Dodatkowa opuszka węchowa myszy (AOB) była trudna do zbadania w kontekście kodowania sensorycznego. Tutaj demonstrujemy sekcję, w wyniku której powstaje preparat ex vivo, w którym neurony AOB pozostają funkcjonalnie połączone ze swoimi obwodowymi wejściami, ułatwiając badania nad przetwarzaniem informacji o mysich feromonach i kairomonach.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ex vivo Preparaty nienaruszonego narządu lemieszowo-nosowego i dodatkowej opuszki węchowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
System węchowy myszy (AOS) to wyspecjalizowana ścieżka sensoryczna do wykrywania nieulotnych zapachów społecznych, feromonów i kairomonów. Pierwszy obwód neuronalny w szlaku AOS, zwany dodatkową opuszką węchową (AOB), odgrywa ważną rolę w ustalaniu typowych dla płci zachowań, takich jak agresja terytorialna i kojarzenie się. Ten mały (<1 mm3) obwód posiada zdolność rozróżniania unikalnych stanów behawioralnych, takich jak seks, napięcie i stres, od sygnałów chemosensorycznych w wydzielinach i wydalinach współplemieńców. Podczas gdy zwarta organizacja tego systemu stwarza unikalne możliwości jednoczesnego nagrywania z dużych części obwodu, badanie przetwarzania sensorycznego w AOB pozostaje wyzwaniem, głównie ze względu na jego eksperymentalnie niekorzystną lokalizację w mózgu. Tutaj demonstrujemy wieloetapową sekcję, która usuwa nienaruszony AOB wewnątrz pojedynczej półkuli przedniej czaszki myszy, pozostawiając nienaruszone połączenia zarówno z obwodowymi neuronami czuciowymi lemieszowo-nosowymi (VSN), jak i lokalnymi obwodami neuronalnymi. Procedura ta poddaje powierzchnię AOB bezpośredniej kontroli wizualnej, ułatwiając zapisy elektrofizjologiczne i optyczne z elementów obwodu AOB przy braku środków znieczulających. Po wprowadzeniu cienkiej kaniuli do narządu lemieszowo-nosowego (VNO), w którym znajdują się VSN, można bezpośrednio wystawić peryferie na zapachy społeczne i feromony, jednocześnie rejestrując dalszą aktywność w AOB. Procedura ta umożliwia kontrolowane dochodzenie w zakresie przetwarzania informacji AOS, co może rzucić światło na mechanizmy łączące ekspozycję na feromony ze zmianami w zachowaniu.
Wprowadzenie
Przetwarzanie sensoryczne w mózgu ssaków zazwyczaj obejmuje wiele wzajemnie połączonych obwodów neuronalnych, z których każdy wyodrębnia określone cechy z bodźców sensorycznych. W ścieżkach sensorycznych wczesne przetwarzanie informacji jest niezbędne dla normalnej percepcji i zachowania. W dodatkowym układzie węchowym (AOS) dodatkowa opuszka węchowa (AOB) jest głównym obwodem neuronalnym łączącym peryferia czuciowe ze strukturami znajdującymi się dalej, które dyktują równowagę hormonalną1,2, agresję3 i pobudzenie4. W związku z tym przetwarzanie informacji w tym obwodzie jest silnie powiązane ze zmianami w zachowaniu zwierząt.
Dodatkowa opuszka węchowa znajduje się u myszy i szczurów w grzbietowym/ogonowym/tylnym aspekcie głównej opuszki węchowej (MOB) pod gęstą, unaczynioną zatoką nosową. AOB otrzymuje unerwienie aferentne z aksonów obwodowych neuronów czuciowych lemieszowo-nosowych (VSN), które znajdują się w narządzie lemieszowo-nosowym (VNO), małej ślepo zakończonej rurki w przednim pysku tuż nad podniebieniem miękkim. Aksony te przechodzą przez delikatną warstwę tkanki przegrody na przyśrodkowej granicy przewodów nosowych. W kilku badaniach analizowano reakcje neuronalne AOB na źródła zapachów AOS (takie jak mocz myszy) in vivo przy użyciu znieczulonych myszy5-7 lub swobodnie eksplorujących zwierząt8. Heroiczne znieczulenie in vivo obejmowało (a) tracheotomię w celu zapewnienia głębokiego znieczulenia i zapobieżenia aspiracji bodźców płynnych5-7, (b) stymulację współczulnego zwoju szyjnego6 lub bezpośrednią kaniulację narządu lemieszowo-nosowego5,7 w celu wprowadzenia nielotnych zapachów oraz (c) kraniotomię z ablacją płata czołowego lub bez niej, aby umożliwić wprowadzenie elektrody do AOB6. Badania nad przebudzeniem/zachowaniem8-10 obejmowały chirurgiczne wszczepienie mikronapędu. Podsumowując, te eksperymentalne paradygmaty są potężne, ale niezwykle trudne i często wymagają znieczulenia.
