Artykuł metodologiczny

Kurczliwość paska mięśni gładkich pęcherza moczowego jako metoda oceny farmakologii dolnych dróg moczowych

DOI:

10.3791/51807

⸱

18 sierpnia 2014

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Renal division, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Department of Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt przedstawia prostą, ale potężną metodę in vitro do oceny kurczliwości mięśni gładkich w odpowiedzi na środki farmakologiczne lub stymulację nerwów. Główne zastosowania to badania przesiewowe leków i zrozumienie fizjologii tkanek, farmakologii i patologii.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy metodę in vitro do pomiaru kurczliwości mięśni gładkich pęcherza moczowego oraz jej zastosowanie do badania fizjologicznych i farmakologicznych właściwości mięśni gładkich, jak również zmian wywołanych przez patologię. Metoda ta dostarcza kluczowych informacji dla zrozumienia funkcji pęcherza moczowego przy jednoczesnym przezwyciężeniu głównych trudności metodologicznych napotkanych w eksperymentach in vivo, takich jak manipulacje chirurgiczne i farmakologiczne, które wpływają na stabilność i przeżycie preparatów, użycie tkanki ludzkiej i/lub stosowanie drogich chemikaliów. Daje również możliwość zbadania właściwości każdego elementu pęcherza moczowego (tj. mięśni gładkich, błony śluzowej, nerwów) w stanach zdrowych i patologicznych.

Pęcherz moczowy jest usuwany od znieczulonego zwierzęcia, umieszczany w roztworze Krebsa i krojony na paski. Paski umieszcza się w komorze wypełnionej ciepłym roztworem Krebsa. Jeden koniec jest przymocowany do izometrycznego przetwornika napięcia w celu pomiaru siły skurczu, drugi koniec jest przymocowany do stałego pręta. Tkanka jest stymulowana przez bezpośrednie dodawanie związków do kąpieli lub przez elektrody stymulujące polem elektrycznym, które aktywują nerwy, podobnie jak wywoływanie skurczów pęcherza in vivo. Przedstawiono zastosowanie tej metody do oceny spontanicznej kurczliwości mięśni gładkich w trakcie rozwoju i po eksperymentalnym urazie rdzenia kręgowego, charakteru neurotransmisji (zaangażowanych przekaźników i receptorów), czynników zaangażowanych w modulację aktywności mięśni gładkich, roli poszczególnych składników pęcherza moczowego oraz różnic gatunkowych i narządowych w odpowiedzi na środki farmakologiczne. Ponadto może być wykorzystany do badania szlaków wewnątrzkomórkowych zaangażowanych w skurcz i/lub rozluźnienie mięśni gładkich, zależności między strukturą a aktywnością leku oraz oceny uwalniania przekaźnika.

Metoda kurczliwości mięśni gładkich in vitro jest szeroko stosowana od ponad 50 lat i dostarczyła danych, które znacząco przyczyniły się do naszego zrozumienia funkcji pęcherza, jak również do opracowania farmaceutycznego związków obecnie stosowanych klinicznie w leczeniu pęcherza.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mięśnie gładkie pęcherza rozluźniają się, aby umożliwić magazynowanie moczu, i kurczą się, aby wywołać eliminację moczu. Relaksacja odbywa się za pośrednictwem wewnętrznych właściwości mięśni gładkich i tonicznego uwalniania noradrenaliny (NE) z nerwów współczulnych, która aktywuje receptory beta adrenergiczne (β3AR u człowieka) w detruze. Mikcję uzyskuje się poprzez hamowanie wkładu współczulnego i aktywację nerwów przywspółczulnych, które uwalniają ACh / ATP w celu skurczu mięśni gładkich pęcherzamoczowego 1. Liczne stany patologiczne, w tym uraz mózgu i/lub rdzenia kręgowego, choroby neurodegeneracyjne, cukrzyca, niedrożność ujścia pęcherza moczowego lub śródmiąższowe zapalenie pęcherza moczowego, mogą głęboko zmienić funkcję pęcherza moczowego, co ma poważny wpływ na jakość życia pacjenta2. Stany te zmieniają kurczliwość mięśni gładkich, wpływając na jeden lub więcej elementów pęcherza moczowego: mięśnie gładkie, nerwy doprowadzające lub odprowadzające i/lub błonę śluzową.

Opracowano kilka metod in vivo i in vitro do badania funkcji pęcherza moczowego. In vivo cystometria jest podstawowym pomiarem funkcji pęcherza moczowego. Chociaż jest to nienaruszony preparat, który umożliwia zbieranie informacji w warunkach zbliżonych do fizjologicznych, istnieje wiele okoliczności, w których preferowane jest stosowanie pasków mięśni gładkich. Należą do nich sytuacje, w których manipulacje chirurgiczne i/lub farmakologiczne wpłynęłyby na przeżycie i stabilność preparatu in vivo lub gdy badania wymagają użycia tkanki ludzkiej lub drogich chemikaliów. Metoda ta ułatwia również badanie wpływu leków, wieku i patologii na każdy składnik pęcherza moczowego, tj. mięśnie gładkie, błonę śluzową, nerwy doprowadzające i odprowadzające.

