In vivo (in vivo) Mikroiniekcja i elektroporacja jąder myszy

Spermatogeneza ssaków jest uważana za wyrafinowany proces samoodnawiających się komórek macierzystych, które kolejno przechodzą mitozę, mejozę i różnicowanie, aby przekształcić się w dojrzałe haploidalne plemniki. Te zmiany morfologiczne są koordynowane przez różne typy komórek i pomimo głębokich prób nadal niemożliwe jest naśladowanie tych procesów w hodowli komórkowej^1,2. W związku z tym dotychczasowe badania nad spermatogenezą opierają się na organizmach żywych jako modelach in vivo. Ogólnie rzecz biorąc, badania funkcji genów są zwykle oparte na zwierzętach transgenicznych. Jednak generowanie i utrzymywanie tego rodzaju modelu zwierzęcego jest czasochłonne, kosztowne i dość skomplikowane. Przypisuje się to wymaganemu długiemu procesowi hodowlanemu do wytworzenia i utrzymania transgenu przez pokolenia. Dodatkowo, manipulacja genetyczna całego organizmu za pomocą podejścia transgenicznego lub knockout jest podatna na powodowanie zaburzeń fizjologicznych, gdy celuje w geny o podstawowych funkcjach w wielu regionach, np. poza jądrem lub ogólnoustrojowo.

Ponadto, niektóre metody transfekcji przejściowej wiążą się z pewnymi istotnymi wadami. Na przykład typowymi wadami transferu genów za pośrednictwem wirusa są możliwe prowokowanie reakcji immunologicznych i dodatkowe przepisy bezpieczeństwa, podczas gdy lipofekcja³ i bombardowanie mikrocząsteczkami⁴ mogą uszkodzić tkankę i są ograniczone do określonej głębokości komórki, aby zapewnić wystarczającą skuteczność transfekcji.

Natomiast elektroporacja (EP) jako kolejny powszechny sposób transfekcji przejściowej, wydaje się stanowić obiecującą technikę umożliwiającą transfekcję in vivo i konsekwentną analizę genów in vivo. Ogólnie rzecz biorąc, EP jest określany jako zjawisko dynamiczne, które zależy od lokalnego napięcia transbłonowego, w którym w konsekwencji w ciągu nanosekund zapośredniczone są pory. Przerwy te mogą być utrzymywane przez milisekundy, co wystarcza do zapewnienia dostępu do DNA, RNA lub małych cząsteczek⁵. Gdy przyłożone napięcie jest zbyt wysokie, zwykle przejściowy charakter EP jest niwelowany z powodu wytwarzania ciepła i indukcji zbyt szerokiej przepuszczalności, co w konsekwencji prowadzi do nieodwracalnego uszkodzenia ogniwa⁵.

Tutaj pokazujemy, że elektroporacja to skuteczny i ekonomiczny system transfekcji, który może być wykorzystany do genetycznej transformacji jąder w celu wyjaśnienia cech genów jąder in vivo. W artykule omówiono preparację plazmidu, mikroiniekcję przez przewód odprowadzający i późniejszą elektroporację jąder myszy. Procedura ta może być sposobem z wyboru w celu uzyskania szybkiej, specyficznej i wydajnej transfekcji kanalików nasiennych jąder myszy in vivo w celu zbadania procesów spermatogenezy.

Wszystkie przeprowadzone eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez lokalną komisję etyki (Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei, Meklemburgia-Pomorze Przednie, Niemcy).

1. Przygotowanie plazmidu

1. Do przygotowania plazmidu należy użyć zestawów do oczyszczania plazmidu (patrz tabela materiałów) lub podobnych metod z buforem do usuwania endotoksyn, aby uniknąć reakcji immunologicznych zwierzęcia. Postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji. Zastosować ddH₂O do rozcieńczenia roztworu plazmidu.
2. Wyeliminuj zanieczyszczenia, obracając roztwór DNA z maksymalną prędkością (20 000 x g). Następnie zbierz supernatant.
3. Określić stężenie plazmidu za pomocą spektrofotometru (patrz materiały).
4. Dostosuj stężenie plazmidu za pomocą ddH₂O do 1-3 μg(DNA)/μl. Uwaga: Niższe stężenia zmniejszą wydajność transfekcji, podczas gdy wyższe stężenia mogą spowodować zbyt lepki roztwór do wstrzykiwań. Poza tym skuteczność transfekcji zależy od wielkości plazmidu i musi być testowana indywidualnie.
5. Przed wstrzyknięciem należy przygotować roztwór zawierający np. 40 μl plazmidu wraz z 5 μl PBS (10x) i 5 μl Fast Green (0,5%). Fast Green jest potrzebny do śledzenia procesu wstrzykiwania. Najlepiej używać cienkościennych probówek PCR lub Parafilm. Uwaga: W zależności od wielkości jądra, na każde jądro potrzebna będzie objętość 20-50 μl.

2. Przygotowanie pipety do mikroiniekcji

1. Do przygotowania pipet do mikroiniekcji należy użyć kapilar borokrzemianowych (patrz tabela materiałów).
2. Pociągnij szklane kapilary za pomocą pionowego ściągacza kapilarnego (patrz tabela materiałów).
3. Przełam końcówkę kapilary kleszczami, delikatnie opatrując. Końcówka ma zwykle średnicę 50-80 μm i około 1 cm długości. Staraj się unikać zbyt długich końcówek, ponieważ nie są one wystarczająco sztywne, aby przebić się przez tkankę.
4. Na koniec naostrz końcówkę pod kątem od 30° do 45° za pomocą ukosowarki do mikropipet (patrz tabela materiałów).
5. Załadować pipetę do mikroiniekcji mieszanką roztworu do wstrzykiwań (patrz Przygotowanie plazmidu). Nanieść roztwór na tylną część szklanej kapilary za pomocą małej strzykawki. Uwaga: Staraj się unikać pęcherzyków powietrza podczas ładowania, w przeciwnym razie zostaną one wstrzyknięte do kanalików nasiennych wraz z roztworem plazmidu, a tym samym zmniejszą przewodność, a także mogą spowodować uszkodzenie tkanek.

3. Anestezjologia i chirurgia

1. Operację należy wykonać w warunkach aseptycznych przy użyciu sterylnego materiału (tj. strzykawki, igły, narzędzi chirurgicznych itp.). Zmniejszy to zakażenie zwierzęcia i zapewni dobre wskaźniki przeżycia.
2. Użyj samców myszy do elektroporacji w wieku 6-8 tygodni.
3. Aby rozpocząć pooperacyjne leczenie przeciwbólowe, podaj myszce leki przeciwbólowe z dodatkiem wody pitnej w dniu poprzedzającym zabieg. Zapewnia to działanie przeciwbólowe prewencyjne w przypadku wysoce prawdopodobnej hipodypsji pooperacyjnej (zmniejszonego spożycia wody). W tym celu należy naświetlić wodę pitną, na przykład zawiesinę ibuprofenu dla dzieci (20 mg/ml). Woda do picia z lekiem powinna być również dostarczana w pierwszym i drugim dniu rekonwalescencji w identycznym stężeniu. Oznacza to dzienną dawkę 7,5 mg/kg, ważną dla 5 ml/d wody pitnej i masy ciała 25 g dla 8 tygodni w wieku C57BL/6J. Ten schemat przeciwbólowy gwarantuje fundamentalną ulgę w bólu i przyspieszony powrót do zdrowia, a także wysoki poziom dobrostanu²⁶.
4. W celu przygotowania roztworu roboczego do znieczulenia w dniu zabiegu należy zmieszać 10% ketaminy i 2% ksylazyny w stosunku 1:1 (patrz tabela materiałów).
5. Aby znieczulić zwierzę, należy zastosować podskórnie 0,25 ml/100 mg roztworu znieczulającego (Ketamin = 0,125 g/kg; Ksylazyna = 0,025 g/kg). Należy użyć miejsca wstrzyknięcia między miednicą a kończyną, aby zapobiec uszkodzeniom narządów i urazom myszy. Zwykle potrzeba 10 minut, aż mysz zostanie głęboko znieczulona.
6. Zakryj oczy myszy maścią weterynaryjną, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
7. Przetestuj zatrzymanie głębokiego znieczulenia, które jest zauważalne przez całkowity brak odpowiedzi. W tym celu wystarczy uszczypnąć palec u nogi zwierzęcia.
8. Aby rozpocząć zabieg, usuń włosy z brzucha za pomocą golarki elektrycznej lub podobnego i zdezynfekuj obszar operacyjny za pomocą sterilium lub podobnego narzędzia.
9. Wykonaj nacięcie brzuszne bezpośrednio nad gruczołami napletkowymi w środku okolicy brzucha. W tym miejscu najpierw odciągnij skórę i przeprowadź małe poprzeczne cięcie skóry o długości około 8-14 mm. Następnie kontynuuj wzdłuż warstwy mięśniowej brzucha.
   Uwaga: Zmiana powinna być jak najmniejsza, aby zmniejszyć szkody dla zwierzęcia.
10. Ostrożnie podciągnij poduszeczki tłuszczowe w jamie brzusznej, aby odsłonić przyczepione jądro i umieść je na wcześniej przygotowanej wodoodpornej jednorazowej papierowej serwety tuż obok miejsca nacięcia (ryc. 2A).
11. Użyj lornetki, aby znaleźć przewód odprowadzający jako cel wstrzyknięcia. Przewód odprowadzający jest identyfikowany jako cienkie połączenie naczynia między jądrem a najądrzem. Znajduje się w sąsiedztwie wydatnej tętnicy jądra. Przewód biegnie prawie pod kątem 45° do tętnicy i widocznie wchodzi w najądrza najądrza. Uwaga: W zależności od wieku myszy, przewód jest zwykle zakopany w tkance tłuszczowej.
12. Użyj cienkich kleszczyków, aby oczyścić przewód odprowadzający z tej tkanki tłuszczowej. Następnie umieść uwolniony przewód na sterylnym pasku papieru, aby zapewnić wyraźną widoczność przewodu bez pogarszania otoczenia.