Ciekawie, kilka badań próbowało utrzymać struktury czuciowe i obwody nerwowe w stanie żywym poza ciałem (ex vivo) z pewnym sukcesem11-15. Ponieważ połączenia między VNO i AOB pozostają ipsilateralne, a tkanka przegrody środkowej może być narażona na natleniony superfuzat w jednej półkuli, staraliśmy się opracować takie podejście ex vivo do jednej półkuli, aby wyizolować te struktury przy zachowaniu ich funkcjonalnej łączności. Niedawno udało nam się osiągnąć ten cel16. Preparat ten utrzymuje zarówno VNO, jak i AOB przy życiu i funkcjonalnie połączone przez co najmniej 4 - 6 godzin, ponieważ zarówno aksony (wzdłuż miękkiej tkanki przegrody w linii środkowej), jak i AOB są stosunkowo płytkimi cechami <600 μm, które są dostępne dla supersfuzji natlenionego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF). Ten preparat VNO-AOB ex vivo umożliwia wprowadzanie kontrolowanych bodźców do VNO za pomocą cienkiej kaniuli oraz bezpośredni dostęp wzrokowy do małego AOB w celu ukierunkowanego umieszczenia elektrod i/lub mikroskopii fluorescencyjnej na żywo. Ta metoda jest korzystna, jeśli ktoś chce badać te obwody przy braku środków znieczulających. Ponieważ takie podejście zrywa połączenia odśrodkowe, nie nadaje się dobrze do badań nad odśrodkową modulacją funkcji AOB. Przygotowanie VNO-AOB ex vivo jest trudne do nauczenia, ale po jego osiągnięciu tworzy niezawodną platformę, na której można badać organizację obwodów, przetwarzanie informacji i plastyczność neuronalną w tym potężnym obwodzie sensorycznym.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez UT Southwestern Institutional Animal Care and Use Committee, i zostały wybrane tak, aby zminimalizować stres, dyskomfort i ból doświadczany przez zwierzęta doświadczalne.
1. Komora sekcyjna
Do uzyskania najlepszych wyników wymagana jest niestandardowa komora preparcyjna i mała, cienka plastikowa deska (Rysunek 1). Zbuduj lub zdobądź taką komorę przed przystąpieniem do tego protokołu.
2. Rozwiązania do preparacji
- Przygotować 1 l standardowego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) do użycia w krokach 3.22-5.4. Dodaj NaCl 125 mM, KCl 2,5 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, NaHCO3 25 mM, NaH2PO4 1,25 mM, mio-inozytol 3 mM, pirogronian sodu 2 mM, askorbinian sodu 0,4 mM i glukozę 25 mM do 1 l wody wolnej od pirogenów.
- Przygotować wstępną sekcję aCSF (200 ml) do użycia w krokach 3.3-3.22. Pobrać 200 ml wzorca aCSF i zwiększyć stężenie MgCl2 o 9 mM dodając 0,366 g sześciowodnego MgCl2 .
- Przygotować wzorcowy roztwór Ringera do przenoszenia bodźców do VNO przez kaniulę do użycia w krokach 4.11-5.4 zawierający NaCl 115 mM, KCl 5 mM, CaCl2, 2 mM, MgCl2, 2 mM, NaHCO3 25 mM, HEPES 10 mM, glukoza 10 mM.
- W łaźni wodnej o temperaturze 37 °C bąbelkować 0,8 l standardowego aCSF i 0,5 l Ringera z 95% gazemO2, 5% CO2 przez co najmniej 15 minut.