Paski pęcherza były używane przez lata przez wiele grup, aby odpowiedzieć na wiele pytań naukowych. Wykorzystano je do oceny zmian w spontanicznej aktywności miogennej wywołanej patologią. Uważa się, że aktywność ta przyczynia się do naglących i częstych objawów pęcherza nadreaktywnego (OAB), a zatem jest celem dla leków opracowywanych dla OAB3-9. Paski pęcherza moczowego wykorzystano również do zbadania czynników miogennych i neuronalnych, które modulują napięcie mięśni gładkich, w celu odkrycia kanałów jonowych i / lub receptorów i / lub szlaków wewnątrzkomórkowych, które mogą być ukierunkowane w celu wywołania rozluźnienia lub skurczu mięśni gładkich3,10-13. Inne badania koncentrowały się na naturze neuroprzekaźnictwa, w tym na zaangażowanych przekaźnikach i receptorach oraz zmianach wywołanych przez patologię14,15. Ponadto metoda została wykorzystana do porównań między tkankami różnych gatunków16-18, między narządami19-21 oraz oceny zależności między strukturą a aktywnością leku22-24. Rozszerzenie tej metody zostało wykorzystane do pomiaru wpływu leków na uwalnianie przekaźnika z nerwów odprowadzających25. Ponadto za pomocą tej techniki można badać różne tkanki (pęcherz moczowy, cewka moczowa, przewód pokarmowy, przewód pokarmowy) pobrane od zwierząt lub ludzi (z operacji lub tkanek dawcy narządów zatwierdzonych do badań) oraz z różnych modeli zwierzęcych, w tym uraz rdzenia kręgowego (SCI), niedrożność ujścia pęcherza moczowego (BOO) lub śródmiąższowe zapalenie pęcherza moczowego (IC).

W tym artykule ilustrujemy użycie tej metody wraz z niezbędnymi protokołami eksperymentalnymi, aby odpowiedzieć na kilka pytań naukowych wymienionych powyżej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj procedury są zatwierdzone przez komitet IACUC na Uniwersytecie w Pittsburghu.

1. Rozwiązania

  1. Przygotuj roztwór Krebsa zgodnie z przepisem. Skład w mM: NaCl 118, KCl 4,7, CaCl2 1,9, MgSO4 1,2, NaHCO3 24,9, KH2PO4 1,2, dekstroza 11,7.
  2. Napowietrz Krebsa 95%O2, 5% CO2 i umieść go w łaźni wodnej o temperaturze 37 ºC, która będzie używana przez cały czas trwania eksperymentu. Odłóż na bok ~200 ml napowietrzonego roztworu Krebsa w temperaturze pokojowej do użycia do wypreparowania tkanek.
  3. Zmierz pH (~ 7,4) i osmolarność (~ 300 mOsm) napowietrzonego Krebsa.

2. Układ eksperymentalny (Schemat Rysunek 1A)

  1. Napełnij komory napowietrzone (95%O2, 5% CO2) 10 ml Krebsa.
  2. Uruchomić pompę wody obiegowej, aby podgrzać komory do 37 °C; włączyć niezbędne urządzenia: wzmacniacz(e), stymulator(y) i oprogramowanie rejestrujące.
  3. Kalibruj przetworniki o masie 1 g.

3. Tkanka (Rysunek 1B)

Usuń pęcherz moczowy dorosłej, naiwnej samicy szczura Sprague Dawley (200-250 g; ~10-12 tygodni) wykonując następujące kroki:

  1. Przygotuj obszar sekcji i niezbędne narzędzia: elektryczne maszynki do golenia, kleszcze z zębami, ostrze skalpela, nożyczki preparacyjne, mikronożyczki, dwa kleszcze preparacyjne (autorzy wolą kleszcze Dumonta #3), klipsy do tkanek (lub szew jedwabny), naczynie do sekcji pokryte powłoką Sylgard z Krebsem i szpilkami do preparowania tkanek.
  2. Znieczulić zwierzę inhalacją izofluranu (4% wO2) w komorze indukcyjnej. Stosuj maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Stale monitoruj poziom znieczulenia, obserwując częstość oddechów, reakcję na bodźce zewnętrzne i utratę odruchu wycofania kończyny tylnej.
  3. Kiedy zwierzę jest znieczulone, ogol dolną część brzucha. Odsłoń narządy miednicy przez nacięcie brzucha w linii środkowej. Zidentyfikuj pęcherz moczowy i cewkę moczową. Usuń pęcherz, przecinając szyję pęcherza w pobliżu bliższej cewki moczowej. Natychmiast umieścić chusteczkę w naczyniu pokrytym powłoką Sylgard wypełnionym napowietrzonym roztworem Krebsa.
  4. W razie potrzeby należy w tym czasie usunąć dodatkowe tkanki: cewkę moczową, fragmenty przewodu pokarmowego (GI) i/lub prostatę itp.
  5. Uśmiercić zwierzę przy użyciu metod zatwierdzonych przez IACUC (np. przedawkowanie środka znieczulającego lub uduszenie CO2 , a następnie metoda wtórna).
  6. Włóż szpilki do wypreparowania tkanek przez kopułę pęcherza moczowego, szyję i moczowody, aby ustabilizować tkankę do dalszej sekcji. Nie rozciągaj tkanki. Usuń tłuszcz, tkankę łączną, proksymalną cewkę moczową i moczowody, jeśli są obecne.
  7. Otwórz pęcherz od podstawy do kopuły, aby utworzyć płaski arkusz, surowiczą stroną do dołu/luminalną stroną do góry (Rysunek 1B). Umieść szpilki preparacyjne w każdym rogu tkanki. Usuń kopułę pęcherza moczowego i tkankę szyi.
  8. Jeśli celem eksperymentu jest określenie udziału błony śluzowej (nabłonka dróg moczowych i blaszki właściwej – patrz rysunek 1C) w skurczu mięśni gładkich, należy porównać właściwości pasków wypierających z dołączoną błoną śluzową i bez niej. W tym celu przed przecięciem tkanki w paski ostrożnie usuń warstwę błony śluzowej za pomocą nożyczek do irysa i cienkich kleszczy pod mikroskopem preparacyjnym. Pod koniec eksperymentu przymocuj paski do barwienia H&E, aby potwierdzić całkowite usunięcie błony śluzowej. Należy pamiętać, że ta procedura jest łatwiejsza w pęcherzu myszy niż w pęcherzu szczura.
  9. Przeciąć tkankę wzdłuż od podstawy do kopuły na paski o wymiarach ~2 x 8 mm (Rysunek 1B). Przywiąż lub przymocuj klips do chusteczek higienicznych na obu końcach każdego paska.
    UWAGA: Jeden pęcherz szczura można zwykle pokroić na 4 paski, ale liczba pasków może się zwiększać lub zmniejszać w zależności od wielkości zwierzęcia / pęcherza.
  10. Przenieś paski do komór doświadczalnych. Przymocuj jeden koniec każdego paska do przetwornika siły, który mierzy skurcz tkanki, a drugi do stałego pręta szklanego/metalowego.
    UWAGA: Komory tkankowe różnią się wielkością (od 0,2 ml do 20 ml lub więcej). Typowe komory dla pęcherzy gryzoni mają pojemność 5-20 ml, co zapewnia wystarczającą wysokość, aby paski były całkowicie zanurzone w roztworze. Niektóre komory mają wbudowane elektrody stymulacyjne, inne nie. Należy zadbać o to, aby wszystkie połączenia elektrod były w dobrym stanie, w przeciwnym razie stymulacja polem elektrycznym nie jest niezawodna.
  11. Przyłóż określoną siłę do każdego paska, delikatnie rozciągając tkankę, aż napięcie wyjściowe osiągnie 1 g (~10 mN). Początkowo tkanka ma tendencję do rozluźniania się, co rejestruje się jako spadek napięcia wyjściowego. Myj chusteczkę mniej więcej co 15 minut za pomocą ciepłego, napowietrzonego Krebsa i po każdym praniu dostosuj napięcie wyjściowe do 1 g. Pozwól tkance zrównoważyć się przez ~ 1-2 godziny lub do momentu, gdy napięcie wyjściowe ustabilizuje się (tj. nie będzie dalszego rozluźniania tkanek).
  12. Zbadaj żywotność tkanek, dodając KCl (80 mM) bezpośrednio do kąpieli przez ~5 minut lub do momentu osiągnięcia odpowiedzi plateau. Reakcje na wysokie stężenia KCl mogą być również powtarzane podczas eksperymentu lub na końcu eksperymentu i wykorzystywane do normalizacji odpowiedzi na inne leki lub między paskami (patrz normalizacja w sekcji Analiza danych).
  13. Umyj tkankę wiele razy (3-5 razy) ciepłym, napowietrzonym Krebsem, aby umożliwić powrót tkanki do warunków sprzed zabiegu.

