Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wizualizacja endocytozy receptorów sprzężonych z białkiem G za pośrednictwem klatryny w rozdzielczości pojedynczego zdarzenia za pomocą mikroskopii TIRF

70.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51805

⸱

20 października 2014

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Carnegie Mellon University

W tym artykule

Podsumowanie

Endocytoza za pośrednictwem klatryny, szybki i bardzo dynamiczny proces internalizuje wiele białek, w tym receptory sygnałowe. Opisany tutaj protokół bezpośrednio wizualizuje kinetykę poszczególnych zdarzeń endocytarnych. Ma to zasadnicze znaczenie dla zrozumienia, w jaki sposób rdzeniowi członkowie maszynerii endocytarnej koordynują się ze sobą i jak ładunek białka wpływa na ten proces.

Streszczenie

Wiele ważnych receptorów sygnałowych jest internalizowanych przez dobrze zbadany proces endocytozy za pośrednictwem klatryny (CME). Tradycyjne testy biologiczne komórek, mierzące globalne zmiany w endocytozie, zidentyfikowały ponad 30 znanych składników uczestniczących w CME, a badania biochemiczne wygenerowały mapę interakcji wielu z tych składników. Staje się jednak coraz bardziej oczywiste, że CME jest bardzo dynamicznym procesem, którego regulacja jest złożona i delikatna. W tym manuskrypcie opisujemy zastosowanie mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) do bezpośredniej wizualizacji dynamiki składników maszynerii endocytarnej za pośrednictwem klatryny, w czasie rzeczywistym w żywych komórkach, na poziomie poszczególnych zdarzeń, które pośredniczą w tym procesie. Takie podejście jest niezbędne do wyjaśnienia subtelnych zmian, które mogą zmienić endocytozę bez jej globalnego blokowania, jak to widać w przypadku regulacji fizjologicznej. Skupimy się na wykorzystaniu tej techniki do analizy obszaru pojawiającego się zainteresowania, jakim jest rola składu ładunku w modulowaniu dynamiki odrębnych dołów pokrytych klatryną (CCP). Protokół ten jest kompatybilny z wieloma powszechnie dostępnymi sondami fluorescencyjnymi i może być stosowany do wizualizacji dynamiki wielu cząsteczek ładunku, które są internalizowane z powierzchni komórki.

Wprowadzenie

Proces endocytozy za pośrednictwem klatryny (CME) zależy od nadejścia w odpowiednim momencie wielu składników maszynerii endocytarnej za pośrednictwem klatryny, które zbierają ładunek i manipulują błoną plazmatyczną do pęcherzyków1-3. CME jest inicjowany przez deformację błony i białka adaptorowe ładunku, które łączą się w powstających miejscach endocytozy1. Białka te rekrutują białko płaszcza, klatrynę, które gromadzi się w strukturę przypominającą klatkę, która tworzy jamę pokrytą klatryną (CCP)4. Gdy CCP jest w pełni złożony w kulisty kształt, rozszczepienie błony, głównie poprzez działanie dużej GTPazy, dynaminy, generuje wolne pęcherzyki pokryte klatryną (CCV)5,6. Ta internalizacja powoduje szybki demontaż powłoki klatryny, co pozwala na ponowne użycie komponentów w wielu rundach CME.

Odkrycie i charakterystyka białek związanych z CME jest zakorzenione w tradycyjnych technikach biochemicznych, genetycznych i mikroskopowych4-6,8. Testy te wyjaśniły role i punkty interakcji tych składników endocytarnych. Chociaż testy te są bardzo przydatne do definiowania podstawowych komponentów maszyn do transportu, są one bardzo ograniczone w uchwyceniu dynamicznego zachowania składników CME lub koncentracji ładunku. Jest to krytyczne ograniczenie, ponieważ CME jest napędzany przez choreograficzny montaż zestawów modułów białkowych w określonych krokach, a także ponieważ niewielkie zmiany w dynamice poszczególnych zdarzeń endocytarnych mogą mieć duże skumulowane konsekwencje dla endocytozy. Co więcej, ostatnie dane wskazują, że poszczególne CCP mogą różnić się zarówno składem, jak i zachowaniem, co sugeruje, że fizjologiczna regulacja tego procesu jest wysoce ograniczona przestrzennie iczasowo9-14. Wizualizacja poszczególnych zdarzeń endocytarnych jest zatem niezbędna, aby zrozumieć, dlaczego w CME zaangażowanych jest wiele nadmiarowych białek i w jaki sposób białka te mogą być kontrolowane przez sygnały fizjologiczne w celu regulacji internalizacji ładunku.

Tutaj opisujemy użycie Mikroskopii Fluorescencyjnej Całkowitego Wewnętrznego Odbicia (TIRFM) do obserwacji CME na poziomie dynamiki poszczególnych CCP w żywych komórkach. TIRFM opiera się na różnicy w współczynniku załamania światła między szkiełkiem nakrywkowym szkła a płynnym środowiskiem komórek15,16. Gdy światło wzbudzenia jest kierowane w stronę komórek pod kątem większym niż krytyczny, jest ono odbijane wewnętrznie, tworząc ulotną falę, która utrzymuje cienkie pole oświetlenia rozciągające się około 100 nm nad szkiełkiem nakrywkowym. Gwarantuje to, że wzbudzane są tylko cząsteczki fluorescencyjne w tym wąskim polu. W praktyce pozwala to na wzbudzenie cząsteczek fluorescencyjnych na błonie plazmatycznej lub w jej pobliżu i minimalizuje fluorescencję z wewnętrznych części komórki. Zapewnia to znacznie wyższy stosunek sygnału do szumu i rozdzielczość osi z w celu wizualizacji zdarzeń na błonie plazmatycznej, w porównaniu z częściej stosowanymi trybami, takimi jak konwencjonalna epifluorescencja lub konfokalna mikroskopia fluorescencyjna. Opisujemy również, na poziomie wstępnym i praktycznym, wykorzystanie powszechnie używanej platformy analizy obrazu do analizy i kwantyfikacji prostych cech morfologicznych i dynamiki poszczególnych zdarzeń endocytarnych ładunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Ekspresja fluorescencyjnie oznaczonych składników CME w hodowanych komórkach

Komórki HEK293 są użytecznymi komórkami modelowymi, które były szeroko wykorzystywane do badania biologii GPCR i endocytozy, i dlatego są używane jako modele w tym protokole. Należy użyć dowolnego protokołu transfekcji, zapewniając jednolitą ekspresję bez nadekspresji i niskiej cytotoksyczności.

  1. Utrzymuj wszystkie hodowle komórkowe w sterylnym kapturze z przepływem laminarnym. Napełnij 4 dołki 12-dołkowej płytki 1 ml zmodyfikowanej pożywki eterycznej (DMEM) firmy Dulbecco z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Z konfluentnej kolby T25 komórek HEK293 rozcieńczyć odpowiednio 1:50, 1:25, 1:16, 1:10 do każdej z 4 studzienek.
    1. Alternatywnie, wysiewaj komórki na płytkę wielodołkową o pożądanym rozmiarze, zgodnie z instrukcjami producenta. Wysiew 0,4 - 2 x 104 komórek na płytkę 12-dołkową. Hoduj komórki przez noc w sterylnym pomieszczeniu o temperaturze 37 °C z 5% CO2 i wilgotnością 95%.
      UWAGA: Biorąc pod uwagę, że tempo wzrostu różni się w zależności od warunków i linii komórkowych, preferowane może być zasianie wielu dołków, aby zapewnić idealną konfluencję do transfekcji następnego dnia lub możliwość wykonania transfekcji w dwóch egzemplarzach.
  2. Następnego ranka wybierz studzienkę, która jest ~70% zlewająca się do transfekcji (patrz Rysunek 1B). Jeśli żadna studnia nie osiągnęła tego stanu, poczekaj kolejny dzień.
    UWAGA: 70% konfluencja jest idealna dla komórek HEK293. Transfekcja komórek, które są rzadsze, powoduje śmierć komórki i toksyczność. Transfekcja nadmiernie zlewających się komórek powoduje słabą ekspresję.
  3. Dodać 60 μl buforu EC (z zestawu do transfekcji), 400 ng plazmidów kodujących znakowane GPCR i/lub składniki maszynerii klatrynowej oraz 2,4 μl wzmacniacza do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, zgodnie z opisem w protokole producenta. Wiruj przez 2 sekundy, aby zapewnić wystarczające wymieszanie, i wiruj w mikrofudze o masie 2,000 x g przez 2 sekundy, aby zebrać płyn na dnie.
  4. Dodać 6 μl Effectenu zgodnie z opisem w protokole producenta. Wiruj przez 2 sekundy i wiruj z prędkością 2,000 x g przez 2 sekundy w mikrofudzie, aby zebrać płyn na dnie. Odczekaj 20 minut, aby umożliwić utworzenie się miceli kompleksu transfekcji.
  5. Odessać pożywkę ze studni, która ma być transfekowana. Delikatnie dodać 0,8 ml DMEM z 10% FBS do mieszaniny odczynników do transfekcji i mieszać, pipetując powoli w górę iw dół, aby zmniejszyć pękanie miceli. Dodaj pożywkę i mieszaninę transfekcji do studzienki bardzo powoli z boku. Dodać pozostałą mieszaninę transfekcji z probówki mikrowirówki do studzienki za pomocą mikropipetora.
    UWAGA: Opcjonalnie dodaj dodatkowe 0,5 ml DMEM z 10% FBS do transfekowanej studzienki, aby zapewnić komórkom dodatkowe pożywienie, co skutkuje łagodniejszą transfekcją i niższą przejściową ekspresją.
  6. Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 5 godzin.
  7. Pożywka aspiracyjna zawierająca mieszaninę transfekcyjną. Zastąp 1 ml DMEM 10% FBS. Pozwól komórkom rosnąć przez noc.
  8. Następnego dnia przełóż komórki do niepowlekanych szkiełek nakrywkowych, uprzednio wysterylizowanych w autoklawie.
    1. Dodać 0,5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) z 1 mM EDTA do każdej studzienki. Alternatywnie użyj 0,5 ml 0,05% trypsyny-EDTA. Pozostawić w inkubatorze na 1 minutę.
    2. Umieść 3 okrągłe, sterylne szkiełka nakrywkowe o średnicy 25 mm w oddzielnych dołkach na płytce 6-dołkowej. Napełnij każdą studzienkę 2 ml podłoża. Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe do dna szkiełka, aby zapobiec wzrostowi komórek na dnie szkiełka nakrywkowego.
    3. Ręcznie zamieszaj studzienkę, aby podnieść komórki z dna studzienki. Dodać 1 ml DMEM z 10% FBS do ponownego zawieszenia. Rozprowadzić podniesione komórki z 1 dołka płytki 12-dołkowej równomiernie między 3 szkiełka nakrywkowe. Alternatywnie, ułóż komórki na 3 naczyniach ze szklanym dnem.
  9. Pozwól komórkom rosnąć na szkiełkach nakrywkowych przez co najmniej 48 godzin przed obrazowaniem. Upewnij się, że komórki są rozłożone i płaskie.

2. Obrazowanie CCP i dynamiki ładunku za pomocą TIRFM

  1. Sprzęż przeciwciała anty-FLAG M1 z barwnikami Alexa za pomocą zestawu do znakowania białek Alexa Fluor zgodnie z protokołem producenta. Alternatywnie można zakupić wstępnie sprzężone przeciwciała.
  2. Wstępnie inkubować komórki z przeciwciałami w rozcieńczeniu 1:1 000 w 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki Leibovitz z 10% FBS lub Opti-MEM z 50 mM HEPES pH 7,4 i 10% FBS przez 10 minut w temperaturze 37 °C (podłoże do obrazowania), aby oznaczyć na powierzchni komórki GPCR oznaczone FLAGĄ. Pomiń te kroki, jeśli genetycznie kodowane białka fluorescencyjne, takie jak GFP, są używane jako znaczniki (zobacz dyskusję, aby uzyskać szczegółowe informacje).
  3. Przenieść szkiełko nakrywkowe do komory obrazowania żywych komórek. Alternatywnie, w przypadku naczyń ze szklanym dnem, odessać pożywkę znakującą przeciwciała i dodać 700 μl wstępnie podgrzanej pożywki do obrazowania.
    1. Użyj kleszczy i zegnij końcówkę igły o rozmiarze 25 w haczyk.
    2. Trzymaj parę kleszczy w dominującej ręce. Przytrzymaj wygiętą igłę w drugiej. Obróć igłę, aż haczyk zakrzywi się w dół w kierunku szkła. Delikatnie przeciągnij igłę, haczykiem do dołu, po dnie płytki 6-dołkowej, aż zaczepi się o szkiełko nakrywkowe. Uważaj, aby nie zarysować powierzchni szkiełka nakrywkowego, ponieważ spowoduje to oderwanie komórek. Delikatnie podnieś szkiełko nakrywkowe z dna studzienki. Przyłóż szkiełko nakrywkowe do ściany studni, aby uzyskać podparcie.
    3. Za pomocą kleszczyków chwycić blisko krawędzi szkiełka nakrywkowego i przesunąć stronę komórki szkiełka nakrywkowego do góry do komory obrazowania, a następnie zmontować komorę. Dodać 700 μl (lub odpowiednią ilość) wstępnie podgrzanego podłoża do obrazowania. Z szkiełkami nakrywkowymi należy obchodzić się ostrożnie, bez nacisku, aby zapobiec pękaniu lub pękaniu.
  4. Przenieść komorę do mikroskopu i utrzymywać temperaturę komórek na poziomie 37 °C za pomocą podgrzewacza stopniowego lub dołączonego inkubatora.
  5. Ustaw ostrość komórek za pomocą obiektywu zanurzeniowego TIRF 100X lub 60X (1,45 NA lub więcej). Zobrazuj komórki w konwencjonalnych epifluorescencyjnych lub konfokalnych trybach oświetlenia (tj. nie TIRFM), aby zidentyfikować komórki wyrażające odpowiednie konstrukty. Nieostre komórki są prawie niewidoczne w cienkim oświetleniu TIRF, co utrudnia znalezienie płaszczyzny ogniskowej i komórek.
    UWAGA: Niektóre systemy wykorzystują te same lasery dla TIRFM do obrazowania w konwencjonalnej epifluorescencji, przesuwając kąt padania lasera powyżej kąta krytycznego. Jako ważny środek ostrożności należy zawsze zwracać uwagę na kąt wiązki laserowej i zawsze kierować ją z dala od obserwatora.
  6. Skoncentruj się na dolnej powierzchni komórki wykazującej ekspresję, aż zniknie zarys błony plazmatycznej wokół komórki i pojawi się środek komórki. Jest to najbardziej widoczne w przypadku zlokalizowanego białka ładunkowego błony komórkowej, takiego jak receptor opioidowy μ (patrz ryc. 2A).
  7. Przełącz się na obrazowanie TIRF.
    1. W przypadku używania tych samych laserów do obrazowania w konwencjonalnej epifluorescencji należy zwiększać kąt padania lasera, aż zniknie nieostra fluorescencja we wnętrzu komórki i nie będzie widać zarysu błony plazmatycznej wokół komórki. (Porównaj rysunek 2C z rysunkami 2A i 2B)
      UWAGA: W TIRFM przesunięcie płaszczyzny ogniskowej powoduje, że obraz staje się całkowicie nieostry i/lub przyciemniany, a ogólny poziom fluorescencji zmniejsza się ze względu na mniejszą głębię oświetlenia. Dlatego alternatywną metodą przełączenia na oświetlenie TIRFM jest najpierw skupienie się na środku komórki w konfokalnej/konwencjonalnej epifluorescencji, następnie zwiększanie kąta padania, aż do utraty większości fluorescencji, a następnie skupienie się na błonie plazmatycznej.
    2. W TIRFM upewnij się, że laser wzbudzający odbija się z powrotem przez obiektyw i nie jest widoczny nad obiektywem. Potwierdź to, sprawdzając, czy plamka lasera jest widoczna.
      UWAGA: W konwencjonalnych trybach epifluorescencji lub konfokalnym oświetlenie laserowe jest widoczne nad obiektywem, na przykład na suficie.
    3. Popraw ostrość, aby uzyskać wyraźny obraz. Główne składniki maszynerii endocytarnej, takie jak klatryna, będą widoczne w puncta. Dostosuj ostrość do dokładnego, tak aby puncta były jak najbardziej okrągłe.
      UWAGA: W przypadku ładunku zlokalizowanego na błonie należy dostosować precyzyjną ostrość, aż filopodia będą wyraźnie widoczne.
    4. Użyj programu akwizycyjnego, aby zapisać wszystkie parametry obrazowania, takie jak lustra i kąt TIRF. Zrób to dla wszystkich niezbędnych długości fal.
  8. Zeskanuj szkiełko nakrywkowe, aby znaleźć komórki wyrażające wszystkie pożądane markery endocytarne: receptor opioidowy μ i adapter β-aresztyny w przykładzie pokazanym na rysunku 3A. Zaznacz komórki, które wyrażają się, ale nie mają nadmiernej ekspresji. Zobacz dyskusję, aby uzyskać szczegółowe informacje.
  9. Po zidentyfikowaniu komórek pobieraj obrazy co 3 sekundy przez 10 minut. Jest to wystarczające do uchwycenia czasu życia CCP, ponieważ średni czas życia CCP w komórkach HEK293 zobrazowanych w tych warunkach wynosi około 40 sekund10-11. Pozwala to na obserwację KPCh w około 12-14 ramkach. Na przykład zobacz Film 1. Powtórz wszystkie kroki, aby zobrazować dodatkowe komórki.

3. Analiza dynamiki endocytarnej za pomocą ręcznej weryfikacji

Chociaż ręczna weryfikacja czasu życia CCP jest znacznie ograniczona przez liczbę CCP, które mogą być wykryte, nadal pozostaje dokładnym sposobem wykrywania, niezrażonym globalnymi zmianami w obrazie i artefaktach wykrywania. Zobacz dyskusję, aby uzyskać szczegółowe informacje.

