System hodowli całego jelita moczowego u myszy płodu do manipulacji ex vivo szlakami sygnałowymi i trójwymiarowego obrazowania na żywo rozwoju kosmków

Podsumowanie

Ulepszona technologia obrazowania pozwala na trójwymiarowe obrazowanie organów podczas rozwoju. W tym miejscu opisujemy cały system hodowli narządów, który umożliwia obrazowanie na żywo rozwijających się kosmków w jelicie płodu myszy.

Streszczenie

Większość procesów morfogenetycznych w jelicie płodu została wywnioskowana z cienkich odcinków stałych tkanek, dostarczając migawki zmian na kolejnych etapach rozwoju. Trójwymiarowe informacje z cienkich odcinków seryjnych mogą być trudne do zinterpretowania ze względu na trudności w doskonałej rekonstrukcji odcinków seryjnych i utrzymaniu prawidłowej orientacji tkanki nad odcinkami seryjnymi. Ostatnie odkrycia Grosse i wsp., 2011 podkreślają znaczenie informacji trójwymiarowej w zrozumieniu morfogenezy rozwijających się kosmków jelita¹. Trójwymiarowa rekonstrukcja pojedynczo znakowanych komórek jelitowych wykazała, że większość komórek nabłonka jelitowego styka się zarówno z powierzchnią wierzchołkową, jak i podstawną. Ponadto trójwymiarowa rekonstrukcja cytoszkieletu aktynowego na wierzchołkowej powierzchni nabłonka wykazała, że światło jelita jest ciągłe, a światła wtórne są artefaktem cięcia. Te dwa punkty, wraz z demonstracją interkinetycznej migracji jądrowej w nabłonku jelitowym, zdefiniowały rozwijający się nabłonek jelitowy jako nabłonek pseudostratyfikowany, a nie rozwarstwiony, jak wcześniej^sądzono1. Zdolność do trójwymiarowej obserwacji nabłonka była kluczowa dla wykazania tego punktu i ponownego zdefiniowania morfogenezy nabłonka w jelicie płodu. Wraz z ewolucją technologii obrazowania wielofotonowego i oprogramowania do rekonstrukcji trójwymiarowej, zdolność do wizualizacji nienaruszonych, rozwijających się narządów szybko się poprawia. Wzbudzenie dwufotonowe pozwala na mniej szkodliwą penetrację w głąb tkanek z wysoką rozdzielczością. Obrazowanie dwufotonowe i rekonstrukcja 3D całych jelit myszy płodu w Walton et al., 2012 pomogły określić wzorzec wyrastania kosmków². Tutaj opisujemy cały system hodowli narządów, który umożliwia rozwój kosmków ex vivo i rozszerzenia tego systemu hodowli, aby umożliwić trójwymiarowe obrazowanie jelit podczas ich rozwoju.