4. Protokoły stymulacji

  1. Aby zbadać wpływ patologii na spontaniczną aktywność miogenną lub napięcie mięśni gładkich, użyj pasków mięśni gładkich z różnych modeli zwierzęcych, takich jak SCI, BOO lub noworodki. Rycina 2 ilustruje zastosowanie tej metody do badania zmian w spontanicznej aktywności pęcherza moczowego podczas rozwoju i po SCI. Ponadto środki farmakologiczne mogą być stosowane do modulowania spontanicznej aktywności. Rysunek 3 ilustruje wpływ modulatorów kanału KCNQ, flupirtyny i XE991, na spontaniczną aktywność i napięcie mięśni gładkich.
  2. Do farmakologicznej stymulacji mięśni gładkich należy skonstruować krzywe stężenie-odpowiedź, dodając związki ze stężonych roztworów podstawowych bezpośrednio do kąpieli w określonych odstępach czasu. Użyj narkotyku i pojazdu w równoległych pasach, aby uwzględnić wpływ pojazdu i czasu.
    1. Przygotować roztwory podstawowe żądanych badanych związków o stężeniu 1000-krotności końcowego stężenia roboczego. Dla karbacholu (CCh), agonisty receptora muskarynowego, należy przygotować następujące zapasy: 10-5 M, 3 x 10-5 M, 10-4 M, 3 x 10-4 M, 10-3 M, 3 x 10-3 M, 10-2 M. Końcowe stężenia w kąpieli wynoszą od 10-8 M do 10-5 M (ryc. 4C, D). Dla neuromedyny B (NMB), agonisty receptora bombezyny podtypu 1, należy przygotować następujące zapasy: 10-8 M, 10-7 M, 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, 10-3 M, a końcowe stężenia w kąpieli wynoszą od 10-11 M do 10-6 M. Oczekuje się, że zarówno CCh, jak i NMB zwiększą kurczliwość tkanek.
    2. W przypadku kąpieli tkankowej o objętości 10 ml dodać 10 μl każdego roztworu podstawowego CCh, gdy tylko odpowiedź osiągnie plateau (Figura 4C, D). W równoległych pasach dodaj równe ilości pojazdu (wody). Podobnie, dodawać 10 μl każdego roztworu podstawowego neuromedyny B co ~5 min.
      UWAGA: Obserwuj pobudzający wpływ NMB i CCh na napięcie mięśni gładkich w paskach różnych gatunków na rycinie 4.
    3. Zbadaj właściwości relaksacyjne mięśni gładkich w wcześniej skurczonej tkance za pomocą środka pobudzającego, zwykle CCh lub KCl.
    4. Aby zablokować odpowiedź agonistyczną, przed stymulacją agonistyczną należy wstępnie traktować tkankę przez 10-20 minut antagonistą, aby umożliwić penetrację tkanki.
  3. W przypadku stymulacji neuronalnej mięśni gładkich, zwanej również stymulacją pola elektrycznego (EFS), wykonaj kroki od 1 do 3.13 i kontynuuj zgodnie z poniższym opisem. EFS ma na celu selektywną aktywację nerwów w porównaniu z mięśniami gładkimi. Parametry stymulacji powinny być starannie dobrane, aby uniknąć bezpośredniej stymulacji mięśni gładkich.
    1. Ustal parametry stymulacji: rodzaj bodźca (pojedyncze impulsy lub pociągi), czas trwania (czas trwania impulsu i czas trwania pociągu), częstotliwość i intensywność, zgodnie z opisem w poniższych krokach i zilustrowanymi na rysunkach 5A, B.
      1. W przypadku stymulacji pojedynczym impulsem ustaw czas trwania impulsu, interwał między bodźcami i pożądaną liczbę bodźców. Typowymi parametrami czasu trwania stymulacji są pojedyncze impulsy o czasie trwania 0,05-0,3 ms dostarczane w żądanych odstępach czasu (ryc. 5A). Wykonaj krok 4.3.1.4, aby uzyskać intensywność bodźca.
      2. W celu stymulacji pociągu ustaw czas trwania pociągu i interwał między pociągami. Typowe wartości dla tkanki pęcherza moczowego to 3-10 sekund dostarczane w odstępie co najmniej 1 minuty (ryc. 5B). Jeśli występuje zmęczenie tkanek (tj. skurcze EFS zmniejszają się w okresie kontrolnym), należy zwiększyć interwał między treningami.
      3. Ustal częstotliwość bodźców płynących z pociągu (liczba impulsów w pociągu – rysunek 5B). Uruchom krzywą odpowiedzi częstotliwościowej w zakresie od 0,5 do 50 Hz. Typowe częstotliwości dla pęcherza moczowego to 10-20 Hz, które dają powtarzalne i stabilne skurcze, w których pośredniczą ATP i ACh. Obserwuj zależne od częstotliwości reakcje na stymulację EFS w paskach pęcherza myszy na rycinie 5, pokazując, w jaki sposób ta metoda może być wykorzystana do oceny udziału mechanizmów cholinergicznych i purynergicznych w neuroprzekaźnictwie.
