowy Green | Life Technologies | T34075 | |
| Mitotracker RED | Life Technologies | M7512 | |
| Koherentny melon- ultra II TI | Koherentny | ||
| Glan Taylor Kalcytowy polaryzator | Melles Griot | 03PTA001 | |
| Lustro z silnikiem galwanometrycznym | Cambridge Technologies | M 6350 | |
| Lustro dichroiczne | Chroma Technologies | 700 DCSPXR | |
| Stopień zmotoryzowany | ASI | MS2000 | |
| Piezo | PI | P721-LLQ | |
| Lampa fotopowielacza | Hamamatsu | H7422P-40 | |
| Karta akwizycji danych | IO tech | PCI 1128-4000 | |
| Oprogramowanie do obrazowania | LFD | Global dla obrazów-SimFCS |
Bibliografia
- So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. Two photon excitation fluorescence microscopy. Annu Rev Biomed Eng. 2, 399-429 (2000).
- Dupont, A., Lamb, D. C. Nanoscale three dimensional single particle tracking. Nanoscale. 3, 4532-4541 (2011).
- Estrada, L. C., Gratton, E. 3D nanometer images of biological fibers by directed motion of gold nanoparticles. Nano Lett. 11, 4656-4660 (2011).
- Kis-Petikova, K., Gratton, E. Distance measurement by circular scanning of the excitation beam in the two photon microscope. Microscopy Research and Technique. 63, 34-49 (2004).
- Levi, V., Ruan, Q., Gratton, E. 3 D particle tracking in a two photon microscope application to the study of molecular dynamics in cells. Biophys J. 88, 2919-2928 (2005).
- Lund, F. W., Wustner, D. A comparison of single particle tracking and temporal image correlation spectroscopy for quantitative analysis of endosome motility. Journal of Microscopy. 252, 169-188 (2013).
- Nath, S., et al. Spreading of Neurodegenerative Pathology via Neuron to Neuron Transmission of beta Amyloid. Journal of Neuroscience. 32, 8767-8777 (2012).
- Balint, S., Vilanova, I. V., Alvarez, A. S., Lakadamyali, M. Correlative live cell and superresolution microscopy reveals cargo transport dynamics at microtubule intersections. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 3375-3380 (2013).
- Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. Embo Journal. 30, 3481-3500 (2011).
- Ragan, T., So, P. T., Kwon, H. S., Gratton, E. 3D particle tracking on the two photon microscope. Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences. 2, 247-258 (2001).
- Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two photon microscopes. Optics Letters. 22, 135-136 (1997).
- Caviston, J. P., Holzbaur, E. L. Microtubule motors at the intersection of trafficking and transport. Trends Cell Biol. 16, 530-537 (2006).
- Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. Capturing directed molecular motion in the nuclear pore complex of live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9863-9868 (2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