Wprowadzenie

Każdy biopsek jelitowy składa się z dwóch głównych przedziałów tkankowych: warstwy powierzchniowej nabłonka i rdzenia mezenchymalnego. Jelito cienkie myszy powstaje w 10 dniu embrionalnym, kiedy arkusz endodermy zamyka się i uszczelnia, tworząc rurkę nabłonka otoczoną komórkami mezenchymalnymi³. Ta płaska rurka nabłonka ulega szybkiej proliferacji, rośnie zarówno pod względem długości, jak i obwodu, i ulega dramatycznym przegrupowaniom obejmującym dynamiczne zmiany kształtu komórki¹. W tym samym czasie otaczająca mezenchyma również przechodzi wiele procesów rozwojowych, w tym tworzenie się splotu naczyniowego, różnicowanie mięśni gładkich i rekrutację neuronów jelitowych⁴. W bliższym jelicie cienkim w 14,5 dniu embrionalnym zaczynają tworzyć się kondensacje (skupiska) komórek reagujących na Hedgehog i PDGF w sąsiedztwie nabłonka^2,5. Tworzenie się skupisk mezenchymalnych nadal rozprzestrzenia się na całej długości jelita, tak że pokrywają całe jelito cienkie do 16,5 2 dnia embrionalnego^. W miarę tworzenia się klastrów mezenchymalnych komórki nabłonkowe znajdujące się najbliżej klastrów zaczynają wycofywać się z cyklu komórkowego, podczas gdy inne komórki nabłonkowe nadal się namnażają. Te komórki bezpośrednio nad skupiskiem mezenchymalnym, które wycofały się z cyklu komórkowego, zaczynają zmieniać kształt, gdy pojawiające się kosmki wyginają się w świetle. Dalszy wzrost kosmków jest częściowo napędzany przez ciągłą proliferację nabłonka między pojawiającymi się kosmkami. Skupiska mezenchymalne pozostają ściśle przylegające do nabłonka rosnących kosmków i nadal wyrażają różnorodne cząsteczki sygnałowe. Fala wyłaniania się kosmków rozchodzi się wzdłuż długości jelita cienkiego po utworzeniu skupisk mezenchymalnych. W miarę jak jelito nadal rośnie, a obszar międzykosmkowy rozciąga się między pojawiającymi się kosmkami, w sąsiedztwie nabłonka międzykosmkowego tworzą się nowe skupiska mezenchymalne i następują kolejne rundy pojawiania się i wzrostu kosmków⁶.

Zsynchronizowany rozwój nabłonka i mezenchymy jest niezbędny dla morfogenezy kosmków. Cząsteczki sygnałowe są wydzielane z jednej warstwy do drugiej, gdzie receptory odbierają i przekazują wiadomość sygnałową w celu skoordynowania rozwoju między nabłonkiem a mezenchymą. Klastry mezenchymalne działają jako centra sygnalizacyjne i wyrażają różnorodne morfogeny rozwojowe^7-10. Zakłócenie tworzenia się klastrów lub wzorca powoduje utratę wyłaniania się kosmków i wzorca. Hamowanie sygnalizacji PDGF skutkuje mniejszą liczbą skupisk i mniejszą liczbą kosmków, a te kosmki, które się tworzą, są zniekształcone po nieprawidłowych klastrach¹¹. Utrata sygnalizacji Hedgehog powoduje całkowitą utratę tworzenia klastrów i niepowodzenie wyłaniania się kosmków^2,12. Łącznie dane te pokazują, że klastry koordynują rozwój nabłonka kosmków z jego mezenchymalnym rdzeniem.

Korzystając z całego systemu hodowli narządów, jesteśmy w stanie zmienić sygnalizację zaangażowaną w przesłuch klastrów nabłonkowo-mezenchymalnych, aby określić rolę tych sygnałów w morfogenezie kosmków. Dwufotonowe konfokalne przekroje optyczne i rekonstrukcja dają możliwość wizualizacji powstawania gromad i wyłaniania się kosmków w trzech wymiarach oraz lepszego zrozumienia relacji przestrzennych między gromadami mezenchymalnymi a leżącym nad nimi nabłonkiem. Rozszerzając system hodowli na cztery wymiary, możemy uchwycić stosy z rozwijających się klastrów i kosmków w czasie i obserwować te interakcje. Ostatecznie możliwość śledzenia rozwoju kosmków w ten sposób i obserwowania zmian zachodzących przy zmienionej sygnalizacji zrewolucjonizuje zrozumienie nabłonkowych interakcji mezenchymalnych w morfogenezie kosmków.

Protokół

UWAGA: Wszystkie myszy były traktowane humanitarnie, korzystając z protokołów zatwierdzonych przez Jednostkę Szkoły Medycznej Uniwersytetu Michigan dla Laboratoryjnej Medycyny Zwierząt i zgodnie z wytycznymi Uniwersyteckiego Komitetu ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami.