      4. Ustal intensywność bodźca: systematycznie zwiększaj intensywność (napięcie) bodźca, aż amplituda skurczu osiągnie plateau (w przypadku korzystania z pociągów utrzymuj stałą częstotliwość).
      5. Ustaw intensywność bodźca w zależności od celu eksperymentu. Jeśli celem jest zwiększenie skurczów wywołanych przez neurony, użyj intensywności submaksymalnej, tak aby amplituda skurczu wynosiła ~50% maksymalnego skurczu. Jeśli celem jest zmniejszenie skurczów wywołanych przez neurony, ustaw intensywność na ~80% maksymalnej amplitudy, aby uniknąć zmęczenia tkanek.
    2. Po ustaleniu parametrów stymulacji (czas trwania, częstotliwość i intensywność) odczekaj ~20-30 minut, aby skurcze wywołane przez EFS ustabilizowały się przed testami narkotykowymi.
      UWAGA: Aby zweryfikować selektywność EFS dla transmisji neuronalnej, zablokuj transmisję neuronalną za pomocą blokera kanału Na+, tetrodotoksyny (TTX; 0,5-1 μM). Wykonaj ten krok na początku eksperymentu, ponieważ TTX zmywa się stosunkowo łatwo. Ponadto należy to zrobić na koniec eksperymentu (patrz krok 4.3.5 poniżej).
    3. Przygotować roztwory podstawowe o stężeniach 1000-krotnie większych od końcowych stężeń roboczych dla: alfa,beta-metylenu ATP (ABMA; aktywator i odczulacz receptora purynergicznego) 10-2 M, atropina (antagonista receptora muskarynowego) 10-3 M (Figura 5C). Zwróć uwagę na inne przykłady na rysunku 6. Agonista receptora 5HT4, cyzapryd (3 x 10-6 M, 10-6 M, 3 x 10-5 M, 10-5 M, 3 x 10-4 M, 10-4 M, 3 x 10-3 M, 10-3 M), zwiększa kurczliwość tkanek, a SB-203186 (3 x 10-3 M), antagonista receptora 5HT4, odwraca działanie cyzaprydu.
    4. Aby przetestować wpływ ABMA i atropiny na EFS (ryc. 5C), wykonaj dwie kontrolne krzywe odpowiedzi częstotliwościowej. Dodać 10 μl 10-2 M ABMA do kąpieli, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μM. Spowoduje to skurcz tkanki w wyniku bezpośredniej stymulacji receptorów purynergicznych w mięśniach gładkich. Gdy odpowiedź powróci do wartości wyjściowej, powtórz krzywe odpowiedzi częstotliwościowej. Dodać 10 μl 10-3 M atropiny, aby uzyskać końcowe stężenie 1 μM. Po ~10 minutach (potrzebnych do zablokowania receptorów muskarynowych przez atropinę), powtórz krzywe odpowiedzi częstotliwościowej. W równoległych paskach dodać 10 μl pojazdu, wody, na każdym kroku.
      UWAGA: Dla innych przykładów na rysunku 6, dodaj 10 μl każdego roztworu podstawowego cyzaprydu w określonych odstępach czasu (~ co 15 minut; patrz dyskusja), a następnie 10 μl roztworu podstawowego SB-203186 bezpośrednio do kąpieli i monitoruj ich wpływ na skurcz wywołany przez EFS. W równoległych paskach dodać 10 μl pojazdu, DMSO. Obserwuj wpływ cyzaprydu, agonisty receptora 5HT4, na skurcze wywołane przez EFS w tkankach ludzkiego pęcherza moczowego i jelita krętego na rycinie 6. Dodatkowo obserwuj wpływ DMSO, nośnika cyzaprydu, na wywołane przez EFS skurcze w tkankach ludzkiego pęcherza moczowego i jelita krętego.
    5. Na końcu protokołu EFS sprawdź selektywność EFS, blokując transmisję neuronalną za pomocą blokera kanału Na+, tetrodotoksyny (TTX; 0,5-1 μM). Jeśli skurcze oporne na TTX są nadal obecne, zaleca się dostosowanie czasu trwania i intensywności bodźca w kolejnych eksperymentach.
  4. Aby określić wpływ leków na miejsca pre- lub postsynaptyczne (ryc. 7A), wykonaj kroki od 1 do 4.3.2. Ustal powtarzalne odpowiedzi na karbachol i EFS, a następnie dodaj lek X.
  5. Pod koniec eksperymentu odepnij lub odwiąż paski, delikatnie osusz je na kawałku bibuły, aby wyeliminować nadmiar płynu i zmierz wagę każdego paska za pomocą wagi. Zmierz również długość tkanki za pomocą suwmiarki, aby określić pole przekroju poprzecznego. Informacje te służą do normalizacji danych (patrz punkt 5.4).