4. Mikroiniekcja i aplikacja DNA

1. Podłączyć pipetę do mikroiniekcji, która jest załadowana roztworem plazmidu, do mikromanipulatora/zespołu iniektora.
2. Umieścić igłę do mikroiniekcji równolegle do przewodu odprowadzającego z końcówką skierowaną w stronę jądra rete (ryc. 2B).
3. Użyj cienkiej pęsety i zdejmij rurkę z pipety do mikroiniekcji. Upewnij się, że kapilar jest trzymany równolegle do kanału, jednocześnie go przeciągając.
   Uwaga: Ta procedura jest wygodniejsza niż penetracja naczynia poprzez przesuwanie igły za pomocą mikromanipulatora.
4. Ostrożnie skieruj igłę w stronę jądra i zatrzymaj się w momencie, gdy wnika w jądro rete bezpośrednio pod osłonką białawą (ryc. 2C).
   Uwaga: W przypadku nadmiernego sięgnięcia jądra rete, roztwór plazmidu przecieknie do przestrzeni śródmiąższowej. Prowadzi to często do niepowodzenia transfekcji kanalików nasiennych.
5. Do wstrzykiwania roztworu plazmidu należy użyć mikroiniektora o następujących ustawieniach: pi: 100 hPa, ti: 0,2 s i pc: 0 hPa (rysunek 2D).
6. Monitoruj cały proces wstrzykiwania, obserwując stan wypełnienia jąder za pomocą zielonego koloru. Uważaj, aby jądro było wypełnione roztworem plazmidu tylko do 2/3 swojej objętości (ryc. 2E).
   Uwaga: Jeśli objętość wstrzyknięcia zostanie przekroczona, tkanka jądra może zostać uszkodzona.

5. Elektroporacja jądra

1. Aby umożliwić skuteczną elektroporację, zanurz elektrody pęsety w PBS (1x). Zapewnia to odpowiednią przewodność.
2. Płynnie ściśnij jądro między mokrymi elektrodami (rysunek 2F). Zmierz rezystancję elektryczną za pomocą elektroporatora.
3. Przyłóż prąd do jądra. Wykonaj osiem impulsów kwadratowych 40 V w 4 różnych miejscach jąder o stałym czasie trwania 50 ms czasu impulsu i 950 ms interwału.

6. Zamykanie ran i leczenie pooperacyjne

1. Po zakończeniu elektroporacji umieść jądro z powrotem w pierwotnym miejscu.
2. Zszyj wewnętrzną warstwę mięśniową szwem chirurgicznym (patrz materiały).
3. Zamknij skórę za pomocą klipsów do szwów (patrz tabela materiałów). Podciągnij skórę pęsetą. Upewnij się, że wykluczyłeś warstwę mięśniową. Umieść klipsy, każdy w odległości nie większej niż 5 mm.
   Uwaga: Ponieważ szew chirurgiczny może zostać połknięty przez mysz, klipsy do szwów są preferowane do zamykania zmiany skórnej.
4. Pozwól myszy dojść do siebie po znieczuleniu na sterylnych ręcznikach papierowych umieszczonych w sterylnej, pustej klatce dla myszy, która jest hartowana na ciepłej podkładce o temperaturze 37 °C. Podkładka powinna zapewniać ogrzanie jednej połowy klatki, tworząc gradient ciepła. Dla zwierzęcia umożliwia to poszukiwanie indywidualnego, najbardziej komfortowego miejsca ze względu na różnorodność temperatur w klatce. Dodatkowo przykryj mysz arkuszem sterylnego ręcznika papierowego, aby jeszcze bardziej zmniejszyć stres. Uwaga: Ponieważ powierzchnia ciała myszy jest niezwykle wysoka w stosunku do masy ciała, w porównaniu z większymi zwierzętami, wsparcie termiczne ma szczególne znaczenie dla pomyślnej regeneracji gryzoni.
5. Gdy operowane zwierzę w pełni się obudzi, przenieś je w celu dalszego powrotu do zdrowia do całkowicie wyposażonej nowej klatki dla myszy. Nie umieszczaj zwierzęcia z powrotem w starej klatce lub w grupie myszy. Upewnij się, że klatka jest tak czysta i sterylna, jak to tylko możliwe, aby zapobiec zakażeniu rany. Monitoruj cały proces odzyskiwania. Aby przenieść mysz z powrotem do placówki opieki nad zwierzętami, poczekaj, aż w pełni wyzdrowieje i zacznie zachowywać się normalnie.
   Uwaga: Dodatkowe strategie per- i pooperacyjne zostały omówione przez Pritchetta-Corninga KR i wsp.6.

Eksperymentalne ustawienie do wykonywania mikroiniekcji i elektroporacji jąder myszy in vivo, tak jak jest to używane zgodnie z protokołem, jest zilustrowane na rysunku 1. Mimo że możliwe jest nabycie mikropipet produkowanych przemysłowo, woleliśmy wytwarzać własne pipety, ciągnąc (rysunek 1A) i ukosowując (rysunek 1B) szklane kapilary, tak aby odpowiadały naszym potrzebom. Sprzęt do mikroiniekcji i elektroporacji zilustrowano na rysunku 1C. Ze względu na wydajność transfekcji ważne jest zastosowanie elektroporatora o fali prostokątnej.

Rysunek 2 przedstawia kluczowe etapy operacji u myszy, ze szczególnym naciskiem na przygotowanie przewodu odprowadzającego. W tym kontekście jądro jest odsłonięte (ryc. 2A), a przewód odprowadzający jest identyfikowany przez obserwację obuoczną i uwalniany z tkanki tłuszczowej (ryc. 2B). Następnie przewód odprowadzający jest nakłuwany pipetą do mikroiniekcji i podawany jest roztwór plazmidu (ryc. 2C-E). Na koniec obciążone jądro jest ściskane między dwiema elektrodami i transfekowane przez zastosowane impulsy fali prostokątnej (ryc. 2F).

To podejście do transfekcji in vivo pozwala na użycie różnych plazmidów kodujących różne geny reporterowe. Tutaj użyliśmy wektora reporterowego pEGFP-C1 (Figura 3A), który wyraża wzmocnione białko zielonej fluorescencji (eGFP), a także wektor pDsRed2-N1 (Figura 3C) umożliwiający transaktywację białka czerwonej fluorescencji (DsRed2). W naszym przypadku oba geny reporterowe były pod kontrolą ludzkiego wirusa cytomegalii – promotora natychmiastowo-wczesnego (CMV).

Aby ocenić sukces transfekcji, mikroiniekowane i elektroporowane jądra zostały pobrane 3 dni po całej procedurze i obserwowane pod mikroskopią fluorescencyjną (Rysunek 3). W celu szczegółowego zbadania, jądra zostały utrwalone formaldehydem, zatopione w parafinie, pokrojone w plastry (5 μm), a także wybarwione przeciwtlenowo To-Pro-3, w wyniku czego uzyskano jądra o niebieskim kolorze. Ostatecznie skrawki zostały zbadane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Dwa przykłady możliwych wyników transfekcji można zobaczyć na rysunku 4. Ekspresja genu reporterowego EGFP jest wskazywana przez zieloną fluorescencję, transaktywacja DsRed2 jest wyznaczana przez emisję czerwoną.

Rysunek 1. Sprzęt do mikroiniekcji in vivo i elektroporacji jąder myszy. Szklane kapilary są formowane za pomocą ściągacza do mikropipet (A), podczas gdy końcówki są ostrzone za pomocą ukosowacza do mikropipet (B). Jednostka dla obu technik mikroiniekcji i elektroporacji jest zilustrowana w (C). Zamiast korzystać z komercyjnego mikromanipulatora, użyliśmy stołu krzyżowego XYZ w mikroskopie i dołączyliśmy jednostkę do przytrzymywania mikropipety. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Ilustracja przebiegu mikroiniekcji i elektroporacji jądra in vivo u myszy, w tym wcześniejszej interwencji chirurgicznej. Dostęp do jądra odbywa się poprzez otwarcie brzucha myszy, który został wcześniej znieczulony. Nacięcie wykonuje się tuż nad gruczołami napletkowymi. Po odsłonięciu jądra uwalnia się ono z poduszek tłuszczowych w jamie brzusznej (A). Pod obserwacją obuoczną przewód odprowadzający jest identyfikowany i oczyszczony z tłuszczu. Pipetę do mikroiniekcji umieszcza się obok przewodu, podczas gdy ostry koniec igły jest skierowany w stronę przewodu odprowadzającego (B). Szklana kapilara jest wprowadzana do przewodu i przesuwana w kierunku jądra, które ma być umieszczone bezpośrednio w jądrze wewnętrznym (C). Procedura aplikacji DNA i wypełniania kanalików nasiennych jest monitorowana za pomocą Fast Green (D). Tylko 2/3 jądra zostaje wypełnione, aby zapobiec uszkodzeniu tkanki (E). W ostatnim etapie elektroporacji jądro jest ściskane między elektrodami typu pęseta w celu zastosowania elektrycznych impulsów kwadratowych (F). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Całe jądro mountis 3 dni po elektroporacji in vivo.Pod mikroskopią fluorescencyjną transfekowane jądra myszy C57BL / 6 wykazują ekspresję wzmocnionego białka zielonej fluorescencji - eGFP (A) i białka czerwonej fluorescencji - DsRed2 (C) kodowanych odpowiednio na plazmidzie pEGFP-C1 i pDsRed2-N1. Ekspresja obu genów reporterowych była pod kontrolą wszechobecnego aktywnego elementu promotora CMV. Skuteczna transfekcja docelowych kanalików nasiennych jest wykazana za pomocą intensywności fluorescencji. Panele (B) i (D) ilustrują autofluorescencję nietransfekowanych jąder kontrolnych. Podziałka liniowa = 1 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Skrawki jądra myszy 3 dni po jednostronnej elektroporacji in vivo plazmidem pEGFP-C1. Wyniki transfekcji nieruchomych wycinków jąder myszy (5 μm) są pokazane 3 dni po jednostronnej elektroporacji plazmidem pEGFP-C1. Pomyślnie transfekowane komórki kanalików jądrowych są oznaczone zieloną fluorescencją. Jądra TO-PRO-3 są wykrywalne przez niebieską emisję (A i B). Okrągłe struktury są typowe dla organizacji komórek w kanalikach nasiennych. Podziałka = 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Marten Michaelis, Alexander Sobczak i Joachim M. Weitzel zatrudnieni w Instytucie Biologii Rozrodu Instytutu Biologii Zwierząt Gospodarskich im. Leibniza (FBN) w Dummerstorf w Niemczech oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.