Izolacja komórek zrębu mysich węzłów chłonnych

Węzły chłonne to wyspecjalizowane przedziały, w których inicjowane i koordynowane są adaptacyjne reakcje immunologiczne przeciwko obcym i własnym antygenom. Przedstawiona tutaj procedura opisuje krótkie trawienie enzymatyczne połączone z automatycznym pipetowaniem mechanicznym w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki węzła chłonnego i uzyskania dostępu do żywotnych komórek zrębu węzłów chłonnych, które utrzymują powierzchniową ekspresję kilku cząsteczek.

Komórka zrębu węzła chłonnego tworzy rusztowanie węzła chłonnego i spełnia trzy główne funkcje: najpierw filtruje płyny ustrojowe, aby pobrać próbki antygenów, patogenów i ich wzorca molekularnego związanego z patogenami (PAMP), a także cytokin i wzorca molekularnego związanego z niebezpieczeństwem (DAMPs) obecnego w organizmie. Po drugie, przyciągają i instruują komórki prezentujące antygen (APC) i limfocyty, aby oddziaływały i inicjowały adaptacyjne odpowiedzi immunologiczne; i po trzecie, zapewniają środowisko strukturalne dla homeostazy i różnicowania limfocytów^1-3. Podczas stanu zapalnego komórki zrębu węzłów chłonnych wytwarzają czynniki wzrostu, cytokiny i chemokiny, przystosowują się do obrzęku, organizując w ten sposób interakcję między komórkami dendrytycznymi (DC), limfocytami T i B. Orkiestracja odpowiedzi immunologicznych jest możliwa tylko dzięki złożonej architekturze strukturalnej utworzonej przez różne populacje komórek zrębu.

Komórki zrębu węzłów chłonnych są komórkami ujemnymi CD45 i można je odróżnić po ekspresji CD31 lub gp38 w komórkach fibroblastów i śródbłonka ^1-6. Gp38 ⁺ CD31 ^- definiuje komórki siatkowate strefy T (TRC, znane również jako FRC: fibroblastyczne komórki siatkowate), gp38 ⁺ CD31 ⁺ definiuje komórki śródbłonka limfatycznego (LEC), gp38-CD31 ⁺ definiuje komórki śródbłonka krwi (BEC). Ponadto charakterystyka subpopulacji ujawniła istnienie innych komórek zrębu węzłów chłonnych. Rzeczywiście, w populacji gp38-CD31^- scharakteryzowano małą populację komórek podobnych do perycytów⁷. W związku z tym adaptacja procedury izolacji jest korzystna dla identyfikacji i charakterystyki właściwości funkcjonalnych różnych komórek zrębu węzłów chłonnych.

Przed opracowaniem protokołów trawienia komórek zrębu węzłów chłonnych, badanie komórek zrębu węzłów chłonnych ograniczało się do obserwacji in situ za pomocą przekroju tkanki i mikroskopii. Niemniej jednak badania strukturalne i funkcjonalne wykazały ważne cechy komórek zrębu węzłów chłonnych. Komórki zrębu węzłów chłonnych są związane z podoplaniną, kolagenem i białkami macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), tworząc złożoną trójwymiarową strukturę zwaną systemem przewodów, która transportuje limfę i związane z nią białka o niskiej masie cząsteczkowej z zatoki podtorebkowej węzła chłonnego do żyłek o wysokim śródbłonku w strefie⁸ limfocytów T. DC są w bliskim kontakcie z komórkami zrębu i można je zaobserwować wystające w strukturę przewodu rurowego w celu pobrania próbki płynu i wykrycia antygenów⁸. Interakcja komórek zrębu węzłów chłonnych (TRC i LEC) z DC odbywa się za pośrednictwem uwalniania i prezentacji chemokin CCL21 i CCL19^9,10. CCL19 i CCL21 są rozpoznawane przez receptor CCR7 ułatwiający limfocytom DC i T migrację do strefy komórek T węzła chłonnego^4,11. Pomimo stosowania podobnych chemokin, limfocyty DC i T mają różne drogi migracji do węzłów chłonnych¹². Następnie, stosując trawienie enzymatyczne węzła chłonnego i izolację czystych komórek zrębu węzłów chłonnych, przeprowadzono badania funkcjonalne nad rolą różnych komórek zrębu węzłów chłonnych i ich zdolnością do interakcji z komórkami DC i T / B^6,13. Po pierwsze, przesłuch między efektorowymi limfocytami T wytwarzającymi IFN-γ a komórkami zrębu węzłów chłonnych indukuje produkcję metabolitu tlenku azotu, który wykazuje tłumienie odpowiedzi komórek T i proliferację w wtórnych narządach limfatycznych^14-16. Po drugie, doniesiono, że komórki zrębu węzłów chłonnych wspierają różnicowanie podzbiorów regulatorowych DC poprzez produkcję IL-10¹⁷ i modulują homeostazę naiwnych limfocytów T poprzez produkcję IL-7^6,18. Po trzecie, ekspresja TLR w komórkach zrębu węzłów chłonnych sugeruje, że komórki zrębu są podatne na sygnał pochodzący z infekcji lub własne cząsteczki uwalniane podczas uszkodzenia tkanki. Rzeczywiście, traktowanie komórek zrębu węzłów chłonnych ligandem poli(I:C) TLR3 indukuje umiarkowaną regulację w górę ekspresji głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy I i regulację w górę cząsteczki kohamującej PD-L1, ale nie cząsteczek kostymulujących, co powoduje dramatyczne zmiany w ekspresji antygenów tkanek obwodowych¹⁹. Kilka grup wykazało, że komórki zrębu węzłów chłonnych wyrażają antygeny tkanek obwodowych i indukują tolerancję samoreaktywnych limfocytów T^19,21-27. Dlatego zrozumienie interakcji między komórkami zrębu węzłów chłonnych a innymi migrującymi i rezydentnymi komórkami węzłów chłonnych pomoże znaleźć nowe cząsteczki docelowe, które umożliwią aktywację lub supresję odpowiedzi immunologicznych podczas stanu zapalnego. W związku z tym konieczne jest wdrożenie opublikowanego enzymatycznego oddzielenia węzła chłonnego.

Poprzednio opublikowane protokoły wykorzystują różne kombinacje trawienia enzymatycznego opartego na kolagenazie z niskim obciążeniem mechanicznym^6,19,20. Jednak długie inkubacje z enzymami trawiącymi lub różnymi kombinacjami enzymów trawiennych mogą degradować różne cząsteczki powierzchniowe wymagane do analizy stanu aktywacji i identyfikacji nowych komórek zrębu węzłów chłonnych. W zależności od rodzaju analizy komórek zrębu, bardziej odpowiedni może być protokół Link lub protokół Fletchera. W opisanej procedurze nieco krótsze trawienie enzymatyczne jest połączone z automatyczną dezagregacją mechaniczną w celu zminimalizowania degradacji markerów powierzchniowych żywotnych komórek zrębu węzłów chłonnych. Procedura ta umożliwia wysoce powtarzalną izolację i rozróżnienie populacji komórek zrębu węzłów chłonnych o niskiej zmienności i ponad 95% żywotności. Świeżo wyizolowane komórki zrębu węzłów chłonnych mogą być bezpośrednio wykorzystane do ekspresji markerów powierzchniowych, analizy białek i badań transkrypcyjnych, a także do tworzenia linii komórek zrębu do wykonywania testów funkcjonalnych in vitro.

W tej publikacji wideo i protokole, wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem na zwierzętach zatwierdzonym przez Urząd Kantonalny Bazylea-Miasto, Szwajcaria.

1. Przygotowanie i trawienie węzłów chłonnych

1. Podgrzej wodę w zlewce do temperatury 37 °C na mieszadle magnetycznym z płytą grzewczą.
2. Przygotować pożywkę zasadową w następujący sposób: pożywka DMEM (bez pirogronianu) uzupełniona 2% FCS, 1,2 mM CaCl₂ i Pen/Strep (100 jednostek penicyliny, 100 μg streptomycyny).
3. Wysterylizuj wszystkie narzędzia preparacyjne przed użyciem.
4. Poddaj eutanazji myszy dawcy węzłów chłonnych po uduszeniu CO₂ i aseptyczne wypreparowanie węzłów chłonnych. Nie rozcinaj otaczającego tłuszczu. UWAGA: Ten protokół jest zoptymalizowany pod kątem obwodowych węzłów chłonnych drenujących skórę (pachwinowych, ramiennych, pachowych).
5. Umieść węzły chłonne na sterylnej szalce Petriego zawierającej 2 ml lodowatego podłoża zasadowego.
6. Rozbić kapsułkę węzłów chłonnych za pomocą dwóch igieł 25 G przymocowanych do strzykawki o pojemności 1 ml.
7. Przenieść przerwaną tkankę węzłów chłonnych w 5 ml polipropylenowej probówce okrągłodennej zawierającej 750 μl podłoża zasadowego uzupełnionego 1 mg/ml kolagenazy IV i 40 μg/ml DNAzy I.
8. Dodaj jedno sterylne mieszadło magnetyczne do każdej probówki.
9. Umieścić probówkę w zlewce z wodą podgrzaną o temperaturze 37 °C i mieszać probówki powoli (1 runda/sek.) przez 30 minut.
10. Wyjmij rurkę z mieszadła magnetycznego z płytą grzewczą i pozwól, aby fragmenty węzłów chłonnych osiadły.
11. Ostrożnie usunąć supernatant wzbogacony w "komórkę niezrębową". UWAGA: Jeśli przewiduje się analizę T, B, komórek dendrytycznych i CD45-gp38-CD31^-, należy zachować frakcję "komórek niezrębowych".
12. Pozostałą tkankę węzłów chłonnych przepłukać jednorazowo 750 μl podłoża zasadowego. UWAGA: Ten krok jest konieczny tylko w przypadku pracy z myszami kompetentnymi immunologicznie.
13. Niech fragmenty węzłów chłonnych osiądą.
14. Usuń frakcję pływającą w komórkach niezrębowych.
15. Dodać do fragmentów węzłów chłonnych 750 μl podłoża zasadowego uzupełnionego 3,5 mg/ml kolagenazy D i 40 μg/ml DNazy I.
16. Umieścić probówkę z powrotem w zlewce zawierającej wodę podgrzaną do 37 °C.
17. Trawić tkankę węzłów chłonnych przez 5 minut, powoli mieszając.
18. Zdezagreguj fragmenty tkanki węzłów chłonnych poprzez pipetowanie i mieszanie 700 μl przez 10 cykli z maksymalną prędkością za pomocą automatycznej pipety wielokanałowej. UWAGA: To zaburza tkankę węzłów chłonnych, aby poprawić trawienie.
19. Umieścić probówkę z powrotem w zlewce z wodą podgrzaną o temperaturze 37 °C.
20. Trawić fragmenty tkanki węzłów chłonnych przez kolejne 10 minut, powoli mieszając.
21. Dezagreguj fragmenty tkanki węzłów chłonnych poprzez pipetowanie i mieszanie przez 99 cykli z maksymalną prędkością za pomocą automatycznej pipety wielokanałowej.
22. Dodać 7,5 μl 0,5 M EDTA, aby zapewnić utrzymanie zawiesiny pojedynczej komórki.
23. Dezagreguj fragmenty tkanki węzłów chłonnych poprzez pipetowanie i mieszanie przez 99 cykli z maksymalną prędkością za pomocą automatycznej pipety wielokanałowej.
24. Dodać 750 μl podłoża zasadowego i przepuścić komórki przez siatkę nylonową o grubości 70 μm.
25. Zawiesina komórek wirówki 5 min przy 1 500 x g, 4 °C.
26. Komórki zrębu można teraz wykorzystać do dalszej analizy.

2. Barwienie komórek zrębu węzłów chłonnych

1. Użyj kombinacji przeciwciał anty-CD45, anty-podoplaniny (gp38), anty-CD31, aby skutecznie rozpoznać komórki TRC, LEC, BEC i DN.
2. Inkubować strawioną tkankę węzłów chłonnych za pomocą Live/Dead tracker, anty-CD45-FITC (1:200), anty-gp38-PE (1:200), anty-CD31-APC (1:200) w 100 μl HBSS zawierającego 2% FCS przez co najmniej 20 minut, 4 °C, w ciemności.
3. Umyć komórki, dodając 500 l HBSS zawierającego 2% FCS
4. Zawiesina komórek wirówki 3 min przy 1500 x g, 4°C.
5. Zawiesić ponownie w 100 μl HBSS zawierającego 2% FCS.
6. Wybarwione komórki należy uruchomić w cytometrze przepływowym wyposażonym w następujący układ optyczny: źródło wzbudzenia z maksymalnie trzema laserami: niebieskim (488 nm, chłodzony powietrzem, półprzewodnikowym 20 mW), czerwonym (633 nm, 17 mW HeNe) i fioletowym (405 nm, 30 mW półprzewodnikowym).
7. Bramka CD45^- komórki w celu wykluczenia komórek krwiotwórczych.
8. Pojedyncze bramki (FSC-W) i żywe komórki (tracker LIVE/DEAD) w celu wykluczenia dubletów i martwych komórek.
9. Wykreśl komórki gp38 w porównaniu z CD31, aby uwidocznić komórki TRC (gp38⁺CD31^-), LEC (gp38⁺CD31⁺), BEC (gp38-CD31⁺) i DN (gp38-CD31^-) (patrz rysunek 1).

Obecny protokół jest zmodyfikowanym protokołem trawienia opublikowanym przez Link et al., 20076 z krótszym czasem trawienia (maksymalnie 45 minut) z powodu mechanicznej dezagregacji za pomocą automatycznej pipety wielokanałowej. Ponadto procedura jest bardziej ustandaryzowana, minimalizuje degradację markerów powierzchniowych na różnych komórkach zrębu węzłów chłonnych i umożliwia obsługę więcej niż jednej próbki w tym samym czasie.

Kolagenaza IV i Kolagenaza D w protokoleLinks 6 i obecnym protokole lub Kolagenaza P i Dispase w protokoleFletchera 13 utrzymują żywotność komórek zrębu węzłów chłonnych i oszczędzają trawienie kilku markerów powierzchniowych, w tym CD45, gp38 i CD31. Aby przetestować obecny protokół, węzły chłonne pachowe, ramienne i pachwinowe zostały usunięte i strawione w celu wyizolowania ich komórek zrębu. Analiza ekspresji CD45, gp38 i CD31 wykazała obecność komórek TRC, LEC, BEC i DN wyizolowanych z myszy C57BL / 6 (Figura 1, strategia bramkowania).

Naprężenie mechaniczne może zmniejszyć żywotność komórek zrębu węzłów chłonnych podczas trawienia. Porównując żywotność izolowanych subpopulacji komórek zrębu przy użyciu trzech różnych protokołów, stwierdzono, że żywotność była wyższa niż 95% w protokole Fletchera, ale niższa zarówno w protokole Current, jak i protokole Link (Figura 2A), chociaż obecny protokół wykazuje lepszą przeżywalność w subpopulacji BEC niż protokół Link. Całkowita liczba komórek odzyskanych po trawieniu podzbiorów komórek zrębu węzłów chłonnych była nieco wyższa w protokole Current w porównaniu z protokołem Link i protokołem Fletchera (Figura 2A). Wyniki te pokazują, że obecny protokół utrzymuje żywotność komórek zrębu węzłów chłonnych podobnie jak opublikowane protokoły. Główne różnice między tymi trzema protokołami przedstawiono w tabeli 1.

Markery powierzchniowe są wymagane do scharakteryzowania komórek zrębu węzłów chłonnych za pomocą cytometrii przepływowej i wyizolowania ich przez sortowanie komórek. Porównano TRC i LEC izolowane za pomocą protokołów Current, Link i Fletcher pod kątem ekspresji I-Ab, CD140a, CD80, PD-L1 i CD40. Po wyizolowaniu komórek zrębu za pomocą wszystkich trzech protokołów stwierdziliśmy, że ekspresja I-Ab, CD80, CD140a, PD-L1 i CD40 była wyższa po trawieniu z CP i LP zarówno w TRC, jak i LEC (Figura 2B). Wyniki te sugerują, że degradacja niektórych cząsteczek powierzchniowych za pomocą kolagenazy IV i D jest mniej silna niż w przypadku kolagenazy P i Dyspasy.

Podsumowując, obecny protokół obejmuje krótkie trawienie połączone z automatyczną dezagregacją mechaniczną w celu zminimalizowania degradacji markerów powierzchniowych żywotnych komórek zrębu węzłów chłonnych.

Rysunek 1. Barwienie, bramkowanie i kwantyfikacja komórek TRC, LEC, BEC i DN. Węzły chłonne myszy C57BL / 6 zostały strawione zgodnie z obecnym protokołem i wybarwione CD45, gp38 i CD31, żywe / martwe w celu zdefiniowania komórek TRC, LEC, BEC i DN za pomocą cytometrii przepływowej. Dane pokazują reprezentatywne wyniki barwienia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Rysunek 2. Żywotność i ekspresja markerów powierzchniowych komórek zrębu węzłów chłonnych. Węzły chłonne myszy C57BL / 6 trawiono zgodnie z protokołem Current (CP), Linka (LP) i Fletchera (FP) i barwiono CD45, gp38 i CD31 w celu zdefiniowania komórek TRC, LEC, BEC i DN za pomocą cytometrii przepływowej. A) Żywotność i całkowita liczba komórek wszystkich subpopulacji komórek zrębu węzłów chłonnych po barwieniu żywym/martwym (n ≥ 5, zbiorcze dane z 2 niezależnych eksperymentów, słupki reprezentują SEM). B) Analiza ekspresji powierzchniowej I-Ab (APC-Cy7), CD140a (PerCP-Cy5.5), CD80 (PerCP-Cy5.5), PD-L1 (PE-Cy7) i CD40 (PE-Cy7) na TRC i LEC (n = 6 dla FP i n = 11 dla LP i CP, zebrane dane z 2 niezależnych eksperymentów, słupki reprezentują SEM). Geometryczne wartości autofluorescencji MFI dla LEC-APC-Cy7: 324 ± 97, LEC-PECy7: 163 ± 82,5, LEC-PerCpCy5,5: 156 ± 36, TRC-APC-Cy7: 349 ± 152, TRC-PECy7: 117 ± 54, TRC-PerCP-Cy5.5: 121 ± 45. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Tabela 1. Krótkie podsumowania stosowanych enzymów CP, LP, FP i protokołów.

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.