  1. Otwórz plik w programie ImageJ. Obrazy są przechowywane jako pojedynczy stos plików tiff z kanałami z przeplotem. Konwertuj obrazy na hyperstacks. Przejdź do pozycji Obraz > Hyperstacks > Stosu do Hyperstack. Wprowadź liczbę przejętych kanałów (np. jeśli obrazowanie β-aresztinę i receptor μ-opioidowy, wprowadź 2), wprowadź 1 dla stosu Z (TIRFM to pojedyncza płaszczyzna), a liczbę klatek filmu (tj. 10-minutowy film przy 1 klatce co 3 sekundy to 200) w wyskakującym okienku.
  2. Format hyperstack daje okno z dwoma paskami przewijania. Użyj górnego paska, aby poruszać się po kanałach, a dolnego, aby poruszać się w czasie. Przewiń do kanału białka, którego czas życia zostanie oznaczony.
  3. Przejdź do klatki 10 lub 15 filmu, aby ograniczyć włączenie istniejących wcześniej krytycznych punktów kontroli, których cały czas trwania nie jest widoczny. Narysuj pole ROI wokół losowo wybranego miejsca.
  4. Policz liczbę klatek, w których widoczny jest spot.
    UWAGA: Patrz rysunki 3B i 3C, aby zapoznać się z przykładami trzech kategorii morfologicznych zdarzeń endocytarnych10,11,16-19.

4. Analiza dynamiki endocytarnej przez obiektywne rozpoznanie

Rozpoznawanie celów pozwala na wykrycie praktycznie wszystkich zobrazowanych CCP w komórce, ale może być podatne na błędy z powodu fałszywego wykrywania błędnych struktur. Zapoznaj się z dyskusją, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat zalet i wad każdej metody. Do obiektywnego wykrywania CCP można wykorzystać kilka programów, w tym algorytmy opracowane na zamówienie. Protokół ten opisuje obiektywne rozpoznawanie krytycznych punktów kontroli za pomocą Imaris, oprogramowania do analizy obrazów (patrz Materiały).

  1. Aby rozpocząć, otwórz plik obrazu RAW w oprogramowaniu do analizy obrazu. Domyślnie wyświetlany jest scalony kolorowy obraz. Użyj okna "Regulacja wyświetlania", aby dostosować jasność kanału. Kliknij nazwę kanału, aby zmienić wyświetlany kolor. Usuń zaznaczenie pola obok kanału, aby zapobiec jego wyświetlaniu (patrz Rysunek 4A).
  2. Utwórz "Plamy", klikając ikonę z pomarańczowymi plamkami. Zobacz rysunek 4B. Wybierz obszar zainteresowania (ROI) wokół komórki. Zobacz rysunek 4C. Użyj ROI, aby wykluczyć obszary, które będą nieprawidłowo wykrywać jasne krawędzie natarcia i płytki. Oddzielnie analizuj wiele komórek o różnych poziomach wyrażeń.
  3. Zmierz średnicę plamki, aby zapewnić wstępne oszacowania dla algorytmu. Przełącz się w tryb "Slice" i kliknij biegunowe końce plamki, aby zmierzyć jej średnicę. Zobacz rysunek 4E. Zrób to dla 4 lub 5 okrągłych miejsc, które wyglądają wskazując na CCP na wysokości jego stabilności, po uformowaniu i przed rozcięciem. Użyj tych pomiarów, aby obliczyć średnią średnicę z dokładnością do najbliższej dziesiątej części mikrona.
  4. Wykrywaj miejsca. Wróć do trybu "Przekrocz". Wybierz odpowiedni kanał do wykrywania. Wprowadź średnią zmierzoną średnicę, zwykle 0,3 lub 0,4 μm. Kliknij niebieską strzałkę do przodu, aby określić ilościowo plamy. Zobacz rysunek 4E. Jeśli średnica plamek jest niedoszacowana, fałszywe punkty fluorescencji zostaną zidentyfikowane jako plamki. Jeśli średnica jest zbyt duża, prawdziwe plamki zostaną zignorowane. Jeśli nie masz pewności, oszacuj nieco niżej i odfiltruj nieprawidłowe wykrycia później.
  5. Filtruj miejsca według jakości. Dostosuj filtr, aby uchwycić jak najwięcej miejsc bez tła. Filtr Jakość jest domyślnie zaznaczonyjako 20. Zobacz rysunek 4F.
    1. Użyj krzywej "Jakość" jako przewodnika, aby ustawić odpowiedni próg. Przesuń dolny próg filtra lewym przyciskiem myszy do tego pierwszego zanurzenia krzywej. Jest to dobry punkt wyjścia dla filtra, ponieważ ta pozycja zwykle zawęża wykrywanie tylko do widocznych punktów. Zobacz rysunek 4F.
    2. Wykryte punkty pojawiają się w filmie jako sfery lub wyśrodkowane piksele. Korzystając z zakładki "Kolory", dostosuj kolor plam do kontrastowego koloru, aby łatwiej było je zobaczyć. Przewiń film, aby przejrzeć plamy w każdej klatce. Celem jest wykrycie jak największej liczby plam przez cały okres ich istnienia.
    3. Wyeliminuj ciemne miejsca lub ręcznie połącz je później w ciągłe ścieżki, ponieważ nie są one dobrze wykrywane przez cały okres ich życia.
    4. W razie potrzeby usuń jasne płytki za pomocą filtra "Intensywność". Kliknij zielony znak plus, aby dodać nowy filtr. Zobacz rysunek 4F. Utwórz filtr Intensywność, aby odfiltrować lub odfiltrować punkty danych sygnałów fluorescencyjnych. Użyj wygenerowanej krzywej intensywności (analogicznej do krzywej jakości omówionej w punkcie 4.5), aby ustawić próg. Użyj lewego przycisku myszy, aby usunąć skrajny lewy koniec krzywej, który reprezentuje najjaśniejsze punkty.
      UWAGA: Duże struktury płytki nazębnej są zwykle jednymi z najjaśniejszych elementów w komórce i można je łatwo wykluczyć za pomocą tego filtra.
    5. Przewiń film, aby upewnić się, że CCP są wykrywane jako plamy, a najjaśniejsze blaszki nie są już wykrywane. Rysunek 3D przedstawia komórkę, w której wykrywanie CCP (oznaczonych białymi kulkami) zostało zoptymalizowane za pomocą filtra jakości, a płytki nazębne zostały wykluczone za pomocą filtra jakości.
    6. Zmniejsz jasne krawędzie komórek za pomocą wysokiej jakości filtra. Jasne obiekty mogą nadal wymagać ręcznego usunięcia w następnym kroku. Kontynuuj za pomocą niebieskiej strzałki.
    7. Usuń nieprawidłowe plamy na ekranie edycji plam. Przełącz na tryb "Wybierz". Kliknij na miejscu. Zmieni kolor na żółty. Kliknij "Usuń". Kliknij niebieską strzałkę, aby kontynuować tworzenie algorytmu. Zobacz rysunek 4G.
  6. Mierzenie ścieżek. Ustaw ścieżki na "ruch Browna". CCP nie powinien wykazywać żadnego ukierunkowanego ruchu, a jedynie minimalne dryfowanie po błonie plazmatycznej. Ten algorytm jest najbardziej odpowiedni dla tego ruchu. Zobacz rysunek 4H.
    1. Ustaw maksymalną odległość na małą wartość, taką jak 0,7 μm. Patrz rysunek 4H.
      UWAGA: Ustawienie małej odległości minimalizuje połączenie sąsiednich punktów i nadal pozwala na ciągłe śledzenie plamki komórki za pomocą CCP lub ruchu komórki.
    2. Ustaw maksymalny rozmiar odstępu na 1. Dzięki temu ścieżka może być kontynuowana, jeśli brakuje tylko jednej klatki z rzędu. Kliknij niebieską strzałkę, aby obliczyć trasy. Patrz rysunek 4H.
      UWAGA: Odstępy o rozmiarach większych niż 3 powodują, że różne ścieżki są ze sobą nieprawidłowo połączone.
    3. Przełącz oglądanie utworu na "Dragon Tail". Przewiń film, obserwując jakość wykrywania. Jeśli sąsiednie punkty są łączone, zmniejsz maksymalną odległość poniżej 0,7 μm. Jeśli plamy są zbyt łatwo rozdzielane, zwiększ maksymalny rozmiar odstępu. Kliknij niebieską strzałkę, aby utworzyć ścieżki. Prowadzi to do ekranu ścieżek filtra. Zobacz rysunek 4H.
  7. Filtruj ścieżki i eksportuj dane. Użyj filtra "Intensywność", aby usunąć dodatkowe jasne płytki. Użyj filtra "Przemieszczenie", aby usunąć endosomy, które dostają się do pola TIRF. Zachowaj ostrożność, ponieważ dłuższe plamki również będą miały większe przemieszczenia. Kliknij zieloną podwójną strzałkę, aby zakończyć protokół. Zobacz rysunek 4I.
    1. Użyj karty Edytuj ścieżki z ikoną ołówka, aby usunąć fałszywe alarmy wykryte przez ścieżki, których nie można było usunąć za pomocą filtrów. Sprawdź, czy nie ma nieciągłości lub fałszywych połączeń. Aby połączyć dwie ścieżki, zaznacz je za pomocą Ctrl-Lewy przycisk myszy, a następnie kliknij "Połącz" w polu Edytuj ścieżki. Aby rozłączyć ścieżki w oddzielnych miejscach, wybierz ścieżkę i naciśnij "Rozłącz". Zaznacz wiele miejsc za pomocą Ctrl + lewy przycisk myszy i kliknij "Połącz", aby utworzyć nową ścieżkę. Metoda jest taka sama dla Edycji Punktów, opisana w 4.5.7. Zobacz rysunek 4J.
    2. W celu wyeksportowania danych należy przejść do zakładki statystyki. Kliknij na ikonę pojedynczej dyskietki, aby wyeksportować wybraną statystykę. Kliknij ikonę, która wygląda jak seria dyskietek, aby wyeksportować wszystkie statystyki. Statystyka "Czas trwania ścieżki" zawiera długość ścieżek endocytarnych. Zobacz rysunek 4K.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wykorzystując mikroskopię TIRF na żywych komórkach, zarejestrowaliśmy dynamikę endocytozy receptora opioidowego µ (MOR), który jest receptorem sprzężonym z białkiem G (GPCR), oraz jego białka adaptacyjnego endocytozy β-arrestyny. Konstrukt β-arrestyny został przejściowo przetransfekowany do linii komórkowej stabilnie ekspresującej MOR zgodnie z protokołem przedstawionym na Rysunku 1, a obrazowanie przeprowadzono 96 h później. Receptor MOR w stabilnej linii komórkowej jest oznakowany na N-końcu białkiem G...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy zastosowanie TIRFM do wizualizacji endocytozy za pośrednictwem klatryny (CME) na poziomie poszczególnych CCP w żywych komórkach w czasie rzeczywistym. CME jest gwałtownym i wysoce dynamicznym zdarzeniem, w którym pośredniczy skumulowany efekt wielu przestrzennie i czasowo odrębnych pojedynczych zdarzeń. Większość obecnie stosowanych testów, takich jak biochemiczne pomiary internalizacji za pomocą biotynylacji powierzchniowej lub wiązania ligandów, cytometria przepływowa lub testy komórek stałych m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować doktorom C. Szalinski, H. Tengowi i M. Bruchezowi za pomoc w Imaris, R. Visteinowi i D. Shiwarskiemu za pomoc techniczną i porady, a także dr M. von Zastrow, dr T Kirchhausen, dr D Drubina i dr W Almersowi za odczynniki i pomocną dyskusję. Finansowanie z grantu T32 NS007433 SLB i NIH DA024698 oraz DA036086 MAP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEM/Wysoka Glukoza z L-glutaminą i pirogronianem soduFisher Scientific 
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS), bez wapnia, bez magnezuGibco, firmy Life Technologies21600-010
Kwas wolny od EDTAAmresco0322-500G
Surowica bydlęcapłodu, firmy Life Technologies10437-028
Leibovitz's L-15 Medium, bez czerwieni fenolowejGibco, firmy Life Technologies21083-027
Opti-MEMGibco, firmy Life Technologies
HEPESCellPURE firmy Fisher ScientificBP2937-100
EffecteneQiagen301425Odczynnik do transfekcji
25 mm szkło nakrywkoweFisher Scientific12-545-86
Kolby poddane działaniu hodowli komórek Corning, 25 cm2Fisher Scientific10-126-28
Płytka 6-dołkowa do hodowli komórkowychGreiner Bio-One, firmy VWR82050-896
Monoklonalna ANTI-FLAG M1Sigma AldrichF3040-5MG[
D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Sól octanu enkefaliny (DAMGO)Sigma AldrichE7384-5MG
Alexa Fluor 647 Zestawdo znakowania białekLife TechnologiesA20173
ImageJNIHhttp://rsb.info.nih.gov/ij/
Imaris Oprogramowanie do analizy obrazuBitPLanehttp://www.bitplane.com/imaris/imaris, do automatycznej analizy
Mikroskop odwrócony Nikon Eclipse Ti i wymagane akcesoria, w tym kostki filtracyjne i filtryRamię Nikon
Nikon TIRF z wymaganymi adapterami do Nikon Eclipse TiNikonDo regulacji kąta padania
aparatu iXon+ EMCCD i adapterówAndor
SH3024301

