Produkcja i izolacja aksonów z neuronów czuciowych do analizy biochemicznej przy użyciu filtrów porowatych

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje system hodowli neuronów, który może być używany do uzyskiwania dużych ilości czystych próbek aksonalnych do analiz biochemicznych i immunocytochemicznych. Technika ta pozwoli na lepsze zrozumienie prawidłowej fizjologii aksonów i szlaków sygnałowych prowadzących do neurodegeneracji.

Streszczenie

Aksony neuronalne wykorzystują specyficzne mechanizmy do pośredniczenia w rozciągłości, utrzymywania integralności i wywoływania degeneracji. Odpowiednia równowaga tych zdarzeń jest niezbędna do kształtowania funkcjonalnych obwodów neuronalnych. Opisany tutaj protokół wyjaśnia, w jaki sposób używać wkładek do hodowli komórkowych z porowatą membraną (filtrem) w celu uzyskania dużych ilości czystych preparatów aksonalnych nadających się do badania konwencjonalnymi technikami biochemicznymi lub immunocytochemicznymi. Funkcjonalność tych wkładów filtracyjnych zostanie zademonstrowana na modelach przycinania rozwojowego i zwyrodnienia Wallera, z wykorzystaniem eksplantatów zarodkowego zwoju korzenia grzbietowego. Integralność i funkcja aksonów jest zagrożona w wielu różnych patologiach neurodegeneracyjnych. Rzeczywiście, obecnie jest jasne, że dysfunkcja aksonów pojawia się znacznie wcześniej w przebiegu choroby niż utrata somy neuronalnej w kilku chorobach neurodegeneracyjnych, co wskazuje, że procesy specyficzne dla aksonów są przede wszystkim ukierunkowane na te zaburzenia. Uzyskując czyste próbki aksonów do analizy technikami molekularnymi i biochemicznymi, technika ta może rzucić nowe światło na mechanizmy regulujące fizjologię i patofizjologię aksonów. To z kolei będzie miało wpływ na nasze zrozumienie procesów, które napędzają choroby zwyrodnieniowe układu nerwowego.

Wprowadzenie

Kompartment aksonalny neuronów wykazuje duży stopień funkcjonalnej niezależności od przedziału somato-dendrytycznego. W neuronach projekcyjnych aksony zawierają większość białka neuronalnego^1,2. Badania nad fizjologią i patofizjologią aksonów nabrały rozpędu w społeczności neuronaukowej, ponieważ ostatnie badania wykazały, że wczesna dysfunkcja aksonów wydaje się być powszechną cechą chorób neurodegeneracyjnych i zaburzeń neuropsychiatrycznych³. Wydaje się prawdopodobne, że lepsze zrozumienie mechanizmów wyłączności aksonalnej w normalnych i patologicznych warunkach rzuci światło na wczesne zdarzenia, które napędzają dysfunkcję.

Obecny protokół opisuje, jak używać wkładek hodowlanych z porowatą membraną (filtrem) do uzyskania dużych ilości czystego materiału aksonalnego, który nadaje się do analiz biochemicznych i immunocytochemicznych. Zastosowanie wkładek filtracyjnych do badania biologii aksonów zostało po raz pierwszy wdrożone przez Stewarda i współpracowników⁴ i dalej rozwijane przez Twiss i współpracowników⁵ do obecnej konfiguracji. Technika ta jest obecnie stosowana przez grupy badające różne aspekty biologii aksonów i dendrytów, z niewielkimi modyfikacjami w każdym przypadku, aby dostosować się do populacji badanych neuronów, wykonanych zabiegów i rodzaju zastosowanych analiz biochemicznych^6-9. Obecny protokół nie ma na celu uwzględnienia wszystkich alternatyw dla tak różnorodnych zastosowań, ale raczej zapewnia proste podejście, które jest odpowiednie dla większości zastosowań. W szczególności opisany tutaj protokół wykorzystuje potrójną powłokę, która maksymalizuje wydajność aksonów do analiz biochemicznych i jest najbardziej odpowiednia do badania zwyrodnienia aksonów – inne powłoki opisane w literaturze wytwarzały mniej aksonów, które cofają się i degenerują szybciej, gdy są pozbawione czynników troficznych⁹.