1. Cały system hodowli narządów

1. Przygotowanie pożywek i płytek hodowlanych
   1. W kapturze do hodowli tkankowej wyjąć 5 ml pożywki BGJb z butelki podstawowej i dodać 5 ml wstrzykiwacza/paciorkowca. Przygotować zapas roboczy pożywki w stożkowej probówce o pojemności 50 ml, dodając 1 ml kwasu askorbinowego o stężeniu 5 mg/ml do 49 ml pożywki BGJb (za pomocą wstrzykiwacza/paciorkowca).
   2. Przygotować 6-dołkową płytkę hodowlaną, dodając 1 ml pod każdą z transwelli.
      UWAGA: Jeśli wszystkie 6 transwelli nie jest używanych, przenieś dodatkowe transwelle do świeżej sterylnej płytki 6-dołkowej do późniejszego użycia. Dodać 3 ml roboczej pożywki BGJb do każdej z trzech sterylnych szalek Petriego o średnicy 10 cm.
2. Przygotowanie do sekcji
   1. Namocz narzędzia preparacyjne w 70% etanolu i upewnij się, że narzędzia są czyste podczas pracy.
   2. Ustawić obszar preparacji z dużym wiadrem na lód i umieścić 6-dołkową płytkę hodowlaną i 10-centymetrowe szalki Petriego z pożywką BGJb na lodzie. Pracuj na lodzie tak często, jak to możliwe, jednocześnie preparując i przygotowując jelita do hodowli.
   3. Znieczulić dorosłe samice myszy w komorze z izofluoranem (100 μl) przed eutanazją przez zwichnięcie szyjki macicy w celu pobrania jelit płodowych.
   4. Po zebraniu płodów od matki, każdy płód należy starannie ułożyć zgodnie z tabelą stopnia zaawansowania Theilera¹³. Nie należy polegać na dniach po stosunku, aby określić wiek każdego płodu, ponieważ zmiany w stadium rozwojowym do 24 godzin są rutynowo obserwowane w jednym miocie.
3. Rozwarstwienie jelit płodu
   1. Eutanazja płodu przez dekapitację przed usunięciem jelit.
   2. Wypreparuj każde jelito w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dulbecco (DPBS), a następnie umieść je na 10-centymetrowej płytce Petriego z działającą pożywką BGJb.
   3. Ostrożnie usuń śledzionę z żołądka i trzustkę z żołądka i górnej dwunastnicy.
   4. Delikatnie oddzielić sieć krwi, uważając, aby sieć była jak najbardziej przyczepiona i rozdzielając połączenia tylko na tyle, aby umożliwić wyprostowanie jelita.
      UWAGA: W przypadku jelit starszych niż E14,5 lub hodowanych dłużej niż 24 godziny, delikatnie rozdziel jelito na 3 równe segmenty, aby umożliwić przepływ treści świetlnej przez jelito i wydalenie z odciętych końców. Jednak w przypadku kultur rozpoczętych przed E13.5 należy odczekać do 24 godzin hodowli przed oddzieleniem 3 segmentów jelita, aby umożliwić prawidłowy wzrost surowiczości na całej długości jelita.
   5. Za pomocą pipety doustnej przenieść kawałki jelita na transwelle płytki hodowlanej (1.1.2).