5. Analiza danych

Analizuj dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania (np. Windaq, LabChart).

  1. W przypadku aktywności spontanicznej należy wybrać okno co najmniej 30 sekund przed i w szczytowym momencie odpowiedzi wywołanej lekiem oraz zmierzyć amplitudę i częstotliwość aktywności miogennej (ryc. 3).
    1. Użyj szybkiej analizy transformacji Fouriera, aby określić spektrum częstotliwości przyczyniających się do reakcji skurczowych i czy istnieją różnice między różnymi częściami pęcherza moczowego (np. kopuła a szyja) lub z rozwojem, patologią i lekami8.
  2. Aby uzyskać wpływ na napięcie mięśni gładkich, wybierz okno co najmniej 10-30 sekund przed i w szczycie odpowiedzi wywołanej lekiem i zmierz amplitudę skurczu.
  3. Aby uzyskać wpływ na skurcze wywołane przez neurony, zmierz amplitudę, czas trwania i obszar pod krzywą skurczów (co najmniej 3) przed i w szczycie odpowiedzi wywołanej lekiem.
    UWAGA: Konieczne jest zmierzenie zarówno amplitudy, jak i pola pod krzywą skurczów wywołanych przez EFS, ponieważ składniki purynergiczne i cholinergiczne mają różną kinetykę. Składnik purynergiczny jest szybki i przejściowy (ATP aktywuje purynergiczne kanały jonotropowe, takie jak P2X1, które umożliwiają szybki napływ wapnia, a następnie odczulają), przyczyniając się w ten sposób bardziej do odpowiedzi amplitudy szczytowej, a mniej do obszaru pod krzywą. Składnik cholinergiczny jest wolniejszy i trwały (ACh aktywuje metabotropowe receptory muskarynowe, które potrzebują więcej czasu na aktywację szlaków wewnątrzkomórkowych, które ostatecznie aktywują kanały jonowe, które depolaryzują mięśnie gładkie w celu wywołania skurczu). W ten sposób składnik muskarynowy jest lepiej wychwytywany poprzez pomiar obszaru pod krzywą.
  4. Znormalizuj dane, aby móc porównać wyniki między paskami i terapiami farmakologicznymi. Na parametr wybrany do normalizacji nie powinny mieć wpływu badane związki, badany stan patologiczny ani projekt eksperymentalny. Wśród tych parametrów należy użyć masy paska, pola przekroju poprzecznego, odpowiedzi KCl (ryc. 4B), % maksymalnej odpowiedzi (ryc. 7B) lub % maksymalnej odpowiedzi na inny czynnik kurczliwy (np. CCh) lub środki rozluźniające (np. papaweryna).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spontaniczna aktywność miogenna

Spontaniczna aktywność miogenna to ważna cecha mięśni gładkich, która ulega zmianom wraz z rozwojem pourodzeniowym6-9 i patologią (np. SCI, BOO)3-5. Ponieważ uważa się, że aktywność ta przyczynia się do objawów pęcherza nadreaktywnego (OAB)2, ocena receptorów, szlaków wewnątrzkomórkowych i środków farmakologicznych, które go modulują, jest bardzo interesująca dla opracowania skutecznych metod leczenia O...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule opisaliśmy prostą metodę kurczliwości mięśni gładkich in vitro , która może być wykorzystana do odpowiedzi na szereg ważnych pytań naukowych związanych z fizjologią i patologią pęcherza moczowego, a także pomóc w odkryciu nowych leków do leczenia dysfunkcji pęcherza moczowego. Zilustrowaliśmy zastosowanie tej metody do oceny rozwojowych, patologicznych i farmakologicznych właściwości kurczliwości mięśni gładkich pęcherza moczowego (ryc. 2-4), modulacji neurotransmisji (ryc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez granty NIH R37 DK54824 i R01 DK57284 dla LB.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Equipment
Tissue Bath System with ReservoirRadnoti, LLC159920izolowane kąpiele tkankowe
Pompa z recyrkulatorem ciepłej wodyKent Scientific Corporation TPZ-749aby utrzymać kąpiele tkankowe na poziomie 37 ° C
gromadzenia danych
Wzmacniacz przetwornika TransbridgeWorld Precision InstrumentsSYS-TBM4MWzmacniacz przetwornika
Stymulator trawyGrass TechnologiesModel S88System
anestezjologicznyKent Korporacja Naukowa ACV-1205SDo znieczulenia zwierzęcia
Pudełko anestezjologiczneAparat Harvard500116Do znieczulenia zwierzęcia
Maski anestezjologiczneKent Scientific Corporation AC-09508Aby znieczulić zwierzę
Materiały i narzędzia chirurgiczne
SylgardDow Corning Corp184 SIL ELAST KITDo szpilkowania, preparowania i cięcia tkanek
Szalka PetriegoCorning3160-152Do wycinania/cięcia tkanek
Szpilki do owadówENTOMORAVIA Austerlitz Szpilki do owadówRozmiar 5Do przypinania tkanek
Podkładka pod ławkęVWR International56617-014Chłonne podkładki pod ławkę
Zestaw chirurgiczny dla szczurówKent Scientific Corporation INSRATKITDo usuwania i preparowania tkanek
2 Kleszcze Dumont #3Kent Scientific Corporation INS500064Do usuwania i preparowania tkanek
Kleszcze tkankoweKent Scientific Corporation INS500092Do usuwania i preparowania tkanek
SkalpelKent Scientific Corporation INS500236Do usuwania i preparowania tkanek
Ostrze skalpelaKent Scientific Corporation INS500239Do usuwania i preparowania tkanek
Profesjonalna maszynka do strzyżenia Braintree Scientific, Inc.CLP-223  45Aby usunąć futro
Nici do szwówFine Science Tools18020-50Spinacze do tkanek krawatowych
Radnoti, LLC158802Podłącz tkankę do pręta/przetwornika
1 g waga  METTLER TOLEDO11119525Do kalibracji
Chemicals
Krebs Rozwiązanie:
Chlorek sodu
Chlorek potasu
Jednozasadowy fosforan potasu
Siarczan magnezu
Dekstroza
Wodorowęglan sodu
Chlorek wapnia
Chlorek		magnezu 
Sigma
Fisher
Fisher
Fisher
Fisher
Sigma
EMD
Baker		 
S7653
P. 217-500
P285-3
M65-500
D16-500
S5761
CX0130-2
2444		Aby przygotować roztwór Krebsa
IzofluranHenry Schein029405To znieczulić zwierzę
  Zbiornik tlenuMatheson Tri Gasox251Do użytku z systemem anestezjologicznym
Zbiornik karbogeniczny (95% tlenu; 5% dwutlenku węgla) Matheson Tri GasMoxn00hn36DDo napowietrzania roztworów Krebsa
, System komputerowych DataQ Instruments DI-710-UH Do przeglądania, rejestrowania i analizowania danych przetwornika

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. The neural control of micturition. Nat Rev Neurosci. 9, 453-466 (2008).
  2. Andersson, K. E. Detrusor myocyte activity and afferent signaling. Neurourol Urodyn. 29, 97-106 (2010).
  3. Artim, D. E., et al. Developmental and spinal cord injury-induced changes in nitric oxide-mediated inhibition in rat urinary bladder. Neurourology and urodynamics. 30, 1666-1674 (2011).
  4. Kita, M., et al. Effects of bladder outlet obstruction on properties of Ca2+-activated K+ channels in rat bladder. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 298, 1310-1319 (2010).
  5. Barendrecht, M. M., et al. The effect of bladder outlet obstruction on alpha1- and beta-adrenoceptor expression and function. Neurourol Urodyn. 28, 349-355 (2009).
  6. Maggi, C. A., Santicioli, P., Meli, A. Postnatal development of myogenic contractile activity and excitatory innervation of rat urinary bladder. The American journal of physiology. 247, 972-978 (1984).
  7. Ng, Y. K., de Groat, W. C., Wu, H. Y. Smooth muscle and neural mechanisms contributing to the downregulation of neonatal rat spontaneous bladder contractions during postnatal development. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 292, 2100-2112 (2007).
  8. Szell, E. A., Somogyi, G. T., de Groat, W. C., Szigeti, G. P. Developmental changes in spontaneous smooth muscle activity in the neonatal rat urinary bladder. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 285, 809-816 (2003).
  9. Szigeti, G. P., Somogyi, G. T., Csernoch, L., Szell, E. A. Age-dependence of the spontaneous activity of the rat urinary bladder. J Muscle Res Cell Motil. 26, 23-29 (2005).
  10. Frazier, E. P., Braverman, A. S., Peters, S. L., Michel, M. C., Ruggieri, M. R. Does phospholipase C mediate muscarinic receptor-induced rat urinary bladder contraction. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 322, 998-1002 (2007).
  11. Xin, W., Soder, R. P., Cheng, Q., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Selective inhibition of phosphodiesterase 1 relaxes urinary bladder smooth muscle: role for ryanodine receptor-mediated BK channel activation. American journal of physiology. Cell physiology. 303, 1079-1089 (2012).
  12. Frazier, E. P., Peters, S. L., Braverman, A. S., Ruggieri, M. R., Michel, M. C. Signal transduction underlying the control of urinary bladder smooth muscle tone by muscarinic receptors and beta-adrenoceptors. Naunyn-Schmiedeberg's archives of pharmacology. 377, 449-462 (2008).
  13. Svalo, J., et al. The novel beta3-adrenoceptor agonist mirabegron reduces carbachol-induced contractile activity in detrusor tissue from patients with bladder outflow obstruction with or without detrusor overactivity. European journal of pharmacology. 699, 101-105 (2013).
  14. Yokota, T., Yamaguchi, O. Changes in cholinergic and purinergic neurotransmission in pathologic bladder of chronic spinal rabbit. J Urol. 156, 1862-1866 (1996).
  15. Bayliss, M., Wu, C., Newgreen, D., Mundy, A. R., Fry, C. H. A quantitative study of atropine-resistant contractile responses in human detrusor smooth muscle, from stable, unstable and obstructed bladders. J Urol. 162, 1833-1839 (1999).
  16. Kullmann, F. A., McKenna, D., Wells, G. I., Thor, K. B. Functional bombesin receptors in urinary tract of rats and human but not of pigs and mice, an in vitro study. Neuropeptides. 47, 305-313 (2013).
  17. Sadananda, P., Kao, F. C., Liu, L., Mansfield, K. J., Burcher, E. Acid and stretch, but not capsaicin, are effective stimuli for ATP release in the porcine bladder mucosa: Are ASIC and TRPV1 receptors involved. European journal of pharmacology. 683, 252-259 (2012).
  18. Maggi, C. A., et al. Species-related variations in the effects of capsaicin on urinary bladder functions: relation to bladder content of substance P-like immunoreactivity. Naunyn-Schmiedeberg's archives of pharmacology. 336, 546-555 (1987).
  19. Kullmann, F. A., et al. Effects of the 5-HT4 receptor agonist, cisapride, on neuronally evoked responses in human bladder, urethra, and ileum. Autonomic neuroscience : basic & clinical. 176, 70-77 (2013).
  20. Warner, F. J., Miller, R. C., Burcher, E. Human tachykinin NK2 receptor: a comparative study of the colon and urinary bladder. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30, 632-639 (2003).