- Pęcherzykować 200 ml wstępnego rozwarstwienia aCSF z 95% gazemO2, 5% CO2 na lodzie przez 15-20 minut, aż osiągnie 4 °C.
3. Pierwotna sekcja
- Przygotuj obszar sekcji. Umieść na lodzie trzy szalki Petriego o średnicy 35 mm, natleniony aCSF, nożyczki do dekapitacji, zakrzywione nożyczki do preparowania, proste nożyczki preparacyjne, kleszcze Adsona, ostrze i uchwyt skalpela #11 oraz żyletkę.
- Po natlenieniu aCSF ostygnąć do 4 °C, głęboko znieczulić zwierzę w komorze osuszającej za pomocą 2-5 ml Isothesia (99,9% izofluoranu). Wykonaj testy szczypania ogona i stopy, aby upewnić się, że zwierzę jest głęboko znieczulone.
- Po potwierdzeniu głębokiego znieczulenia należy odciąć głowę zwierzęciu i natychmiast umieścić głowę na szalce Petriego wypełnionej schłodzonym preparacją aCSF. UWAGA: Zanurz tkankę w schłodzonym rozwarstwieniu aCSF, aby utrzymać ją w chłodzie przez cały zabieg, gdy nie jest używana.
- Usuń dolną część (gardło brzuszne, dolną szczękę i język) za pomocą zakrzywionych nożyczek.
- Za pomocą kleszczyków Adson odetnij (złuszcz) powierzchowną skórę i przyczepy mięśniowe od czaszki. Obierz skórę głowy od ogonowej do rostralnej, aż jedyne miejsce przyczepu znajdzie się nad przednimi zębami. Przetnij tkankę w punkcie mocowania za pomocą zakrzywionych nożyczek. Usuń oczy, chwytając je kleszczami i odciągnij od preparatu. Pod koniec procedury usuwania rękawic unikaj nadmiernej siły działającej na delikatną chrząstkę nosową, używając kleszczyków Adson do uwolnienia przyczepów mięśniowych z kości górnej szczęki. UWAGA: Odłącz skórę głowy od ogonowej części czaszki prostymi nożyczkami.
- Prostymi nożyczkami przetnij linię środkową czaszki od ogona do rostralu, aż końcówki nożyczek znajdą się kilka mm w kościach czołowych (tuż przed zatoką nosa).
- Usuń kości ciemieniowe i czołowe czaszki za pomocą kleszczy Adson. UWAGA: Kawałki kości czołowej często pozostają przyczepione do kości nosowych, ogonowych do zatoki nosowej. Usuń te kawałki, uważając, aby nie dotknąć opuszki węchowe.
- Za pomocą skalpela wykonaj cięcie koronalne przez płat czołowy 2 mm ogonowe do zatok, a następnie usuń mózg ogonowy do cięcia. Upewnij się, że końcówka skalpela styka się z kostnym konturem brzusznej czaszki, aby całkowicie odciąć tkankę tylną. UWAGA: Umożliwia to usunięcie większości mózgu bez mechanicznego obciążania bocznych dróg węchowych lub opuszki węchowej.
- Usuń odsłonięte ogonowe aspekty brzusznej czaszki za pomocą prostych nożyczek. Pozostaw zatoki i pozostałą tkankę nerwową.
- Usuń łuk jarzmowy i mięśnie twarzy po anatomicznej prawej stronie czaszki za pomocą prostych nożyczek
- Odwróć pysk (brzuszną stroną do góry), aby odsłonić podniebienie.
- Wytnij i usuń podniebienie natychmiast ogonowo do siekaczy. Zrób to, wkładając końcówkę ostrza skalpela pod podniebienie równolegle do podniebienia, a następnie przesuń ostrze w kierunku siekaczy.
- Chwyć uwolnioną (rostralną) krawędź podniebienia kleszczami Adson i usuń, ciągnąc doogonowo.
- Po anatomicznej lewej stronie czaszki użyj ostrza skalpela, aby przedłużyć otwór podniebienny doogonowo, zaczynając od małego otworu w pobliżu zębów trzonowych. Osiągnij to, wkładając końcówkę ostrza skalpela w pustkę w pobliżu zębów trzonowych i obracając nadgarstek. UWAGA: Zachowaj szczególną ostrożność, aby używać tylko końcówki ostrza – głębokie nacięcie może uszkodzić tkankę przegrody.
- Za pomocą czubka ostrza skalpela przeciąć otwór podniebienny przez siekacze, zaczynając rostralnie do anatomicznego lewego narządu lemieszowo-nosowego. Używaj wielu cięć nacinania. Nie uszkadzaj tkanki przegrody nosowej i nerwów lemieszowo-nosowych poprzez zbyt głębokie włożenie ostrza.
- Obrócić tkankę tak, aby czaszka grzbietowa była skierowana do góry, a następnie ustawić prostą żyletkę pionowo (równolegle do linii środkowej) na ogonowej krawędzi preparatu.
- Na brzusznej krawędzi tkanki dotknij krawędzi tnącej żyletki bezpośrednio po lewej stronie linii środkowej. Delikatnie kołysz ostrzem i przesuwaj się wzdłuż lewego otworu podniebiennego (obszar cięcia wprowadzony w kroku 3.14).
- Na grzbietowej krawędzi tkanki umieść krawędź tnącą maszynki bezpośrednio po lewej stronie linii środkowej (mniej niż 1 mm).
- Trzymając ostrze równolegle do linii środkowej, powoli kołysz żyletką, naciskając w kierunku przedniej części tkanki. Zwróć uwagę na opór na płycie cribriform. Zatrzymaj się natychmiast po przełamaniu tego oporu. UWAGA: W tym momencie prawa półkula jest poluzowana od lewej półkuli. Jedyne pozostałe połączenie znajduje się między półkulami wzdłuż pyska grzbietowego przed płytką cribriform.
- Oddziel półkule, chwytając je palcami w rękawiczkach w pobliżu boków ogonowych i delikatnie obracając je na boki i do przodu. UWAGA: Ten etap jest źródłem eksperymentalnej zmienności, szczególnie u myszy ze zniekształconymi lub łamliwymi pyskami (np. Starsze myszy). Ponadto, próbując obrócić półkule od siebie, jeśli napotkasz silny opór, naciąć pysk grzbietowy (przed płytką grzebienia), aby osłabić tkanki łączne. Należy przy tym zachować szczególną ostrożność, aby nie wkładać skalpela głęboko, ponieważ może to spowodować uszkodzenie tkanki przegrody nosowej i nerwów lemieszowo-nosowych.
- Nałóż niewielką ilość (50-100 μl) kleju tkankowego na deskę i delikatnie przyłóż boczną krawędź prawej półkuli do kleju za pomocą kleszczyków Adson. Nadmiar wilgoci należy usunąć z bocznej strony preparatu za pomocą ręcznika papierowego, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji kleju i luźnemu przyleganiu do deski. UWAGA: Nałóż kilka kropel schłodzonego rozwarstwienia aCSF na próbkę, aby przyspieszyć polimeryzację kleju po umieszczeniu tkanki na kleju. Gwarantuje to, że tkanka pozostaje mocno przylegająca do deski.
- Umieść niewielką ilość (3-5 mm średnicy, 2 mm głębokości) tłuszczu próżniowego na środku wtórnej komory rozwarstwiania i mocno przyłóż stronę deski przeciwległą do tkanki przy smarze. Natychmiast napełnić komorę rozwarstwienia schłodzonym roztworem do rozwarstwiania aCSF, przenieść do obszaru drobnego rozwarstwienia i rozpocząć perfuzję natlenionym wzorcem aCSF. Ustaw deskę tak, aby opuszka węchowa znajdowała się bezpośrednio w strumieniu świeżo natlenionego wzorca aCSF.
4. Wtórne rozwarstwienie
- Za pomocą cienkich kleszczyków należy usunąć z preparatu widoczną przeciwległą (lewą) opuszkę węchową lub tkankę korową. Ściśnij cienkie kleszcze (tworząc półtępy punkt), a następnie umieść je w grzbietowej i ogonowej części tkanki w pobliżu linii środkowej. Delikatnie przesuń ściśnięte kleszcze wzdłuż linii środkowej, powoli odrywając tkankę od prawej półkuli ruchem do przodu. Usuń całą tkankę przeciwległą, w tym tkankę opuszki węchowej po drugiej stronie. Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie przebić się przez tkankę, co może spowodować uszkodzenie AOB lub nerwu lemieszowo-nosowego.
- Obserwuj białą oponę twardą wzdłuż grzbietowej/przyśrodkowej powierzchni opuszki węchowej. Rozerwij tę oponę twardą wzdłuż grzbietowo-ogonowej krawędzi opuszki węchowej, chwytając najbielszą część opony twardej dwiema parami cienkich kleszczy i odciągnij je od tego miejsca. Opona twarda jest ciasno owinięta wokół opuszki węchowej i może z łatwością przeciąć tkankę podczas jej usuwania. Unikaj uszkodzenia przyśrodkowej powierzchni opuszki węchowej i samego AOB. UWAGA: Jeśli opona twarda jest w tym momencie łatwo odporna na rozerwanie, wprowadź małe cięcie za pomocą cienkich nożyczek do preparowania ze sprężyną, aby ułatwić separację.
- Powoli i ostrożnie odklej korę czołową za pomocą cienkich kleszczy, nie uszkadzając leżących pod spodem opuszków węchowych. Obserwuj zbiór naczyń krwionośnych pojawiających się jako półprzezroczysta siatka bezpośrednio doogonowa do AOB. Usuń tę siatkę za pomocą cienkich kleszczy, aby ułatwić penetrację elektrody w eksperymentach elektrofizjologicznych. Chwyć siatkę kleszczami, gdy oddziela się od AOB podczas cofania kory czołowej i usuń ją, ciągnąc doogonowo i przyśrodkowo, uważając, aby nie dotknąć AOB. Gdy kora czołowa zostanie oddzielona od opuszki węchowej, usuń ją, przecinając kleszczami brzuszną i tylną do AOB. UWAGA: Zachowaj szczególną ostrożność podczas usuwania siatki, ponieważ jeśli zostanie to zrobione zbyt grubo, warstwa kłębuszkowa może ulec uszkodzeniu.
- W odsłoniętej przeciwległej jamie nosowej usuń pozostałą tkankę przegrody przeciwległej (cienki żółtawy arkusz zawierający naczynia krwionośne) za pomocą cienkich kleszczy. Chwyć tkankę w okolicy ogonowej/grzbietowej (w pobliżu kości przegrody), a następnie pociągnij/unieś tkankę w kierunku przedniej strony. UWAGA: Tkanka przegrody przeciwległej może zostać przypadkowo usunięta podczas etapu hemisekcji (krok 3.20). W takim przypadku należy zwrócić uwagę na białą, beznaczyniową chrząstkę przegrody oraz lekko przezroczystą, unaczynioną kość przegrody. W takim przypadku krok 4.4 można pominąć.
- Ostrożnie usuń kontralateralne VNO, przesuwając pojedynczy punkt drobnych kleszczy między chrząstką przegrody a "skrzydłem" VNO (cienki kawałek tkanki kostnej, który biegnie wzdłuż grzbietowej krawędzi obu VNO.
- Po oderwaniu skrzydła od chrząstki przesuń końcówkę kleszczy brzusznie do przeciwległego VNO w pobliżu linii środkowej. Powtórz ten krok w kilku miejscach wzdłuż osi rostralnej/ogonowej kontralateralnego VNO, aby go poluzować, umożliwiając usunięcie go poprzez chwycenie kleszczami i podniesienie.
- Przygotuj się do usunięcia chrząstki przegrody, wykonując nacięcie na brzusznej/ogonowej krawędzi (gdzie zwęża się do białego beznaczyniowego paska biegnącego wzdłuż brzusznej krawędzi kości przegrody) za pomocą cienkich kleszczy.
- Usuń chrząstkę przegrody, ściskając cienkie kleszcze, aby uzyskać półtępy punkt. Zidentyfikuj nacięcie wykonane w kroku 4.6, włóż ściśnięte kleszcze z tyłu (bocznie) do tego cięcia, a następnie powoli podnieś chrząstkę z tkanki przegrody i postępuj rostrally. UWAGA: Nie należy naruszać leżącej pod spodem tkanki przegrody. Gdy chrząstka jest podnoszona, obserwuj, jak leżący pod spodem arkusz tkanki przegrody rozciąga się z powodu luźnych zrostów z chrząstką. Okresowy, delikatny i stabilny ruch ściśniętych drobnych kleszczyków wzdłuż tego miejsca luźnego przylegania może znacznie ułatwić pomyślne oddzielenie dwóch struktur .
- Użyj pary kleszczy #3 z wygiętą końcówką, aby usunąć kość przegrody. Zbliż się do kości przegrody pod kątem prawie równoległym do płaszczyzny kości przegrody. Włóż zakrzywiony ząb między tkankę przegrody a kość przegrody. Chwyć kość kleszczami i delikatnie przesuwaj kość do przodu iz powrotem, aż pęknie w pobliżu płytki cribriform. UWAGA: W niektórych przypadkach kość przegrody będzie odporna na pękanie w pobliżu płytki cribriform. W takim przypadku użyj cienkich kleszczy, aby delikatnie naciąć kość przegrody wzdłuż osi grzbietowej/brzusznej tuż przed płytką cribriform, a następnie powtórz krok 4.8.
- Usuń białą chrząstkę tuż rostralnie do VNO, szczypiąc jedną parą drobnych kleszczy przy wejściu i ciągnąc rostralnie drugą parą cienkich kleszczy .
- Podłącz kaniulę poliimidową do urządzenia do szybkiej perfuzji i rozpocznij przepływ roztworu Ringera (0,1-0,3 ml/min) przez kaniulę poliimidową. UWAGA: Zmierz natężenie przepływu za pomocą wbudowanego przepływomierza o małej objętości. Zastosowanie sterowanego komputerowo pneumatycznego urządzenia przełączającego bodziec zmniejsza zmiany natężenia przepływu podczas stymulacji. Porównaj reakcje neuronalne na bodźce testowe z reakcjami na pozorowany bodziec (kontroluj roztwór Ringera), aby upewnić się, że odpowiedzi są specyficzne dla bodźca.
- Ustaw kaniulę równolegle do wejścia VNO. Gdy kaniula jest zadowalająco równoległa do wejścia VNO, obserwuj, jak ciśnienie wylotowe powoduje "nadmuchanie" VNO, co prowadzi do ewakuacji naczynia krwionośnego. Natychmiast włóż kaniulę do VNO, utrzymując stały kąt kaniuli, tak aby pozostał równoległy do otworu VNO. UWAGA: Pomocne może być przytrzymanie kaniuli jedną parą cienkich kleszczyków przy plastikowej desce i użycie drugiej pary cienkich kleszczyków, aby lekko pochylić koniec kaniuli do góry. Jeśli ktoś przypadkowo umieści kaniulę za VNO, odpływ może również spowodować ewakuację naczynia krwionośnego VNO, co prowadzi do wrażenia, że wykonano prawidłową kaniulację. Właściwa lokalizacja może być potwierdzona poprzez dodanie barwnika do roztworu Ringera. Gdy kaniula jest prawidłowo umieszczona, barwnik powinien wychodzić tylko przez wejście VNO. Dodatkowo można potwierdzić prawidłowe umieszczenie, upewniając się, że kaniula jest dobrze widoczna przez półprzezroczystą przyśrodkową część VNO.
- Przesuwaj plastikową deskę powoli, aż AOB znajdzie się w bezpośrednim przepływie standardowego aCSF, uważając, aby nie wysunąć kaniuli z VNO. Rozwarstwienie jest zakończone i natychmiast można rozpocząć ocenę funkcji fizjologicznych. W kroku 5 opisano pokrótce jedno z podejść do przeprowadzenia takiej oceny.
5. Ocena
- Penetruj powierzchnię AOB za pomocą mikroelektrody ze szkła borokrzemianowego 2-4 MΩ podłączonej do wzmacniacza zewnątrzkomórkowego i oscyloskopu.
- Powoli przesuwaj mikroelektrodę na głębokość 100-200 μm od powierzchni z prędkością 50 μm/min. UWAGA: Na tej głębokości tkanki można napotkać sporadyczne spontaniczne przebiegi potencjału czynnościowego, których przykładem są ostre, krótkie (~1-2 ms) ugięcia napięcia mikroelektrody.
- Po napotkaniu przebiegu potencjału czynnościowego zatrzymaj przesuwanie mikroelektrody.
- Obserwuj i/lub zapisuj szybkość potencjału czynnościowego podczas zmiany roztworu dostarczania bodźca z kontrolnego roztworu Ringera na znany aktywator aktywności VSN (np. roztwór Ringera zawierający 50 mM KCl). Jeśli sekcja zakończyła się sukcesem, można zaobserwować zależną od bodźca zmianę szybkości potencjału czynnościowego lub potencjału pola lokalnego. UWAGA: Nie wszystkie neurony AOB będą reagować na każdy bodziec wzrostem szybkości wyzwalania (w tym roztwór Ringera zawierający 50 mM KCl). Zależny od bodźca spadek szybkości wypalania wskazuje również na funkcjonalną łączność i udaną sekcję. W przypadku, gdy napotkane zostaną dwa lub więcej neuronów, które nie reagują na stymulację VNO, lub jeśli po wielokrotnych penetracjach elektrod nie obserwuje się potencjałów czynnościowych, sugeruje to nieudaną sekcję. W takim przypadku można rozpocząć nową sekcję w kroku 3.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Osiągnięcie sukcesu w tym przygotowaniu wymaga intensywnych ćwiczeń i składa się z kilku etapów, na których może dojść do niepowodzenia. Należy spodziewać się konieczności wykonania wielu prób przed uzyskaniem pożądanego rezultatu. Do pomyślnego przeprowadzenia tego protokołu niezbędna jest specjalistyczna komora do sekcji, którą należy pozyskać przed rozpoczęciem późniejszych etapów preparacji. Konstrukcja komory przedstawiona na Rysunku 1 jest wystarczająca do tego celu i może zostać wykonana z relatyw...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Preparat ex vivo VNO-AOB opisany w tym protokole jest użyteczną alternatywą dla znieczulonych in vivoeksperymentów 5-7 i ostrych żywych wycinków17 funkcji AOB. W przeciwieństwie do eksperymentów z ostrymi warstwami AOB, które również odsłaniają elementy obwodów do zapisów elektrofizjologicznych i optycznych, ten preparat zachowuje wszystkie aferenty czuciowe i połączenia wewnątrz AOB. Chociaż można to również powiedzieć o znieczulonych podejściach in vivo , obecno...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia istotnych konfliktów interesów.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez R00 DC011780 (JPM: NINDS, NIH), F30 DC011673 (GFH: NINDS, NIH) oraz UT Southwestern startup funds (JPM).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Nożyczki proste | Narzędzia do nauki | 14002-14 | |
| Cienkie nożyczki - proste | narzędzia do nauki | 14060-10 | |
| Cienkie nożyczki z zakrzywionymi | narzędziami naukowymi | 14061-10 | |
| Kleszcze Adson | Narzędzia do nauki | 11006-12 | |
| #3 Rękojeść skalpela | Narzędzia do nauki | 10003-12 | |
| #11 Ostrza skalpela | Fisher Scientific 3120030 | ||
| Proste żyletki ze stali węglowej | Fisher Scientific | 12-640 | |
| 35 mm Szalka Petriego | Fisher Scientific | 08-772-21 | |
| Komora preparcyjna | Custom | Nie dotyczy | Zobacz Rysunek 1 |
| Plastikowa deska Delrin 0,6 cm x 1,5 cm x 0,1 cm | Niestandardowe | Nie dotyczy | |
| Dow Corning Silikonowy smar próżniowy | Fisher Scientific | 146355D | |
| #5 Kleszcze, Studenckie | narzędzia do nauki | 91150-20 | |
| #5 Kleszcze, Wskazówka Biologia | Narzędzia do nauki | 11295-10 | |
| #5 Kleszcze, Studenckie | narzędzia naukowe | 91150-20 | |
| Vannas Nożyczki sprężynowe | Narzędzia | do nauki15000-08 | |
| 1/16" męski Luer | Cole-Parmer | EW-45505-00 | |
| 1/16" Rurka | Fisher Scientific | 14-171-129 | |
| zestaw perfuzyjny epoksydowy Grainger | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | różne | |
| KCl | Sigma-Aldrich | różne | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | różne | |
| MgCl2 sześciowodne | Sigma-Aldrich | różne | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | różne | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | różne | |
| myo-inozytol | Sigma-Aldrich | różne | |
| Na-pirogronian | Sigma-Aldrich | różne | |
| Na-askorbinian | Sigma-Aldrich | różne | |
| Bufor HEPES | Sigma-Aldrich | różne | |
| Glukoza | Sigma-Aldrich | różne |
Bibliografia
- Bruce, H. M. An exteroceptive block to pregnancy in the mouse. Nature. 184, 105(1959).
- Bellringer, J. F., Pratt, H. P., Keverne, E. B. Involvement of the vomeronasal organ and prolactin in pheromonal induction of delayed implantation in mice. J Reprod Fertil. 59, 223-228 (1980).
- Bean, N. J. Modulation of agonistic behavior by the dual olfactory system in male mice. Physiol Behav. 29, 433-437 (1982).
- Meredith, M. Vomeronasal organ removal before sexual experience impairs male hamster mating behavior. Physiol Behav. 36, 737-743 (1986).
- Hendrickson, R. C., Krauthamer, S., Essenberg, J. M., Holy, T. E. Inhibition shapes sex selectivity in the mouse accessory olfactory bulb. J Neurosci. 28, 12523-12534 (2008).
- Ben-Shaul, Y., Katz, L. C., Mooney, R., Dulac, C. In vivo vomeronasal stimulation reveals sensory encoding of conspecific and allospecific cues by the mouse accessory olfactory bulb. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (2010).
- Tolokh, I. I., Fu, X., Holy, T. E. Reliable sex and strain discrimination in the mouse vomeronasal organ and accessory olfactory bulb. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 13903-13913 (2013).
- Luo, M., Fee, M. S., Katz, L. C. Encoding pheromonal signals in the accessory olfactory bulb of behaving mice. Science. 299, 1196-1201 (2003).
- Binns, K. E., Brennan, P. A. Changes in electrophysiological activity in the accessory olfactory bulb and medial amygdala associated with mate recognition in mice. Eur J Neurosci. 21, 2529-2537 (2005).
- Leszkowicz, E., et al. Noradrenaline-induced enhancement of oscillatory local field potentials in the mouse accessory olfactory bulb does not depend on disinhibition of mitral cells. Eur J Neurosci. 35, 1433-1445 (2012).
- Ames, A. 3r, Gurian, B. S. Electrical Recordings from Isolated Mammalian Retina Mounted as a Membrane. Arch Ophthalmol. 70, 837-841 (1963).
- Flock, A. F., Strelioff, D. Studies on hair cells in isolated coils from the guinea pig cochlea. Hear Res. 15, 11-18 (1984).
- Woodbury, C. J., Ritter, A. M., Koerber, H. R. Central anatomy of individual rapidly adapting low-threshold mechanoreceptors innervating the 'hairy' skin of newborn mice: early maturation of hair follicle afferents. J Comp Neurol. 436, 304-323 (2001).
- Llinas, R., Muhlethaler, M. An electrophysiological study of the in vitro, perfused brain stem-cerebellum of adult guinea-pig. The Journal of physiology. 404, 215-240 (1988).
- Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459, 574-577 (2009).
- Meeks, J. P., Holy, T. E. An ex vivo preparation of the intact mouse vomeronasal organ and accessory olfactory bulb. J Neurosci Methods. 177, 440-447 (2009).
- Leinders-Zufall, T., et al. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405, 792-796 (2000).
- Kato, H. K., Chu, M. W., Isaacson, J. S., Komiyama, T. Dynamic sensory representations in the olfactory bulb: modulation by wakefulness and experience. 76, 962-975 (2012).
- Meeks, J. P., Arnson, H. A., Holy, T. E. Representation and transformation of sensory information in the mouse accessory olfactory system. Nature. 13, 723-730 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