Bibliografia

  1. McMahon, H. T., Boucrot, E. Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 517-533 (2011).
  2. Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A Modular Design for the Clathrin- and Actin-Mediated Endocytosis Machinery. Cell. 123 (2), (2005).
  3. Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis. PLoS Biology. 9 (3), (2011).
  4. Ungewickell, E., Branton, D. Assembly units of clathrin coats. Nature. 289 (5796), 420-422 (1981).
  5. Bliek, A. M., Meyerowrtz, E. M. Dynamin-like protein encoded by the Drosophila shibire gene associated with vesicular traffic. Nature. 351 (6325), (1991).
  6. Hinshaw, J. E., Schmid, S. L. Dynamin self-assembles into rings suggesting a mechanism for coated vesicle budding. Nature. 374 (6518), (1995).
  7. Merrifield, C. J., Perrais, D., Zenisek, D. Coupling between Clathrin-Coated-Pit Invagination, Cortactin Recruitment, and Membrane Scission Observed in Live Cells. Cell. 121 (4), 593-606 (2005).
  8. Grabs, D., Slepnev, V. I., et al. The SH3 domain of amphiphysin binds the proline-rich domain of dynamin at a single site that defines a new SH3 binding consensus sequence. The Journal of biological chemistry. 272 (20), 13419-13425 (1997).
  9. Tosoni, D., Puri, C., et al. TTP Specifically Regulates the Internalization of the Transferrin Receptor. Cell. 123 (5), 875-888 (2005).
  10. Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. Cargo Regulates Clathrin-Coated Pit Dynamics. Cell. 127 (1), 113-124 (2006).
  11. Soohoo, A. L., Puthenveedu, M. A. Divergent modes for cargo-mediated control of clathrin-coated pit dynamics. Molecular Biology of the Cell. 24 (11), 1725-1734 (2013).
  12. Posor, Y., Eichhorn-Gruenig, M., et al. Spatiotemporal control of endocytosis by phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate. Nature. 10, (2013).
  13. Mettlen, M., Stoeber, M., Loerke, D., Antonescu, C. N., Danuser, G., Schmid, S. L. Endocytic accessory proteins are functionally distinguished by their differential effects on the maturation of clathrin-coated pits. Molecular Biology of the Cell. 20 (14), 3251-3260 (2009).
  14. Loerke, D., Mettlen, M., et al. Cargo and dynamin regulate clathrin-coated pit maturation. PLoS Biology. 7 (3), (2009).
  15. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. The Journal of Cell Biology. 89 (1), 141-145 (1981).
  16. Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nature Cell Biology. 4 (9), 691-698 (2002).
  17. Ehrlich, M., Boll, W., et al. Endocytosis by random initiation and stabilization of clathrin-coated pits. Cell. 118 (5), 591-605 (2004).
  18. Yarar, D., Waterman-Storer, C. M., Schmid, S. L. A dynamic actin cytoskeleton functions at multiple stages of clathrin-mediated endocytosis. Molecular Biology of the Cell. 16 (2), 964-975 (2005).
  19. Rappoport, J. Z., Kemal, S., Benmerah, A., Simon, S. M. Dynamics of clathrin and adaptor proteins during endocytosis. American journal of physiology. Cell physiology. 291 (5), (2006).
  20. Doyon, J. B., Zeitler, B., et al. Rapid and efficient clathrin-mediated endocytosis revealed in genome-edited mammalian cells. Nature Cell Biology. 13 (3), 331-337 (2011).
  21. Hopp, T. P., Prickett, K. S., et al. A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification. Bio/Technology. 6 (10), 1204-1210 (1988).
  22. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  23. Saffarian, S., Cocucci, E., Kirchhausen, T. Distinct Dynamics of Endocytic Clathrin-Coated Pits and Coated Plaques. PLoS Biology. 7 (9), (2009).
  24. Yudowski, G., Puthenveedu, M., Henry, A., von Zastrow, M. Cargo-Mediated Regulation of a Rapid Rab4-Dependent Recycling Pathway. Molecular Biology of the Cell. 1, 1-11 (2009).
  25. Batchelder, E. M., Yarar, D. Differential Requirements for Clathrin-dependent Endocytosis at Sites of Cell-Substrate Adhesion. Molecular Biology of the Cell. 21 (17), 3070-3079 (2010).
  26. Mattheyses, A. L., Atkinson, C. E., Simon, S. M. Imaging Single Endocytic Events Reveals Diversity in Clathrin, Dynamin and Vesicle Dynamics. Traffic. 12 (10), 1394-1406 (2011).
  27. Aguet, F., Antonescu, C. N., Mettlen, M., Schmid, S. L., Danuser, G. Advances in analysis of low signal-to-noise images link dynamin and AP2 to the functions of an endocytic checkpoint. Dev Cell. 26 (3), 279-291 (2013).
  28. Boucrot, E., Howes, M. T., Kirchhausen, T., Parton, R. G. Redistribution of caveolae during mitosis. J Cell Sci. 124, 1965-1972 (2011).
  29. Bhaya, D., Davison, M., Barrangou, R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual review of genetics. 45, 273-297 (2011).
  30. Boch, J., Scholze, H., et al. Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type. III Effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

do ki powlekane klatrynmikroskopia fluorescencyjnaanaliza obrazuobrazowanie ywych kom rekdynamika endocytozysk ad adunku
Wizualizacja endocytozy receptorów sprzężonych z białkiem G za pośrednictwem klatryny w rozdzielczości pojedynczego zdarzenia za pomocą mikroskopii TIRF
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.