  21. Zoubek, J., Somogyi, G. T., De Groat, W. C. A comparison of inhibitory effects of neuropeptide Y on rat urinary bladder, urethra, and vas deferens. The American journal of physiology. 265, 537-543 (1993).
  22. Warner, F. J., Miller, R. C., Burcher, E. Structure-activity relationship of neurokinin A(4-10) at the human tachykinin NK(2) receptor: the effect of amino acid substitutions on receptor affinity and function. Biochem Pharmacol. 63, 2181-2186 (2002).
  23. Warner, F. J., Mack, P., Comis, A., Miller, R. C., Burcher, E. Structure-activity relationships of neurokinin A (4-10) at the human tachykinin NK(2) receptor: the role of natural residues and their chirality. Biochem Pharmacol. 61, 55-60 (2001).
  24. Dion, S., et al. Structure-activity study of neurokinins: antagonists for the neurokinin-2 receptor. Pharmacology. 41, 184-194 (1990).
  25. Somogyi, G. T., Zernova, G. V., Yoshiyama, M., Yamamoto, T., de Groat, W. C. Frequency dependence of muscarinic facilitation of transmitter release in urinary bladder strips from neurally intact or chronic spinal cord transected rats. British journal of pharmacology. 125, 241-246 (1998).
  26. Andersson, K. E., Wein, A. J. Pharmacology of the lower urinary tract: basis for current and future treatments of urinary incontinence. Pharmacological reviews. 56, 581-631 (2004).
  27. D’Agostino, G., Condino, A. M., Gallinari, P., Franceschetti, G. P., Tonini, M. Characterization of prejunctional serotonin receptors modulating [3H]acetylcholine release in the human detrusor. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 316, 129-135 (2006).
  28. Hawthorn, M. H., Chapple, C. R., Cock, M., Chess-Williams, R. Urothelium-derived inhibitory factor(s) influences on detrusor muscle contractility in vitro. British journal of pharmacology. 129, 416-419 (2000).
  29. Chaiyaprasithi, B., Mang, C. F., Kilbinger, H., Hohenfellner, M. Inhibition of human detrusor contraction by a urothelium derived factor. J Urol. 170, 1897-1900 (2003).
  30. Testa, R., et al. Effect of different 5-hydroxytryptamine receptor subtype antagonists on the micturition reflex in rats. BJU international. 87, 256-264 (2001).
  31. Craggs, M. D., Rushton, D. N., Stephenson, J. D. A putative non-cholinergic mechanism in urinary bladders of New but not Old World primates. J Urol. 136, 1348-1350 (1986).
  32. Fry, C. H., Bayliss, M., Young, J. S., Hussain, M. Influence of age and bladder dysfunction on the contractile properties of isolated human detrusor smooth muscle. BJU international. 108, 91-96 (2011).
  33. Kennedy, C., Tasker, P. N., Gallacher, G., Westfall, T. D. Identification of atropine- and P2X1 receptor antagonist-resistant, neurogenic contractions of the urinary bladder. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 845-851 (2007).
  34. Levin, R. M., Danek, M., Whitbeck, C., Haugaard, N. Effect of ethanol on the response of the rat urinary bladder to in vitro ischemia: protective effect of alpha-lipoic acid. Molecular and cellular biochemistry. 271, 133-138 (2005).
  35. Malysz, J., Afeli, S. A., Provence, A., Petkov, G. V. Ethanol-mediated relaxation of guinea pig urinary bladder smooth muscle: Involvement of BK and L-type Ca2+ channels. American journal of physiology. Cell physiology. 306, 45-58 (2013).
  36. Longhurst, P. A., Briscoe, J. A., Rosenberg, D. J., Leggett, R. E. The role of cyclic nucleotides in guinea-pig bladder contractility. British journal of pharmacology. 121, 1665-1672 (1997).
  37. Takahashi, R., Yunoki, T., Naito, S., Yoshimura, N. Differential effects of botulinum neurotoxin A on bladder contractile responses to activation of efferent nerves, smooth muscles and afferent nerves in rats. J Urol. 188, 1993-1999 (2012).
  38. Sadananda, P., Chess-Williams, R., Burcher, E. Contractile properties of the pig bladder mucosa in response to neurokinin A: a role for myofibroblasts. British journal of pharmacology. 153, 1465-1473 (2008).
  39. Liu, G., Daneshgari, F. Alterations in neurogenically mediated contractile responses of urinary bladder in rats with diabetes. American journal of physiology. Renal physiology. 288, 1220-1226 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Pomiar kurczliwo ciizometryczny przetwornik napi ciastymulacja polem elektrycznymstymulacja farmakologicznabadanie ywotno ci tkanekkurczliwo spontanicznaanaliza neurotransmisjipor wnanie gatunkoweocena odpowiedzi na lek

Powiązane artykuły