W tej procedurze, ciała komórek nerwowych pozostają odizolowane na górze filtra, podczas gdy aksony przechodzą przez pory i rosną wzdłuż jego dolnej powierzchni. Czyste aksony (wolne od zanieczyszczeń gleju i komórek nerwowych), które rosną na dolnej powierzchni filtra, mogą być zbierane do analiz biochemicznych lub mogą być utrwalane in situ i badane za pomocą technik immunocytochemicznych⁹. Zabieg polega na wykorzystaniu embrionalnych neuronów czuciowych ze zwojów korzenia grzbietowego (DRG). Embrionalne DRG są szeroko stosowane do badania biologii aksonów, ponieważ neuryty z tych komórek ulegają szybkiemu i silnemu wzrostowi in vitro, gdy są utrzymywane we czynniku wzrostu nerwów (NGF), a także dlatego, że szybko ulegają zwyrodnieniu, gdy są pozbawione tego czynnika. Ponadto neurony DRG nie mają dendrytów, więc wszystkie neuryty zebrane tą metodą są czysto aksonami.

Wkłady filtrujące stanowią wielką zaletę w porównaniu z innymi podejściami stosowanymi do badania aksonów. Badania opierające się na wykorzystaniu mikroskopii do różnicowania procesów zachodzących w somie komórkowej od procesów zachodzących w aksonach dostarczają ograniczonych informacji biochemicznych. Innym przykładem mogą być systemy hodowli z podziałem na przedziały (np. komory Campenota10 lub urządzenia mikroprzepływowe¹¹) są przydatne w metodach obrazowania i do zróżnicowanego traktowania przedziałów komórkowych, ale dostarczają tylko niewielkie ilości materiału aksonalnego, co wyklucza stosowanie tych technik do analiz biochemicznych, które wymagają stosunkowo dużych ilości próbki. Ponadto ich stosowanie wymaga znacznego przeszkolenia, a także specjalistycznych urządzeń i jest czasochłonne. Innym podejściem często stosowanym do izolowania aksonów z eksplantatów jest ręczne usunięcie centrum eksplantatu (zawierającego ciała komórek nerwowych) przed pobraniem próbki aksonalnej. Chociaż może to spowodować wytworzenie dużych ilości preparatów wzbogaconych w aksony, aksony w tym preparacie mogą być otoczone glejem, a szybkie usunięcie 20 ciał eksplantatów kolejno z 6 dołków (jako przykład minimalnego eksperymentu) jest czasochłonne i na granicy wykonalności.

Dla kontrastu, przedstawiona tutaj metoda daje obfite i czyste preparaty aksonalne, które mogą być następnie analizowane za pomocą praktycznie każdej techniki biochemicznej, która jest powszechnie używana do analizy lizatów całokomórkowych, takich jak western blot, immunoprecypitacja⁶, northern blot⁵, spektrometria mas⁶, oczyszczanie RNA^7,12,13, między innymi. Co więcej, protokół może być stosowany do technik immunofluorescencji (IF), ponieważ możliwe jest utrwalenie aksonów rosnących w dolnej części filtra w celu ich dalszego zbadania za pomocą IF. Takie podejście znacznie ułatwia analizę procesów specyficznych dla aksonów, ponieważ w końcowym preparacie nie ma ciał komórkowych. Jest to istotna zaleta, ponieważ wysoki sygnał immunofluorescencyjny z ciał komórkowych często podważa badanie i analizę słabszego sygnału pochodzącego z cienkich struktur, takich jak aksony.