   6. W razie potrzeby delikatnie przełóż jelita tak, aby znajdowały się prosto w poprzek transwell.
      UWAGA: Gdy jelita zaczną przemieszczać zawartość światła przez rurkę, wszelkie załamania w jelicie spowodują cofnięcie się i uszkodzenie jelita.
4. Kultura i leczenie
   1. Usunąć pożywkę spod transwell, dodać 700 μl pożywki zabiegowej (pożywki roboczej z dodatkiem rekombinowanych białek lub inhibitorów farmakologicznych) pod transwell.
   2. Dodać kroplami 300 μl pożywki leczniczej na wierzch jelit i pozostawić do przesiąknięcia przez transwell. W razie potrzeby zmień położenie jelit.
   3. Pożywkę leczniczą należy zmieniać co najmniej raz na dobę lub częściej, w zależności od okresu półtrwania odczynnika leczniczego.
5. Przygotowanie namoczonych białkiem kulek agarozy jako miejscowego źródła odczynnika do leczenia
   1. Ponownie zawiesić kulki agarozy w pojemniku do przechowywania i przenieść 100 μl kulek agarozy do probówki do mikrofuzy o pojemności 1,5 ml.
   2. Napełnij pozostałą objętość probówki sterylnym 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i wymieszaj kulki, aby je umyć. Umieść probówkę do mikrofuge w stojaku na kilka minut, aby kulki osiadły na dnie, a następnie odpipetuj PBS z wierzchu kulek. Napełnij probówkę do mikrofuge sterylnym 1x PBS i powtórz proces prania jeszcze dwa razy.
   3. Przygotuj interesujące Cię białko o stężeniu dwukrotnie większym niż pożądane do leczenia.
   4. Wymieszaj 5 μl umytych kulek agarozy z 5 μl 2x bulionu białkowego i delikatnie wymieszaj kulki w białku. Umieść probówkę na lodzie na 1 godzinę, delikatnie mieszając co 10-15 minut.
   5. Opłucz kulki krótko w sterylnym 1x PBS przed umieszczeniem koralików na jelitach.
6. Umieszczanie koralików agarozy
   1. Delikatnie umieść koraliki agarozy na wierzchu jelit za pomocą pipety do ust z wyciągniętymi igłami kapilarnymi. Układaj koraliki z najwyższą ostrożnością, ponieważ nieostrożne obchodzenie się z jelitem uszkodzi jelito i zapobiegnie rozwojowi kosmków w uszkodzonym obszarze.
   2. Umieść dwa razy więcej koralików, niż jest to potrzebne do analizy, ponieważ jelita ulegną ruchom perystaltycznym, a około połowa umieszczonych kulek stoczy się z jelit w czasie hodowli.
7. Utrwalenie jelit hodowlanych
   1. Ostrożnie usunąć pożywkę zabiegową spod transwell i pozostawić jelita do wyschnięcia na powietrzu przez 3 minuty.
   2. Dodać 1 ml utrwalacza pod transwell na 2 minuty, a następnie przykryć górną część jelita 2 ml utrwalacza na pozostałą część czasu utrwalania. Utrwalić za pomocą 4% paraformaldehydu O/N w temperaturze 4°C lub przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.

