Artykuł metodologiczny

Izolacja komórek zrębu mysich węzłów chłonnych

31.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51803

⸱

19 sierpnia 2014

 ,  ,  , 
1Department of Biomedicine, Immunoregulation, University of Basel and University Hospital Basel

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Izolacja komórek zrębu węzłów chłonnych to wieloetapowa procedura obejmująca trawienie enzymatyczne i mechaniczną dezagregację w celu uzyskania fibroblastycznych komórek siatkowatych, limfatycznych i komórek śródbłonka krwi. W opisanej procedurze krótkie trawienie jest połączone z automatyczną dezagregacją mechaniczną w celu zminimalizowania degradacji markerów powierzchniowych żywotnych komórek zrębu węzłów chłonnych.

Streszczenie

Wtórne narządy limfoidalne, w tym węzły chłonne, składają się z komórek zrębu, które zapewniają strukturalne środowisko dla homeostazy, aktywacji i różnicowania limfocytów. Różne podzbiory komórek zrębu zostały zidentyfikowane na podstawie ekspresji cząsteczki adhezyjnej CD31 i glikoproteiny podoplaniny (gp38), komórek siatkowatych strefy T lub fibroblastycznych komórek siatkowatych, komórek śródbłonka limfatycznego, komórek śródbłonka krwi i perycytów podobnych do FRC w populacji komórek podwójnie ujemnych. Dla wszystkich populacji opisano różne funkcje, w tym separację i wyściełanie różnych przedziałów, przyciąganie i interakcję z różnymi typami komórek, filtrację płynów drenujących i kurczenie się naczyń limfatycznych. W ostatnich latach różne grupy opisywały dodatkową rolę komórek zrębu w organizowaniu i regulowaniu odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T potencjalnie niebezpiecznych dla gospodarza.

Węzły chłonne są złożonymi strukturami z wieloma różnymi typami komórek i dlatego wymagają odpowiedniej procedury izolacji pożądanych populacji komórek. Obecnie protokoły izolacji komórek zrębu węzłów chłonnych opierają się na trawieniu enzymatycznym o różnym czasie inkubacji; Jednak komórki zrębu i ich cząsteczki powierzchniowe są wrażliwe na te enzymy, co powoduje utratę ekspresji markerów powierzchniowych i śmierć komórki. W tym przypadku zaproponowano krótki protokół trawienia enzymatycznego w połączeniu z automatycznym rozrywaniem mechanicznym w celu uzyskania żywotnej zawiesiny pojedynczych komórek komórek zrębu węzłów chłonnych przy zachowaniu ekspresji cząsteczek powierzchniowych.

Wprowadzenie

Węzły chłonne to wyspecjalizowane przedziały, w których inicjowane i koordynowane są adaptacyjne reakcje immunologiczne przeciwko obcym i własnym antygenom. Przedstawiona tutaj procedura opisuje krótkie trawienie enzymatyczne połączone z automatycznym pipetowaniem mechanicznym w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki węzła chłonnego i uzyskania dostępu do żywotnych komórek zrębu węzłów chłonnych, które utrzymują powierzchniową ekspresję kilku cząsteczek.

Komórka zrębu węzła chłonnego tworzy rusztowanie węzła chłonnego i spełnia trzy główne funkcje: najpierw filtruje płyny ustrojowe, aby pobrać próbki antygenów, patogenów i ich wzorca molekularnego związanego z patogenami (PAMP), a także cytokin i wzorca molekularnego związanego z niebezpieczeństwem (DAMPs) obecnego w organizmie. Po drugie, przyciągają i instruują komórki prezentujące antygen (APC) i limfocyty, aby oddziaływały i inicjowały adaptacyjne odpowiedzi immunologiczne; i po trzecie, zapewniają środowisko strukturalne dla homeostazy i różnicowania limfocytów1-3. Podczas stanu zapalnego komórki zrębu węzłów chłonnych wytwarzają czynniki wzrostu, cytokiny i chemokiny, przystosowują się do obrzęku, organizując w ten sposób interakcję między komórkami dendrytycznymi (DC), limfocytami T i B. Orkiestracja odpowiedzi immunologicznych jest możliwa tylko dzięki złożonej architekturze strukturalnej utworzonej przez różne populacje komórek zrębu.

Komórki zrębu węzłów chłonnych są komórkami ujemnymi CD45 i można je odróżnić po ekspresji CD31 lub gp38 w komórkach fibroblastów i śródbłonka 1-6. Gp38 + CD31 - definiuje komórki siatkowate strefy T (TRC, znane również jako FRC: fibroblastyczne komórki siatkowate), gp38 + CD31 + definiuje komórki śródbłonka limfatycznego (LEC), gp38-CD31 + definiuje komórki śródbłonka krwi (BEC). Ponadto charakterystyka subpopulacji ujawniła istnienie innych komórek zrębu węzłów chłonnych. Rzeczywiście, w populacji gp38-CD31- scharakteryzowano małą populację komórek podobnych do perycytów7. W związku z tym adaptacja procedury izolacji jest korzystna dla identyfikacji i charakterystyki właściwości funkcjonalnych różnych komórek zrębu węzłów chłonnych.

Przed opracowaniem protokołów trawienia komórek zrębu węzłów chłonnych, badanie komórek zrębu węzłów chłonnych ograniczało się do obserwacji in situ za pomocą przekroju tkanki i mikroskopii. Niemniej jednak badania strukturalne i funkcjonalne wykazały ważne cechy komórek zrębu węzłów chłonnych. Komórki zrębu węzłów chłonnych są związane z podoplaniną, kolagenem i białkami macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), tworząc złożoną trójwymiarową strukturę zwaną systemem przewodów, która transportuje limfę i związane z nią białka o niskiej masie cząsteczkowej z zatoki podtorebkowej węzła chłonnego do żyłek o wysokim śródbłonku w strefie8 limfocytów T. DC są w bliskim kontakcie z komórkami zrębu i można je zaobserwować wystające w strukturę przewodu rurowego w celu pobrania próbki płynu i wykrycia antygenów8. Interakcja komórek zrębu węzłów chłonnych (TRC i LEC) z DC odbywa się za pośrednictwem uwalniania i prezentacji chemokin CCL21 i CCL199,10. CCL19 i CCL21 są rozpoznawane przez receptor CCR7 ułatwiający limfocytom DC i T migrację do strefy komórek T węzła chłonnego4,11. Pomimo stosowania podobnych chemokin, limfocyty DC i T mają różne drogi migracji do węzłów chłonnych12. Następnie, stosując trawienie enzymatyczne węzła chłonnego i izolację czystych komórek zrębu węzłów chłonnych, przeprowadzono badania funkcjonalne nad rolą różnych komórek zrębu węzłów chłonnych i ich zdolnością do interakcji z komórkami DC i T / B6,13. Po pierwsze, przesłuch między efektorowymi limfocytami T wytwarzającymi IFN-γ a komórkami zrębu węzłów chłonnych indukuje produkcję metabolitu tlenku azotu, który wykazuje tłumienie odpowiedzi komórek T i proliferację w wtórnych narządach limfatycznych14-16. Po drugie, doniesiono, że komórki zrębu węzłów chłonnych wspierają różnicowanie podzbiorów regulatorowych DC poprzez produkcję IL-1017 i modulują homeostazę naiwnych limfocytów T poprzez produkcję IL-76,18. Po trzecie, ekspresja TLR w komórkach zrębu węzłów chłonnych sugeruje, że komórki zrębu są podatne na sygnał pochodzący z infekcji lub własne cząsteczki uwalniane podczas uszkodzenia tkanki. Rzeczywiście, traktowanie komórek zrębu węzłów chłonnych ligandem poli(I:C) TLR3 indukuje umiarkowaną regulację w górę ekspresji głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy I i regulację w górę cząsteczki kohamującej PD-L1, ale nie cząsteczek kostymulujących, co powoduje dramatyczne zmiany w ekspresji antygenów tkanek obwodowych19. Kilka grup wykazało, że komórki zrębu węzłów chłonnych wyrażają antygeny tkanek obwodowych i indukują tolerancję samoreaktywnych limfocytów T19,21-27. Dlatego zrozumienie interakcji między komórkami zrębu węzłów chłonnych a innymi migrującymi i rezydentnymi komórkami węzłów chłonnych pomoże znaleźć nowe cząsteczki docelowe, które umożliwią aktywację lub supresję odpowiedzi immunologicznych podczas stanu zapalnego. W związku z tym konieczne jest wdrożenie opublikowanego enzymatycznego oddzielenia węzła chłonnego.

Poprzednio opublikowane protokoły wykorzystują różne kombinacje trawienia enzymatycznego opartego na kolagenazie z niskim obciążeniem mechanicznym6,19,20. Jednak długie inkubacje z enzymami trawiącymi lub różnymi kombinacjami enzymów trawiennych mogą degradować różne cząsteczki powierzchniowe wymagane do analizy stanu aktywacji i identyfikacji nowych komórek zrębu węzłów chłonnych. W zależności od rodzaju analizy komórek zrębu, bardziej odpowiedni może być protokół Link lub protokół Fletchera. W opisanej procedurze nieco krótsze trawienie enzymatyczne jest połączone z automatyczną dezagregacją mechaniczną w celu zminimalizowania degradacji markerów powierzchniowych żywotnych komórek zrębu węzłów chłonnych. Procedura ta umożliwia wysoce powtarzalną izolację i rozróżnienie populacji komórek zrębu węzłów chłonnych o niskiej zmienności i ponad 95% żywotności. Świeżo wyizolowane komórki zrębu węzłów chłonnych mogą być bezpośrednio wykorzystane do ekspresji markerów powierzchniowych, analizy białek i badań transkrypcyjnych, a także do tworzenia linii komórek zrębu do wykonywania testów funkcjonalnych in vitro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

W tej publikacji wideo i protokole, wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem na zwierzętach zatwierdzonym przez Urząd Kantonalny Bazylea-Miasto, Szwajcaria.

1. Przygotowanie i trawienie węzłów chłonnych

  1. Podgrzej wodę w zlewce do temperatury 37 °C na mieszadle magnetycznym z płytą grzewczą.
  2. Przygotować pożywkę zasadową w następujący sposób: pożywka DMEM (bez pirogronianu) uzupełniona 2% FCS, 1,2 mM CaCl2 i Pen/Strep (100 jednostek penicyliny, 100 μg streptomycyny).
  3. Wysterylizuj wszystkie narzędzia preparacyjne przed użyciem.
  4. Poddaj eutanazji myszy dawcy węzłów chłonnych po uduszeniu CO2 i aseptyczne wypreparowanie węzłów chłonnych. Nie rozcinaj otaczającego tłuszczu. UWAGA: Ten protokół jest zoptymalizowany pod kątem obwodowych węzłów chłonnych drenujących skórę (pachwinowych, ramiennych, pachowych).
  5. Umieść węzły chłonne na sterylnej szalce Petriego zawierającej 2 ml lodowatego podłoża zasadowego.
  6. Rozbić kapsułkę węzłów chłonnych za pomocą dwóch igieł 25 G przymocowanych do strzykawki o pojemności 1 ml.
  7. Przenieść przerwaną tkankę węzłów chłonnych w 5 ml polipropylenowej probówce okrągłodennej zawierającej 750 μl podłoża zasadowego uzupełnionego 1 mg/ml kolagenazy IV i 40 μg/ml DNAzy I.
  8. Dodaj jedno sterylne mieszadło magnetyczne do każdej probówki.
  9. Umieścić probówkę w zlewce z wodą podgrzaną o temperaturze 37 °C i mieszać probówki powoli (1 runda/sek.) przez 30 minut.
  10. Wyjmij rurkę z mieszadła magnetycznego z płytą grzewczą i pozwól, aby fragmenty węzłów chłonnych osiadły.
  11. Ostrożnie usunąć supernatant wzbogacony w "komórkę niezrębową". UWAGA: Jeśli przewiduje się analizę T, B, komórek dendrytycznych i CD45-gp38-CD31-, należy zachować frakcję "komórek niezrębowych".
  12. Pozostałą tkankę węzłów chłonnych przepłukać jednorazowo 750 μl podłoża zasadowego. UWAGA: Ten krok jest konieczny tylko w przypadku pracy z myszami kompetentnymi immunologicznie.
  13. Niech fragmenty węzłów chłonnych osiądą.
  14. Usuń frakcję pływającą w komórkach niezrębowych.
  15. Dodać do fragmentów węzłów chłonnych 750 μl podłoża zasadowego uzupełnionego 3,5 mg/ml kolagenazy D i 40 μg/ml DNazy I.
  16. Umieścić probówkę z powrotem w zlewce zawierającej wodę podgrzaną do 37 °C.
  17. Trawić tkankę węzłów chłonnych przez 5 minut, powoli mieszając.
  18. Zdezagreguj fragmenty tkanki węzłów chłonnych poprzez pipetowanie i mieszanie 700 μl przez 10 cykli z maksymalną prędkością za pomocą automatycznej pipety wielokanałowej. UWAGA: To zaburza tkankę węzłów chłonnych, aby poprawić trawienie.
  19. Umieścić probówkę z powrotem w zlewce z wodą podgrzaną o temperaturze 37 °C.
  20. Trawić fragmenty tkanki węzłów chłonnych przez kolejne 10 minut, powoli mieszając.
  21. Dezagreguj fragmenty tkanki węzłów chłonnych poprzez pipetowanie i mieszanie przez 99 cykli z maksymalną prędkością za pomocą automatycznej pipety wielokanałowej.
  22. Dodać 7,5 μl 0,5 M EDTA, aby zapewnić utrzymanie zawiesiny pojedynczej komórki.
  23. Dezagreguj fragmenty tkanki węzłów chłonnych poprzez pipetowanie i mieszanie przez 99 cykli z maksymalną prędkością za pomocą automatycznej pipety wielokanałowej.
  24. Dodać 750 μl podłoża zasadowego i przepuścić komórki przez siatkę nylonową o grubości 70 μm.
  25. Zawiesina komórek wirówki 5 min przy 1 500 x g, 4 °C.
  26. Komórki zrębu można teraz wykorzystać do dalszej analizy.

2. Barwienie komórek zrębu węzłów chłonnych

  1. Użyj kombinacji przeciwciał anty-CD45, anty-podoplaniny (gp38), anty-CD31, aby skutecznie rozpoznać komórki TRC, LEC, BEC i DN.
  2. Inkubować strawioną tkankę węzłów chłonnych za pomocą Live/Dead tracker, anty-CD45-FITC (1:200), anty-gp38-PE (1:200), anty-CD31-APC (1:200) w 100 μl HBSS zawierającego 2% FCS przez co najmniej 20 minut, 4 °C, w ciemności.
  3. Umyć komórki, dodając 500 l HBSS zawierającego 2% FCS
  4. Zawiesina komórek wirówki 3 min przy 1500 x g, 4°C.
  5. Zawiesić ponownie w 100 μl HBSS zawierającego 2% FCS.
  6. Wybarwione komórki należy uruchomić w cytometrze przepływowym wyposażonym w następujący układ optyczny: źródło wzbudzenia z maksymalnie trzema laserami: niebieskim (488 nm, chłodzony powietrzem, półprzewodnikowym 20 mW), czerwonym (633 nm, 17 mW HeNe) i fioletowym (405 nm, 30 mW półprzewodnikowym).
  7. Bramka CD45- komórki w celu wykluczenia komórek krwiotwórczych.
  8. Pojedyncze bramki (FSC-W) i żywe komórki (tracker LIVE/DEAD) w celu wykluczenia dubletów i martwych komórek.
  9. Wykreśl komórki gp38 w porównaniu z CD31, aby uwidocznić komórki TRC (gp38+CD31-), LEC (gp38+CD31+), BEC (gp38-CD31+) i DN (gp38-CD31-) (patrz rysunek 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół jest zmodyfikowanym protokołem trawienia opublikowanym przez Linka i wsp.., 20076 z krótszym czasem trawienia (maksymalnie 45 min) dzięki mechanicznemu rozdrabnianiu z użyciem zautomatyzowanej pipety wielokanałowej. Ponadto procedura ta jest bardziej ustandaryzowana, minimalizuje degradację markerów powierzchniowych na różnych komórkach zrębu węzłów chłonnych i pozwala na jednoczesną obróbkę więcej niż jednej próbki.

Kolagenaza IV i kolagenaza D w protoko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Badanie komórek zrębu węzłów chłonnych stało się ostatnio przedmiotem badań ze względu na opracowanie dwóch opublikowanych protokołów trawienia6,13. Oba protokoły są wystarczające do uzyskania pojedynczych komórek zrębu węzłów chłonnych, ale różnią się wykorzystaniem enzymów trawiennych i czasem trawienia. Ponieważ komórki zrębu i ich markery powierzchniowe są wrażliwe na trawienie enzymatyczne i stres mechaniczny, wymagany jest zoptymalizowany protokół.

Izolacja żywotnych komórek z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy dziękują Sanjiv Lutherowi i kolegom za pomocne dyskusje w ustaleniu obecnego protokołu trawienia węzłów chłonnych. Prace te były wspierane przez granty SNF PPOOA-_119204 oraz PPOOP3_144918 dla S.W.R.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEMLifeTechnologies-Gibco41965-039
FCSStężenie końcowe 2%
CaCl2Sigma 499609Stężenie końcowe 1,2 mM
Kolagenaza IVWorthington Biochemical Corporation>160 jednostek na mg suchej masy, stosować w końcowym stężeniu 1 mg / ml
Kolagenaza DRoche11088882001stosować w dawce 3,5 mg/ml
DNAzy IRoche 11284932001użyciu przy 40 &mikro; g/ml
Magnesy mieszająceFAUST5 mm dł.-2 mm & oslash;
Polistyrenowe probówki z okrągłym dnem 5 mlFalcon-BD Bioscience
Mieszadło magnetyczne z funkcją grzaniaIKA-RCT-standard9720250
szalki Petriego 100 mm, sterylneTPP6223201
igły 25 GTerumo
anti mouse CD45 AbBiolegendClone 30-F11
anti mouse CD11c AbBiolegendClone N418
przeciw myszy Podoplanin AbBiolegendClone 8.1.1
przeciw myszy CD31 AbBiolegendClone MEC13.3

Eppendorf Xplorer plus, wielokanałowy		Eppendorf4861 000.821/8301.250 µ l maksymalna głośność
anty myszy CD140aBiolegendClone APA5
anty myszy CD80BiolegendClone 16-10A1
anty myszy CD40BiolegendClone 1C10
anty myszy I-AbBiolegendClone AF6-120.1
anty myszy CD274 (PD-L1)BiolegendClone 10F.9G2
ŻYWY/MARTWY Naprawialny Zestaw do barwienia martwych komórek w bliskiej podczerwieniInvitrogenL10119

Bibliografia

  1. Mueller, S. N., Ahmed, R. Lymphoid stroma in the initiation and control of immune responses. Immunological reviews. 224, 284-294 (2008).
  2. Roozendaal, R., Mebius, R. E. Stromal Cell - Immune Cell Interactions. Annual Review of Immunology. 29 (1), 23-43 (2011).
  3. Turley, S. J., Fletcher, A. L., Elpek, K. G. The stromal and haematopoietic antigen-presenting cells that reside in secondary lymphoid organs. Nature Reviews Immunology. 10 (12), (2010).
  4. Bajénoff, M., et al. Stromal cell networks regulate lymphocyte entry, migration, and territoriality in lymph nodes. Immunity. 25 (6), 989-1001 (2006).
  5. Katakai, T., Hara, T., Sugai, M., Gonda, H., Shimizu, A. Lymph node fibroblastic reticular cells construct the stromal reticulum via contact with lymphocytes. The Journal of experimental medicine. 200 (6), 783-795 (2004).
  6. Link, A., et al. Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells. Nature Immunology. 8 (11), 1255-1265 (2007).
  7. Malhotra, D., et al. Transcriptional profiling of stroma from inflamed and resting lymph nodes defines immunological hallmarks. Nature Immunology. 13 (5), 499-510 (2012).
  8. Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of experimental medicine. 192 (10), 1425-1440 (2000).
  9. Sixt, M., et al. The conduit system transports soluble antigens from the afferent lymph to resident dendritic cells in the T cell area of the lymph node. Immunity. 22 (1), 19-29 (2005).
  10. MartIn-Fontecha, A., et al. Regulation of dendritic cell migration to the draining lymph node: impact on T lymphocyte traffic and priming. The Journal of experimental medicine. 198 (4), 615-621 (2003).
  11. Luther, S. A., Tang, H. L., Hyman, P. L., Farr, A. G., Cyster, J. G. Coexpression of the chemokines ELC and SLC by T zone stromal cells and deletion of the ELC gene in the plt/plt mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (23), 12694-12699 (2000).
  12. Braun, A., et al. Afferent lymph-derived T cells and DCs use different chemokine receptor CCR7-dependent routes for entry into the lymph node and intranodal migration. Nature Immunology. 12 (9), 879-887 (2011).
  13. Fletcher, A. L., et al. Reproducible isolation of lymph node stromal cells reveals site-dependent differences in fibroblastic reticular cells. Frontiers in immunology. 2, 35(2011).
  14. Lukacs-Kornek, V., et al. Regulated release of nitric oxide by nonhematopoietic stroma controls expansion of the activated T cell pool in lymph nodes. Nature Immunology. 12 (11), 1096-1104 (2011).
  15. Siegert, S., et al. Fibroblastic reticular cells from lymph nodes attenuate T cell expansion by producing nitric oxide. PLoS ONE. 6 (11), e27618(2011).
  16. Khan, O., Headley, M., Gerard, A., Wei, W., Liu, L., Krummel, M. F. Regulation of T cell priming by lymphoid stroma. PLoS ONE. 6 (11), e26138(2011).
  17. Svensson, M., Maroof, A., Ato, M., Kaye, P. M. Stromal cells direct local differentiation of regulatory dendritic cells. Immunity. 21 (6), 805-816 (2004).
  18. Onder, L., et al. Endothelial cell-specific lymphotoxin-β receptor signaling is critical for lymph node and high endothelial venule formation. The Journal of experimental medicine. 210 (3), 465-473 (2013).
  19. Fletcher, A. L., et al. Lymph node fibroblastic reticular cells directly present peripheral tissue antigen under steady-state and inflammatory conditions. The Journal of experimental medicine. 207 (4), 689-697 (2010).
  20. Fletcher, A. L., Malhotra, D., Turley, S. J. Lymph node stroma broaden the peripheral tolerance paradigm. Trends in Immunology. 32 (1), 12-18 (2011).
  21. Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).
  22. Lee, J. -W., et al. Peripheral antigen display by lymph node stroma promotes T cell tolerance to intestinal self. Nat Immunol. 8, 181-190 (2006).
  23. Nichols, L. A., et al. Deletional self-tolerance to a melanocyte/melanoma antigen derived from tyrosinase is mediated by a radio-resistant cell in peripheral and mesenteric lymph nodes. J Immunol. 179, 993-1003 (2007).
  24. Gardner, J. M., et al. Deletional tolerance mediated by extrathymic Aire-expressing cells. Science. 321, 843-847 (2008).
  25. Gardner, J. M., et al. Extrathymic Aire-expressing cells are a distinct bone marrow-derived population that induce functional inactivation of CD4+ T cells. Immunity. 39, 560-572 (2013).
  26. Magnusson, F. C., et al. Direct presentation of antigen by lymph node stromal cells protects against CD8 T-cell-mediated intestinal autoimmunity. Gastroenterology. 134, 1028-1037 (2008).
  27. Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

trawienie enzymatycznedysagregacja mechanicznacytometria przep ywowakolagenaza DDNAza Imarkery powierzchniowe kom rekCD31 GP38izolacja kom rek stromalnychautomatyczna pipeta

Powiązane artykuły