Opisano dwa zastosowania metody hodowlanej do badania zwyrodnienia aksonów; model przycinania rozwojowego oraz model degeneracji wywołanej kontuzją (powszechnie określany jako degeneracja Wallera). Modelowanie przycinania rozwojowego opiera się na fakcie, że neurony czuciowe in vivo konkurują o ograniczenie ilości docelowego NGF, a te, które nie otrzymują wystarczającego wsparcia neurotroficznego, ulegają degeneracji^. Zjawisko to można naśladować w embrionalnych hodowlach DRG poprzez wycofanie NGF z pożywki hodowlanej, co, jak to ma miejsce in vivo, inicjuje degenerację aksonów, a następnie zniszczenie ciała komórki. Aby modelować zwyrodnienie Wallera, górna strona filtra z korpusami komórek jest zeskrobywana. Aksony, które wyrosły na dolnej stronie filtra, zostają fizycznie oddzielone od ciał komórkowych, a następnie przechodzą szybki i stereotypowy proces zwyrodnieniowy znany jako degeneracja^Wallera15, nazwany tak na cześć A. Wallera, który jako pierwszy opisał to zjawisko w 1850 roku.

Protokół

UWAGA: Poniższe procedury są zgodne z wytycznymi zatwierdzonymi przez Kanadyjską Radę Opieki nad Zwierzętami. Dokłada się wszelkich starań, aby zminimalizować ból i stres zwierząt podczas zabiegów.

1. Powłoka filtrów

UWAGA: Gdy wkłady filtrów hodowlanych są umieszczane w studzienkach płytek wielodołkowych, definiowane są dwie komory: górna komora to obszar powyżej wkładki, a dolna komora to ta poniżej wkładki Rysunek 1A.a-b. Eksplantaty wysiewa się w górnej komorze, gdzie mocuje się do górnej strony filtra; wiele aksonów przerasta filtr i rozciąga się na dolnej stronie filtra, w dolnej komorze Rysunek 1A.c. Standardowe objętości robocze (tj. do nakładania roztworu do powlekania, płukania, pożywek hodowlanych itp.) wynoszą 2 ml dla dolnej komory i 1 ml dla górnej komory i będą określane w protokole jako "objętości standardowe". Dodawać roztwory, zaczynając od dolnej komory, umieszczając końcówkę pipety w szczelinie między wkładką a bokiem studzienki. Należy również przechylić wkładkę na bok podczas dozowania roztworu, aby zapobiec uwięzieniu pęcherzyków na dnie filtra.

1. Rozpocznij powlekanie filtrów dzień przed poszyciem. Pod sterylnym kapturem do hodowli tkanek umieść wkłady filtrujące o średnicy 24 mm w 6-dołkowej płytce odbiorczej. Inkubować wstawki z poli-D-lizyną w wodzie (1 mg/ml) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, używając standardowych objętości: 2 ml w dolnej komorze i 1 ml w górnej.
2. Odessać poli-D-lizynę i spłukać raz wodą. Zassać wodę, zamknąć pokrywę i pozostawić talerze do wyschnięcia w okapie O/N. Podczas zasysania cieczy należy usunąć resztki cieczy, które zostają uwięzione bezpośrednio pod filtrem.
3. Następnego ranka rozcieńczyć lamininę w wodzie (10 μg/ml), wymieszać i ogrzać w temperaturze 37 °C. Inkubować wkładki z lamininą przez 1 godzinę w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C, używając standardowych objętości.
4. Odessać lamininę i dodać kolagen do wody (0,1 mg/ml) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. W takim przypadku użyj 2 ml na dolną komorę i 2 ml na górną komorę.
5. Odessać kolagen i przemyć raz sterylną wodą. Filtry są teraz gotowe do przyjęcia pożywek hodowlanych i eksplantatów DRG, zgodnie z opisem w KROKU 3.