2. Obrazowanie jelit nieruchomych

1. Obrazowanie Wholemount
   1. Umieścić całe jelita (z endogenną fluorescencją) na szkiełku ze 100 μl 1x DPBS. Użyj kleszczy, aby delikatnie ułożyć jelita.
   2. Użyj chusteczki laboratoryjnej, aby ostrożnie usunąć DPBS i natychmiast dodaj 100 μl 70% glicerolu, aby tkanka była bardziej przezroczysta i zwiększyła możliwą głębokość obrazowania.
      UWAGA: Jeśli pożądana jest dalsza penetracja jelita, zamiast montować jelito w 70% glicerolu, należy namoczyć jelito w kilku kroplach roztworu Focus Clear przez 10-30 minut. Odpipetować roztwór Focus Clear i zamontować w jelicie za pomocą Mount Clear.
   3. Zanurz każdy z czterech rogów szkiełka nakrywkowego w plastelinie i podnieś niewielką ilość gliny, aby użyć jej jako przekładki między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem nakrywkowym, aby szkiełko nakrywkowe nie spłaszczyło jelita.
   4. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe na szkiełku za pomocą stopionego VALAP nałożonego bawełnianym wacikiem.
   5. Zobrazuj jelita na pionowym lub odwróconym mikroskopie konfokalnym. Aby uzyskać więcej informacji, zapoznaj się z dyskusją.
2. Przekroje wibratomiczne jelit utrwalonych (w celu przekroju poprzecznego struktur jelitowych)
   1. Zanurz jelita w 7% agarozie w małych plastikowych foremkach (10 x 10 x 15 mm) i pozwól blokom agarozy ostygnąć i zestalić się.
   2. Usuń bloki agarozy z plastikowych form i przyklej bloki agarozy do etapu zbierania wibratomu za pomocą kleju błyskawicznego.
   3. Napełnij etap zbierania lodowatym 1x DPBS.
   4. Ciąć sekcje o grubości od 100 do 150 μm. W przypadku grubszych przekrojów należy zastosować rozwiązania czyszczące (opisane w sekcji 2.1.2), aby uzyskać głębszą wizualizację przekroju.
   5. Wlać skrawki wibratomu z etapu zbierania do studzienki na płytce 6-dołkowej w celu przechowywania w temperaturze 4 °C.
3. Barwienie immunofluorescencyjne nieruchomych, wyciętych wibratomem tkanek
   1. Umieść 5-12 sekcji wibratomu na studzience w 24-dołkowej płytce z 1x DPBS.
   2. Usuń 1x DPBS i dodaj 500 μl roztworu przepuszczalnego do studzienki. Delikatnie kołysz próbkami przez 25 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Po przepuszczalności przemyć próbki 3 razy 1x PBS.
   4. Próbki należy zablokować na co najmniej 30 minut w 500 μl roztworu blokującego.
   5. Po zablokowaniu wymienić roztwór blokujący na 500 μl przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczonych w roztworze blokującym i utrzymywać próbki w temperaturze 4 °C O/N.
      UWAGA: Pierwotne rozcieńczenia przeciwciał, które działają dobrze na skrawkach zamrożonych i parafinowych, na ogół działają również dobrze na skrawki wibratomu, jednak przeciwciała wymagające pobrania antygenu jądrowego na ogół nie działają dobrze z tym protokołem (np. BrdU).
   6. Następnego dnia przemyć próbki 3 razy przez 15 minut za każdym razem roztworem blokującym.
   7. Po umyciu nanieść 500 μl przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w roztworze blokującym. Owiń 24-dołkową płytkę folią aluminiową, aby chronić fluorofory przed światłem i kołysz próbki przez 45 minut do 2 godzin w temperaturze pokojowej.
   8. Przemyć próbki 3 razy 1x PBS przez 15 minut każda i zamontować sekcje wibratomu na szkiełkach podstawowych zgodnie z opisem w sekcji 2.4.
4. Montaż sekcji wibratomu
   1. Przygotuj szkiełka do montażu wibratomowego, wycinając cienkie plasterki taśmy dwuklejącej i umieszczając je wzdłuż dłuższych boków szkiełek.
   2. Ostrożnie umieść 5-10 sekcji wibratomu między taśmą podwójnie klejącą na szkiełkach w kropli 100 μl 1x PBS.
   3. Rozłóż wszystkie sekcje i rozłóż je na jednej warstwie na zjeżdżalni.
   4. Usuń nadmiar agarozy lub nierówne kawałki, które uniemożliwiłyby płaskie przyleganie szkiełka nakrywkowego.
   5. Ostrożnie użyj chusteczki laboratoryjnej, aby wchłonąć nadmiar 1x PBS z okolic sekcji wibratomu.
   6. Dodaj kroplę wodnego podłoża mocującego na wierzch sekcji wibratomu, a następnie szkiełko nakrywkowe.
   7. Uszczelnij szkiełka nakrywkowe na szkiełkach za pomocą stopionego VALAP nałożonego bawełnianym wacikiem.
   8. Zobrazuj sekcje wibratomu na pionowym lub odwróconym mikroskopie konfokalnym. Zapoznaj się z dyskusją, aby uzyskać więcej informacji na temat wyboru systemu obrazowania.

3. Obrazowanie na żywo całych jelit

Jelita pobrane od płodów po E12.5, z nienaruszoną połączoną siecią komórkową, pomyślnie rozwijają kosmki w hodowli przy użyciu powyższego systemu. W związku z tym ten system ex vivo pozwala na uchwycenie obrazów na żywo przekroju z rozwijających się jelit, które można zrekonstruować w celu uzyskania trójwymiarowego obrazu morfogenezy w czasie.

1. Konfigurowanie obrazowania na żywo
   1. Użyj kleju błyskawicznego, aby przykleić pojedynczą membranę poliwęglanową do sita o drobnych oczkach. Zapewnia to rusztowanie podporowe, które utrzymuje jelito na miejscu poniżej soczewki zanurzeniowej pionowego mikroskopu konfokalnego. Zapoznaj się z sekcją dyskusji, aby uzyskać więcej informacji na temat wyboru mikroskopów do obrazowania na żywo.
   2. Umieść siatkę w środkowej studzience płytki hodowlanej.
   3. Umieść wycięte jelito na membranie poliwęglanowej i dodaj kroplę kleju instant na obu końcach. Używaj tylko tyle kleju, aby przymocować jelito, ale nie pokrywaj go!
   4. Dodać pożywkę hodowlaną wolną od czerwieni fenolowej poniżej membrany poliwęglanowej w środkowej studzience płytki hodowlanej.
   5. Dodaj wodę do zewnętrznej krawędzi płytki hodowlanej, aby zapewnić wilgotność.
   6. Ponieważ jelito płodu przechodzi w hodowli fale skurczu podobne do perystaltyki, dodaj 100 μl roztworu ksylazyny w 1:5 w 1x PBS do 3 ml pożywki, aby kontrolować ruch jelita podczas obrazowania. Ta dawka będzie kontrolować ruchy jelit przez około 8-10 godzin bez uszczerbku dla rozwoju kosmków.
   7. Aby uzyskać widok poprzeczny jelita, zanurz żywe jelita w 3-4% roztworze agarozy i wytnij grube odcinki (150-500 μm) na wibratomie. Dopasuj sztywność agarozy do sztywności przecinanego jelita i empirycznie określ etap rozwoju. Ogólnie rzecz biorąc, 3% roztwór agarozy działa dobrze na jelita młodsze niż E14,5, a 4% roztwór działa dobrze na jelita E15-E16.
   8. Przykleić skrawki wibratomu do membrany poliwęglanowej przymocowanej do siatki siatkowej (jak w sekcji 3.1.1) i kulturę zgodnie z opisem w sekcji 3.1.2-3.1.6.
   9. Obrazowanie na żywo można przeprowadzić za pomocą dwufotonowego konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego (laser wzbudzający w zakresie 690-1 040 nm) na pionowym statywie z przestrajalnym stołem.
   10. Laser dwufotonowy dostrojony do 900 nm zapewnia głęboką penetrację z najlepszą rozdzielczością dla sygnałów GFP. Zmniejsza uszkodzenia tkanek podczas obrazowania. Ponadto ustawienie mocy lasera na najniższą możliwą emisję zmniejsza uszkodzenia tkanek. Zazwyczaj, aby uzyskać dobre wzbudzenie GFP, należy użyć 12% mocy lasera dwufotonowego.

Wyniki

Hodowla całych eksplantów jelit płodowych pozwala na analizę lokalizacji, rozkładu i czasu trwania działania cząsteczek sygnałowych koordynujących rozwój jelit, ponieważ system ten umożliwia manipulowanie sygnalizacją za pomocą odczynników farmakologicznych lub białek rekombinowanych. System hodowli transwell (Rycina 1A, powielona z Walton et al., 2012)² zapewnia interfejs powietrze-ciecz, co umożliwia umieszczenie na tkance kulek agarozowych nasączonych lekiem lub białkiem, a tym sam...

Dyskusja

Dynamiczna natura i złożone interakcje tkankowe rozwijającego się jelita wymagają wizualizacji 3D, aby w pełni docenić te zdarzenia morfogenetyczne. Wraz z rozwijającą się technologią obrazowania rozwija się/poprawia zdolność do szczegółowego badania morfogenezy kosmków, a wraz z nią znacznie zwiększa się zrozumienie komunikacji przestrzennej i interakcji podczas organogenezy.