2. Sekcja eksplantatów embrionalnego zwoju korzenia grzbietowego (DRG)

1. Znieczulić samicę myszy w 13-dniowej ciąży przez wstrzyknięcie IP Avertin (250 mg/kg). Odczekaj 10-15 minut i sprawdź, czy nie ma odruchów odstawienia rogówki i pedału. Gdy odruchy są nieobecne, wykonaj zwichnięcie szyjki macicy.
2. Zdezynfekuj wszystkie narzędzia chirurgiczne i kobiecy brzuch 70% etanolem. Pozostaw instrumenty do wyschnięcia. Przytrzymaj skórę brzucha i przetnij warstwy skóry i mięśni, aby odsłonić jamę brzuszną.
3. Usuń macicę, odłączając ją od szyjki macicy i jajników. W sterylnym kapturze usuń zarodki z macicy nożyczkami i zbierz je na szalce Petriego wypełnionej lodowatą pożywką L15. Przechowywać na lodzie.
   UWAGA: Zapoznaj się z poprzednimi raportami technicznymi, aby uzyskać więcej informacji na temat tego, jak uzyskać zarodki w 13 dniu ciąży^17,18.
4. Pod mikroskopem połóż zarodek na boku i użyj małych sprężynowych nożyczek, aby usunąć głowę. Wykonaj nacięcie wzdłuż bocznych boków, aby odrzucić klatkę piersiową, brzuch, kończyny i ogon. Trzymaj plecy zawierające kręgosłup, połóż brzuszną stroną do góry i usuń wszystkie narządy trzewne.
5. Za pomocą małych nożyczek sprężynowych odsłoń cały rdzeń kręgowy, przecinając kręgosłup od jego brzusznej strony wzdłuż linii środkowej. Przytrzymaj tuszę jedną parą kleszczy (#3) i użyj drugiej pary, aby przytrzymać rdzeń kręgowy za jego najbardziej rostralny aspekt.
6. Powoli i delikatnie odciągnij pępowinę od jamy kręgowej i ściśnij DRG z rdzenia kręgowego za pomocą ultracienkich kleszczy (#7). Pogrupuj DRG do zebrania na dnie naczynia.
7. Zbierz zgrupowane DRG, zasysając końcówką do pipety o pojemności 200 μl, która została przycięta w celu powiększenia jej otworu. Umieść DRG w tubie i pozostaw na lodzie, aż zbiór DRG zostanie zakończony.
   UWAGA: Preferowane są białe/przezroczyste końcówki, ponieważ DRG nie przyklejają się do ścianek tej końcówki (w porównaniu ze standardowymi żółtymi końcówkami). Przepłukanie końcówek mediami przed użyciem dodatkowo zapobiega przywieraniu DRG do ścianek.

3. Siew i pielęgnacja eksplantatów zwojów korzenia grzbietowego na filtrach

1. Dodać kompletne media DRG w temperaturze 37 °C do powlekanych wkładek przy użyciu standardowych objętości. Uzupełnij dolną pożywkę komory o 15 ng/ml NGF, zachowując jednocześnie górną komorę wolną od NGF.
   UWAGA: Chociaż NGF skutecznie dyfunduje po filtrze, a jego stężenie równoważy się w ciągu kilku godzin, zaobserwowaliśmy, że zastosowanie NGF do dolnej komory bezpośrednio przed wysiewem znacznie zwiększa wydajność aksonów na dolnej powierzchni filtra.
2. Przenieś DRG z probówki do filtrów za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl z końcówką przyciętą w celu powiększenia jej otworu.
3. Narysuj media do końcówki 2-3 razy przed zebraniem DRG. Zapobiega to ich przywieraniu do wewnętrznej strony końcówki. Ta sama końcówka może być ponownie użyta do wszystkich studni. Zastosowanie bezbarwnych końcówek (w porównaniu ze standardowymi niebieskimi końcówkami) zmniejsza przywieranie DRG do powierzchni szczytówki.
4. Aby przenieść DRG, ustaw pipetę na 800 μl. Zassaj około 200 μl pożywki z górnej części filtra, a następnie przejdź do probówki zawierającej DRG i odpipetuj niewielką objętość w górę iw dół – aby ponownie zawiesić DRG, które opadły na dno. Zassać całą objętość i odpipetować DRG, zanurzając końcówkę w środku wkładu.
5. Po załadowaniu wszystkich wkładek zamknij pokrywę talerza i zakręć płytką 10 razy, delikatnie stukając nią w ławkę okapu między każdym zawirowaniem. Ruchy te zwiększają wydajność aksonalną, pomagając eksplantatom DRG zatonąć i przyczepić się do filtra. Pomaga to również w równomiernym rozprowadzeniu eksplantatów, dzięki czemu aksony z różnych eksplantatów nie nakładają się na siebie.
   UWAGA: Procedura wysiewu eksplantacji opisana w poprzednich krokach znacznie zwiększa ogólny stopień przylegania eksplantacji do podłoża (do 75%). Co najważniejsze, procedura pipetowania z łatwością zapobiega unoszeniu się eksplantatów na powierzchni podłoża zamiast opadania na dno wkładu.
6. Do analiz biochemicznych wysiewa DRG z jednego zarodka (około 30) na filtr. Do analiz morfologicznych należy użyć połowy lub jednej trzeciej DRG z jednego zarodka (10-15). Decyzja ta musi zostać podjęta przed zebraniem DRG do probówek, tak aby wszystkie DRG probówki zostały wysiane do jednego dołka (niezależnie od tego, czy jest to 30, 15 czy 10 DRG).
7. Hodowle należy utrzymywać w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C, zmieniając pożywkę co 2-3 dni. Aby zmienić nośnik, najpierw zassaj górną komorę, a następnie dolną komorę. Dodaj świeże nośniki w standardowych ilościach, zaczynając od dolnej komory.
   UWAGA: Aby zapobiec wysychaniu komórek/aksonów, nie należy zmieniać podłoża w więcej niż 3 wkładkach jednocześnie. DRG wyhodowane na filtrach w obecności NGF rozciągną długie aksony, osiągając do 2 mm po 2 dniach w hodowli.

4. Leczenie odstawienia czynnika troficznego

Wycofanie NGF wywołuje zwyrodnienie aksonów z fragmentacją aksonów (określoną przez kontrast fazowy i β-III-tubulinę IF), która pojawia się po raz pierwszy około 12 godzin po odstawieniu. Całkowite rozdrobnienie osiąga się po 36 godzinach. To, jak długo degeneracja ma postępować, musi zostać wybrane przez użytkownika końcowego zgodnie z projektem eksperymentalnym.

1. Po 2-dniowej fazie wydłużania aksonów zmień pożywkę z górnych i dolnych przedziałów na pożywkę, która nie zawiera NGF i zawiera przeciwciała anty-NGF (1 μg/ml), aby sekwestrować pozostały (lub endogennie wytwarzany) NGF.
2. Umieścić płytki z powrotem w inkubatorze komórkowym (37 °C), aby umożliwić zwyrodnienie wywołane odstawieniem NGF przez pożądany czas.
3. Przejdź do ekstrakcji białka (krok 6) w celu zbadania za pomocą western blot lub bezpośrednio zbadaj filtry za pomocą IF (krok 7).

5. Przecięcie aksonów w celu wywołania zwyrodnienia Wallera

Ta procedura pozostawia aksony na dolnej stronie filtra odłączone od ciała komórki, ale poza tym nienaruszone. Następnie aksony te szybko inicjują degenerację Wallera. Fragmentacja aksonów (objawiona kontrastem fazowym lub β-III-tubuliną IF) pojawia się po raz pierwszy po 3 godzinach od przecięcia; Po 9 godzinach aksony są całkowicie rozdrobnione i odłączane od filtra. To, jak długo degeneracja ma postępować, musi zostać wybrane przez użytkownika końcowego zgodnie z projektem eksperymentalnym.

1. Zeskrob górną stronę filtra, zawierającą wyhodowane eksplantaty DRG, za pomocą skrobaka do komórek. Zapewnić całkowite usunięcie materiału wierzchniego, przesuwając skrobak w kierunkach X, Y i okrężnym.
2. Wyrzucić pożywkę z górnej komory zawierającej pływające eksplantaty, które zostały zeskrobane z filtra i zastąpić ją 1 ml wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki DRG zawierającej NGF (10 ng/ml).
3. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze komórkowym (37 °C), aby umożliwić zwyrodnienie Wallera przez czas wybrany przez użytkownika końcowego.
4. Przejdź do ekstrakcji białka (krok 6) w celu zbadania za pomocą western blot lub bezpośrednio zbadaj filtry za pomocą IF (krok 7).

6. Ekstrakcja białek z próbek aksonalnych

1. Napełnić probówki zbiorcze (1,5 ml) 75 μl buforu do próbek Laemmli. Trzymaj probówki na lodzie podczas zbierania aksonów z całego zestawu filtrów.
2. Umyj filtr eksplantatami DRG w PBS i zeskrob górną stronę filtra. Wyjmij wkład z płytki, wyczyść górną stronę filtra za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką i odessaj nadmiar PBS z górnej i dolnej strony.
3. Umieść wkład do góry nogami na ławce i wytnij filtr z wkładu za pomocą ostrego skalpela. Trzymaj filtr kleszczami, od dołu do góry. Wykonaj cięcie nożyczkami od obwodu do środka filtra.
4. Umieść filtr na górze rurki zbiorczej i za pomocą kleszczyków dociśnij środek filtra w dół rurki. Robiąc to, powinien powstać lejek. Wsunąć filtr w kształcie lejka na dno probówki, tak aby był zanurzony w buforze próbki Laemmli.
5. Zakończ ekstrakcję białka, gotując probówki przez 4 minuty. Wyjmij filtr za pomocą kleszczyków, aby umieścić go do góry nogami w górnej części probówki i wykonując krótkie wirowanie (2,000 x g przez 15 sekund). Wyrzuć wysuszone filtry.
6. Rozpuść 10 μl preparatu białka aksonalnego w SDS-PAGE, a następnie Western blot w celu wykrycia interesujących białek.
   UWAGA: Dla porównania, preparat aksonalny z 20 eksplantatów hodowanych przez 2 dni i zlizowanych w 100 μl buforu do lizy RIPA będzie miał stężenie białka 4-6 μg/μl.

7. Badanie immunofluorescencyjne aksonów na filtrach

Poniższe kroki opisują ogólne manipulacje w celu przeprowadzenia barwienia IF na wkładach filtrujących, czego przykładem jest wykrycie β-III-tubuliny. Utrwalacz, czasy inkubacji, stężenia i inne szczegóły powinny być zoptymalizowane dla innych par antygen-przeciwciało.

1. Użyć wcześniej używanych płytek 6-dołkowych, dokładnie oczyszczonych, do kolejnych płukań i inkubacji wkładek.
2. Krótko umyj wkładki w PBS. Umieść je w świeżo przygotowanym 4% paraformaldehydzie w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej na shakerze.
3. Po zamocowaniu zeskrob i wyczyść górną stronę wkładu, aby zebrać aksony, które rosły wyłącznie na dolnej powierzchni filtra. Kontynuuj standardowe inkubacje dla IF.
4. Inkubować wkładki w roztworze blokującym (TBS, 0,05% Tween 20, 5% mleka odtłuszczonego), używając standardowych objętości, przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.
5. Przenieść inserty do przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w buforze blokującym (anty-β-III-tubulina, 1:5 000), używając standardowych objętości. Inkubować O/N (~18 godzin) w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając.
6. Przemyć pierwsze przeciwciało dwukrotnie w PBS (2 X 10 min w suchym toarze).
7. Przenieś inserty do fluorescencyjnie sprzężonych przeciwciał drugorzędowych rozcieńczonych w buforze blokującym (kozi anty-mysz, 1:2,000), używając standardowych objętości. Inkubować pod przykryciem od światła przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.
8. Przemyć przeciwciało drugorzędowe 3x w PBS (3 x 10 min w temperaturze pokojowej).
9. Po zakończeniu IF wyjmij wkładkę, wylej PBS z ostatniego prania i wyczyść górną stronę filtra za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką. Zassać płyn od góry i od dołu.
10. Umieść wkład do góry nogami na ławce, a filtr wytnij z wkładu ostrym skalpelem.
11. Przytrzymaj filtr kleszczami, do góry nogami i umieść na szkiełku mikroskopowym. Nakładka ze szkiełkiem nakrywkowym i nośnikiem montażowym kompatybilnym z fluorescencyjnymi. Pozostaw do wyschnięcia na płasko w chłodnym pomieszczeniu, pod przykryciem przed światłem. Badaj i rejestruj obrazy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
    UWAGA: Preparaty te przechowywane w temperaturze 4 °C i chronione przed światłem mogą być przechowywane przez tygodnie przy minimalnej utracie fluorescencji.
12. OPCJONALNIE: Alternatywnie IF można wykonać na filtrach, które zostały wyjęte z wkładu. Aby to zrobić, zeskrob i wyczyść górną stronę filtrów bezpośrednio po zamocowaniu.
    1. Wyjmij filtry z wkładek ostrym skalpelem i umieść filtry aksonami do góry na dnie sześciodołkowej płytki.
    2. Następnie przeprowadzić inkubację dla IF, jak wskazano w 7.4-7.8 i 7.11. Zaletą tej alternatywy jest to, że oszczędza odczynniki, ponieważ, na przykład, objętość inkubacji może spaść do 500 μl (w porównaniu z 3 ml używanymi, gdy filtry są barwione bezpośrednio na wkładkach, jak pokazano w 7.1-7.11).

Wyniki

Eksplanty z zwojów korzeni grzbietowych myszy w stadium E13.5 rosną intensywnie na filtrach powlekanych sekwencyjnie poli-D-lizyną, lamininą i kolagenem (Rysunek 1B, lewa strona), osiągając w ciągu 2 dni hodowli wielkość do 2 mm. Ta kombinacja podłoża zapewnia szczególnie bujny wzrost; inne kombinacje prowadzą do powstania aksonów, które są znacznie krótsze (Rysunek 1B, prawa strona). Co więcej, zwoje korzeni grzbietowe utrzymywane na filtrach wytwarzają więcej i dłuższe aksony niż zwoje...

Dyskusja

Ważne parametry, które należy wziąć pod uwagę przy adaptacji tej techniki, obejmują populację neuronów, które będą badane, podłoże, wielkość porów filtra i powierzchnię. Wszystkie te parametry będą miały wpływ na specyfikę, jakość i ilość uzyskanego preparatu neurytowego i muszą być dokładnie przemyślane przez użytkownika końcowego. W przykładach przedstawionych w tym protokole zastosowanie neuronów DRG ma tę zaletę, że wydłuża tylko aksony, dając w ten sposób czysty (specyficzny) preparat aksonalny.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mysz CD-1, E13 ciąża czasowa	River		W domu ciąże zaplanowane można wykonać poprzez krycie myszy i sprawdzenie, czy nie ma czopów pochwowych (dzień E0)
Wkładki do hodowli komórek Falcon	Corning	353102	1 i mikro; m wielkość porów, pasuje do 6-dołkowej płytki
odbiorczej Płytki towarzyszące do hodowli komórkowych Falcon	353502		Płytki odbiorcze do wkładek
Poli-D-lizyna	Sigma-Aldrich	P6407	Stosowany w dawce 1 mg/ml w wodzie. Można użyć ponownie raz.
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	Używany przy 10 &mikro; g/ml w wodzie. Weź 100x zapas od -80 ° C i rozmrozić O/N w temperaturze 4 & stopni; C
Roztwór kolagenu bydlęcego PureCol	Advanced Biomatrix	5005-B
Leibovitz's L-15 Medium	Invitrogen	11415-064	Może być zastąpiony przez DMEM
Pożywka neuropodstawowa	Invitrogen	21103-049
B-27 suplement bez surowicy	Invitrogen	17504-044
5-Fluoro-2′-deoksyurydyna (FDU)	Sigma-Aldrich	F0503
NGF (2,5S, podjednostka beta)	Cedarlane	CLMCNET-001
Przeciwciało anty-NGF	Przygotowane we własnym zakresie		Zgodnie z opisem w: Acheson, A. et al. Wykrywanie aktywności podobnej do czynnika neurotroficznego pochodzenia mózgowego w fibroblastach i komórkach Schwanna: hamowanie przez przeciwciała przeciwko NGF. Neuron. 7, 265-75, (1991).
Alomone Labs	AN-240		komercyjna
antytubulinowe	Millipore	MAB5564
Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało przeciw mysim	przeciwciałom Invitrogen	A-11029
pożywka hodowlana DRG
Neurobaseal Medium 2% B27 Neurobasel Suplement 2 mM l-glutamina 1% Penicylina-streptomyzyna 10 &mikro; M FDU 15 ng/ml NGF (tylko dolna komora)
1x bufor do próbek Laemmli
2% SDS 50 mM DTT 60 mM Tris (pH 6,8) 5% Glicerol 0,01% (w/v) Błękit bromofenolowy

Charles Opcja Przeciwciało