Przetestowano również alternatywne metody hodowli całych jelit, ale system transwell pozostaje najbardziej niezawodny ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Cienkie kleszcze preparacyjne	Narzędzia naukowe	11254-20	2 pary
70% etanolu
1x sterylna sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS)	Gibco	14040-133	500 ml
Płytki 6-dołkowe	Costar	3516
Płytki 24-dołkowe Costar		3524
Szalki Petriego 60 x 15 mm	Sokół
Płyty Transwell, wkładki 24 mm, membrany poliwęglanowe 8,0 mm	Corning Costar	3428	6 wkładek na płytkę
BGJb media	Invitrogen	12591-038	500 ml
PenStrep (10 000 j./ml penicyliny; 10 000 mg/ml streptomycyny)	Gibco	15140
Kwas askorbinowy	Sigma	A0278	przygotować 5 mg/ml bulionu, przefiltrować, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 &; C
Pipeta ustna (zespół rurki aspiratora Drummond 1-15 cali)	Fisher	21-180-10	Wyjmij zespół aspiratora i zastąp go 1,000 &mikro; l końcówka pipety, która działa jak adapter do podłączenia 6-calowej szklanej pipety Pasteura.
6-calowe szklane pipety
Rurki kapilarne	World Precision Instruments	TW100F-4	pull to needles
4% Paraformaldehyd			wykonany w 1 x PBS, pH do 7,3
Płytki hodowlane	Sokół
Zakup ekranu ze stali nierdzewnej o drobnych oczkach	w sklepie
Membrany poliwęglanowe	Thomas scientific	4663H25	alternatywnie, odetnij membrany Corning Costar 3428 z podpór transwell
Natychmiastowy zakup kleju	w sklepie z narzędziami	najlepiej
żelu 35 x 10 mm Falcon
7% agarozy	Sigma	A9414	przygotować w/v w 1x DPBS, podgrzewanie do rozpuszczenia w kąpieli wodnej
minutien pins	Fine Science Tools	26002-20
Pożywka bez czerwieni fenolowej (DMEM)	Gibco	21063-029
Ksylazyna (100 mg/ml)	AnaSed	139-236
Matrigel	BD	356231	matryca błony podstawnej, obniżony czynnik wzrostu, wolny od czerwieni fenolowej
3-4% agarozy	Sigma	A9414	przygotować w/v w 1x DPBS, podgrzewanie do rozpuszczenia w kąpieli wodnej
Obrazowanie jelit
Nazwa materiału/sprzętu	Firma	Numer katalogowy	Uwagi/Opis
wazelina	zakupiona w aptece		używana do produkcji VALAP: równe części wazeliny, lanoliny, parafiny
lanoliny	Sigma	L7387	używany do produkcji VALAP: równe części wazeliny, lanoliny, parafiny parafinowej
	Surgipath	39601006	używany do produkcji VALAP: równe części wazeliny, lanoliny, parafiny
70% glicerolu w 1 x PBS
Focus clear i Mount Clear	CelExplorer Labs Co.	F101-KIT
Zakup plasteliny			artykułami plastycznymi
podwójna taśma
aplikator waciki plastikowe
formy, 10 mm x 10 mm x 5 mm)	Tissue Tek	4565
szkiełka
nakrywkowe
chusteczki laboratoryjne	Kimberly Clark	34155	niestrzępiąca się delikatna chusteczka zadaniowa
Wykres inscenizacji Theiler			http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ pliki do pobrania/theiler2.pdf
Mikroskop konfokalny Leica SP5X	Leica		Służy do wykonywania zdjęć na żywo
Stojak Leica DMI 6000	Leica		Służy do wykonywania zdjęć na żywo
Wodne podłoże montażowe (Prolong Gold)	Sondy molekularne	P36930
Nazwa firmy: materiał/sprzęt		Numer katalogowy	Komentarze/Opis
Płytka 24-dołkowa	Costar	3524
Triton X-100	Sigma	T-8787	używany do wytwarzania roztworu przepuszczalności: 0,5% Triton X-100 w 1 x
PBS Kozia surowica			używana do wytwarzania roztworu blokującego: 4% surowicy koziej, 0,1% Tween20 w 1x PBS
Tween20	Sigma	Zobacz materiał P9416

451007Pasteura353037z narzędziamina bazie351008utrwalonych w sklepie z samoprzylepna powiedział: