Artykuł metodologiczny

Multimodalne metody mikroskopii optycznej ujawniają morfologię i strukturę tkanek polipowych w karaibskich koralowcach budujących rafy

DOI:

10.3791/51824

⸱

5 września 2014

 ,  ,  , 
1Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Geology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Microbiology, University of Illinois at Urbana-Champaign

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zintegrowany zestaw technik obrazowania został zastosowany do określenia morfologii polipów i struktury tkanek u karaibskich koralowców Montastraeaannularis i M. faveolata. Fluorescencja, szeregowa powierzchnia blokowa i dwufotonowa konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa pozwoliły zidentyfikować strukturę płatów, ściany polipów oraz oszacować gęstości i rozkłady chromatoforów i zooksantelli.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zintegrowany zestaw technik obrazowania został zastosowany do określenia trójwymiarowej (3D) morfologii i struktury komórkowej tkanek polipów, składających się na karaibskie koralowce budujące rafy Montastraeaannularis i M. faveolata. Podejścia te obejmują mikroskopię fluorescencyjną (FM), obrazowanie twarzy w bloku szeregowym (SBFI) i dwufotonową konfokalną laserową mikroskopię skaningową (TPLSM). SBFI zapewnia głębokie obrazowanie tkanek po fizycznym przekroju; szczegółowo opisuje teksturę powierzchni tkanki i wizualizację 3D do głębokości tkanki większej niż 2 mm. Komplementarne FM i TPLSM dają obrazy struktury komórkowej tkanek o ultrawysokiej rozdzielczości. Wyniki: (1) zidentyfikowały wcześniej nieopisywane morfologie tkanek płatowych na zewnętrznej ścianie poszczególnych polipów koralowców oraz (2) stworzyły pierwsze mapy powierzchni rozkładu 3D i gęstości tkanek chromatoforów i endosymbiontów zooksantelli podobnych do glonów. Widmowe piki absorpcji wynoszące odpowiednio 500 nm i 675 nm sugerują, że M. annularis i M. faveolata zawierają podobne typy chlorofilu i chromatoforów. Jednak M. annularis i M. faveolata wykazują znaczące różnice w gęstości tkanek i rozmieszczeniu 3D tych kluczowych składników komórkowych. To badanie koncentrujące się na metodach obrazowania wskazuje, że SBFI jest niezwykle przydatny do analizy dużych próbek w skali mm odwapnionych tkanek koralowców. Uzupełniające FM i TPLSM ujawniają subtelne zmiany w skali submilimetrowej w rozmieszczeniu i gęstości komórek w nieodwapnionych próbkach tkanek koralowców. Technika TPLSM zapewnia: (1) minimalnie inwazyjne przygotowanie próbki, (2) doskonałą zdolność cięcia optycznego oraz (3) minimalną absorpcję i rozpraszanie światła, jednocześnie umożliwiając obrazowanie głębokich tkanek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Globalne ocieplenie i towarzyszące mu zmiany środowiskowe bezpośrednio wpływają na zdrowie i rozmieszczenie tropikalnych koralowców morskich1-4. Obserwuje się wielorakie skutki, w tym blaknięcie koralowców i pojawienie się chorób zakaźnych5-6. Jednak dokładniejsze przewidywanie przyszłej reakcji koralowców na te zagrożenia środowiskowe będzie wymagało ustalenia histologicznej "linii bazowej", która określa morfologię tkanek oraz skład i rozmieszczenie komórek dla "pozornie zdrowych" koralowców. Z kolei "dotknięte" koralowce mogą być następnie porównywane ilościowo. Co więcej, ten punkt odniesienia powinien zostać ustalony dla pozornie zdrowych koralowców w różnych warunkach środowiskowych, tak aby "zdrowa reakcja" mogła być również mierzona w gradientach środowiskowych. Jako pierwszy krok w kierunku ustalenia tej linii bazowej, podjęto badanie 3D w wysokiej rozdzielczości, aby sprawdzić, w jaki sposób pozornie zdrowa morfologia i skład komórkowy tkanki polipów koralowców reagują na wzrost głębokości wody (WD) i towarzyszące temu spadki natężenia promieniowania słonecznego. Wyniki mogą być następnie wykorzystane do ustalenia bardziej wszechstronnego mechanistycznego zrozumienia adaptacji koralowców, a także do uzyskania wglądu w ewolucję koralowców i poprawę pozyskiwania światła.

Kamienne koralowce (Scleractinia) to kolonialne morskie bezkręgowce, które są domem dla złożonego zbioru innych mikroorganizmów, zbiorczo określanych jako holobiont koralowy7-10. Badania podjęte w niniejszym badaniu mają na celu wykorzystanie zestawu najnowocześniejszych technologii obrazowania do jednoczesnego śledzenia zmian wraz ze wzrostem głębokości wody w pigmentach tkankowych i symbiotycznych zooksantelliach pozornie zdrowych koralowców gospodarzy. Pozwoli to na ustalenie wymaganej porównawczej "linii bazowej" komórek tkankowych w poprzek gradientu batymetrycznego dla pozornie zdrowych koralowców i będzie działać jako wskaźniki zdrowia koralowców10. Pigmenty koralowe, zwane chromatoforami, działają w celu pochłaniania, odbijania, rozpraszania, załamywania, dyfrakcji lub w inny sposób zakłócania padającego promieniowania słonecznego11. Endosymbiotyczny związek zooksantelli-chromatoforu umożliwił koewolucję strategicznie korzystnej optymalizacji zbierania światła i strategii wzrostu szkieletu, a także plastyczności troficznej (zmiana strategii żywieniowych tam iz powrotem od autotrofii do heterotrofii) dla zwierzęcia koralowego12.

Południowy karaibski wyspiarski naród Curaçao (dawniej część Antyli Holenderskich) leży około 65 km na północ od Wenezueli w obrębie archipelagu Aruba-La Blanquilla o trendzie wschód-zachód (Rysunek 1A). Południowe wybrzeże Curaçao o długości 70 km zawiera ciągły współczesny i mioceńsko-plioceński, plejstoceński i holoceński starożytny obszar rafy koralowej13,14. Średnia roczna SST na Curaçao waha się około 3 °C rocznie, od minimum 26 °C pod koniec stycznia do maksimum 29 °C na początku września, ze średnią roczną temperaturą 27,5±0,5 ºC (NOAA SST Data Sets, 2000-2010). Rafa koralowa w Playa Kalki (12°22'31.63"N, 69°09'29.62"W), leżąca w pobliżu północno-zachodniego krańca Curaçao (Ryc. 1A), została wybrana do pobierania próbek, ponieważ została wcześniej dobrze przebadana, a ekosystem morski w tym miejscu jest skąpany w świeżej, niezanieczyszczonej wodzie morskiej7,15-19. Dwa blisko spokrewnione gatunki koralowców skleraktyńskich, M. annularis i M. faveolata, zostały wybrane do eksperymentów i analiz w tym badaniu, ponieważ każdy gatunek: (1) wykazuje wyraźnie różne i nienakładające się na siebie rozmieszczenia batymetryczne na szlaku rafy w odniesieniu do pęknięcia szelfu i związanych z nim środowisk osadów węglanowych (zakres M. annularis = 0-10 m WD; Zasięg M. faveolata = 10-20 m WD20; Rysunki 1B, 2A i 2B); (2) jest powszechnym budowniczym ram raf koralowych na całym Morzu Karaibskim21; oraz (3) ma dobrze zbadane zależności ekologiczne, fizjologiczne i ewolucyjne22.

Próbkowanie terenowe do niniejszego badania zostało przeprowadzone przy użyciu standardowych technik nurkowania u wybrzeży Playa Kalki na Curaçao. Ustanowiono transekt batymetryczny od płytkiej do głębokiej wody, który biegł w poprzek szelfu, nad pęknięciem szelfu i do głębokich wód przed rafą. Najwyraźniej zdrowe głowy koralowców zostały następnie zidentyfikowane do pobrania próbek wzdłuż tego batymetrycznego transektu, w tym: (1) trzy pojedyncze głowy koralowców M. annularis o średnicy ~ 1 m, z których wszystkie znajdowały się na głębokości 5 m wody (WD); oraz (2) trzy pojedyncze głowy koralowców M. faveolata o średnicy ~ 1 m, z których wszystkie znajdowały się na głębokości 12 m WD. Promieniowanie fotosyntetycznie aktywne (PAR) mierzono jako 33-36% PAR przy 5 m WD i 18-22% PAR przy 10 m WD. Pobieranie próbek przeprowadzono w styczniu, gdy SST wynosił 26 °C na głębokości wody zarówno 5 m, jak i 12 m. Próbki każdej z tych sześciu głów koralowców pobrano w trzech egzemplarzach w równoważnych pozycjach przestrzennych (tj. około 45° szerokości geograficznej północnej na każdej z sześciu półkulistych głów koralowców). Każda indywidualna próbka składała się z biopsji rdzenia tkanki koralowej o średnicy 2,5 cm, którą pobrano za pomocą oczyszczonego stempla łukowego. Trzy biopsje tkanki koralowej i szkieletu zostały pobrane na standardowym nurkowaniu z rękami w rękawiczkach z każdej z głów koralowców (9 z kolonii M. annularis na 5 m WD i 9 z M. faveolata na 12 m WD). Natychmiast po pobraniu na głębokość, każda próbka rdzenia biopsji została umieszczona w sterylnej probówce wirówkowej z polipropylenu o pojemności 50 ml, zakręcona i zwrócona na powierzchnię. Woda morska została zdekantowana z każdej probówki wirówkowej, a następnie każda biopsja rdzeniowa została zanurzona, przechowywana i transportowana w 4% paraformaldehydzie.

Obrazowanie SBFI zostało wcześniej wykonane na szerokim zakresie próbek biologicznych, w tym na tkankach ludzkich całego mózgu i całego serca, nienaruszonych embrionach myszy, zarodkach ryb zebry i wielu rodzajach próbek zwierzęcych z nienaruszonymi kośćmi23-30. Większość z tych badań wykorzystywała mikroskopię optyczną/świetlną z technikami fluorescencji lub jasnego pola. Jednak w ciągu ostatnich31 lat przeprowadzono badania przy ultrawysokich powiększeniach przy użyciu skaningowego obrazowania twarzy bloku szeregowego elektronów. W niniejszym badaniu po raz pierwszy opracowano zmodyfikowany protokół SBFI i zastosowano go do koralowców. Ponieważ polipy koralowców M. annularis i M. faveolata mają grubość 1-2 mm, żadna z rutynowych technik mikroskopii świetlnej nie byłaby w stanie przeniknąć całej grubości tkanki polipa koralowca. Dlatego mamy protokół przygotowania próbek SBFI zaprojektowany specjalnie dla próbek koralowców. Ponadto zaprojektowaliśmy na zamówienie uchwyt mikroskopu stereoskopowego, który jest napędzany silnikiem, aby poruszać się zarówno w kierunku x, jak i y. Aparatura ta wykonuje obrazy powierzchni bloku próbki, zamiast zbierać skrawki za pomocą zwykłego mikrotomu przed mikroskopem. Wprowadziliśmy również inną nieliniową technikę optycznego mikroskopu dwufotonowego do obrazowania tych samych polipów koralowców na całej grubości tkanek koralowców. W ten sposób przezwycięża się ograniczenia narzucone przez SBFI w zakresie odwapnienia i możliwości zmian w morfologii i objętości tkanek (kurczenie się), które mogą być wywołane przez przygotowanie próbki (odwodnienie) i protokoły przetwarzania. Co więcej, profile emisyjne z koralowców zostały rozdzielone spektralnie w celu zidentyfikowania ich szczytowych emisji i zmian między chromatoforami a fotosyntetycznymi zooksantellami. Wyniki te zostały ocenione w kontekście zastosowanej metody i jej indywidualnych zalet w zakresie czasu akwizycji, czasu analizy i zdolności do rozwiązywania drobnych szczegółów strukturalnych bez naruszania integralności strukturalnej tkanki koralowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Odczynniki, które należy przygotować do seryjnego obrazowania powierzchni koralowców

1. Wosk przed infiltracją

  1. Rozpuść 3,6 g płatków STEARIN w szklanej zlewce. Dobrze wymieszać na gorącej płycie (60-70 °C).
  2. Dodać 400 mg Sudan IV (w celu zminimalizowania fluorescencji tła wosku). Dobrze wymieszaj i poczekaj, aż uzyskasz czerwony, półprzezroczysty roztwór.
  3. Dodaj 96 ml gorącej stopionej parafiny (100%) i dobrze wymieszaj.

1.2) Wosk do zatapiania

  1. Rozpuść 7,2 g płatków STEARIN w szklanej zlewce i dobrze wymieszaj na gorącej płycie (60-70 °C).
  2. Dodać 0,8 g Sudanu IV. Dobrze wymieszaj i poczekaj, aż uzyskasz czerwony, półprzezroczysty roztwór.
  3. Dodaj granulki parafiny (162 g) i mieszaj, aż parafina całkowicie się rozpuści.
  4. Dodać 30 g białego, granulowanego Vybaru i całkowicie rozpuść go w tej samej zlewce; po rozpuszczeniu wymieszaj.
  5. Luźno zamknij szklaną butelkę pokrywką. Umieść szklaną butelkę w piecu konwekcyjnym o temperaturze 60 °C, aby składniki pozostały w stanie płynnym. Przeprowadź wszystkie infiltracje w tym piekarniku.
  6. Podziel całkowitą objętość 200 ml czerwonego wosku na dwie szklane butelki po 100 ml każda. Użyj jednej podwielokrotności do infiltracji, a drugiej do ostatecznego osadzenia.

1.3) Osadzanie tkanek koralowych do obrazowania twarzy za pomocą bloków szeregowych

  1. Polipy koralowców zebrane w terenie (SI Wideo 1) i przechowywane (3-6 miesięcy w temperaturze 4-5 °C w paraformaldehydzie) należy umyć w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (3 x 5 min) i odkamienić, gdy będą gotowe do zobrazowania. Odwapnić polipy w roztworze ExCal przez 24 godziny lub do momentu, gdy polipy będą całkowicie pozbawione CaCO3. Inkubuj kilka odwapnionych polipów koralowych jako pojedynczy blok w serii 25, 50, 75 i 100% etanolu, a następnie 1x substytut ksylenu w celu odwodnienia próbek.
  2. Przetworzone polipy należy umieścić w piekarniku nagrzanym do 65 °C zawierającym 100% substytut ksylenu. Inkubować przez 30 minut dwukrotnie, zmieniając roztwór na świeży. Ustaw polipy w taki sposób, aby górna część polipów była skierowana w dół, a górna powierzchnia była jak najbardziej płaska.
  3. Roztwory substytutu ksylenu ksylenu w proporcjach 2:1, 1:1 i 1:2 oraz wosku do filtracji wstępnej (krok 1.1) należy sporządzić w probówkach Falcon o pojemności 50 ml.
  4. Inkubuj polipy koralowców z tymi trzema rosnącymi stężeniami wosku przed infiltracją, a następnie 3x inkubuj w 100% wosku przed infiltracją przez 30-60 minut za każdym razem.
  5. Uwaga: W zależności od grubości próbek, kroki 1.3.1-1.3.5 mogą być zwiększane w dłuższych okresach czasu.
  6. Przenieść próbki do zatapiania wosku (patrz krok 1.2.6) po 3-krotnej inkubacji w 100% wosku do filtracji wstępnej.
  7. Po 30 minutach usunąć wosk do zatapiania. Zastąp go świeżym woskiem i kontynuuj inkubację przez co najmniej 4 godziny w temperaturze 65 °C.

1.4) Osadzanie w czerwonym wosku

  1. Sfotografuj blok (tacę ze stali nierdzewnej, na której umieszcza się biały wosk i na której umieszcza się próbkę). Jest to konieczne, ponieważ po osadzeniu w wosku lokalizacja próbki stanie się niewidoczna, ponieważ zatapiający się czerwony wosk jest nieprzezroczysty.
  2. Umieść małe krople wosku o wysokiej temperaturze topnienia wokół nowej podgrzanej formy do zatapiania ze stali nierdzewnej i pozwól jej ostygnąć. Wlać niewielką objętość świeżo stopionego wosku do zatapiania z drugiego pojemnika, jak podano w kroku 1.2.6.
  3. Umieść polip koralowy szybko skierowany w dół nad białą kropką wosku, a następnie umieść plastikowy uchwyt na próbkę na tacy ze stali nierdzewnej i wlej więcej wosku do zatapiania, aby wosk dotarł do powierzchni plastikowej formy.
  4. Wyjmij cały zestaw z piekarnika o temperaturze 65 °C i pozwól mu ostygnąć na ławce lub chłodnej powierzchni, aż wosk całkowicie stwardnieje.
  5. Może to potrwać od 6 godzin do dnia lub dwóch. Wysuszony blok umieścić w lodówce o temperaturze 4 °C, chroniony przed światłem, do długotrwałego przechowywania.

1.5) Sekcja w konfiguracji czoła bloku szeregowego

  1. Przyciąć blok i wyciąć odcinki 1 μm za pomocą mikrotomu. Nie zbieraj skrawków, ponieważ staną się one jak proszek. Pamiętaj, że obrazujemy tylko powierzchnię bloku. Próbka pojawia się, gdy biały wosk zaczyna znikać.
  2. Przechwytywanie obrazów gładkiej powierzchni bloku, która zawiera próbkę za każdym razem, gdy sekcja jest usuwana. Kontynuuj, aż polip koralowy zniknie, jak w SI Wideo 2.
  3. Nagrywaj/rejestruj obrazy za pomocą monochromatycznej kamery za pomocą filtra fluorescencyjnego FITC, aby uchwycić autofluorescencję chromatoforów/polipów koralowych. Obraz 3-4 odwapnione rdzenie z każdego gatunku.

2. Obrazowanie koralowców pod mikroskopią fluorescencyjną dwufotonową

  1. Przymocuj rdzenie polipów koralowców, z których każdy zawiera około 10-12 polipów o średnicy około cala, w 4% paraformaldehydu w miejscu zbioru (brzeg morza), gdy tylko zostaną zebrane pod wodą.
  2. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu rozpoczęcia obrazowania. Umyte rdzenie umieszcza się w tym samym roztworze do góry nogami w naczyniu ze szklanym dnem (o grubości 0,17 mm).
  3. Za pomocą lasera dwufotonowego o wzbudzeniu 780 nm zobrazuj 3-4 polipy w dwóch różnych powiększeniach (zoom cyfrowy) za pomocą obiektywu 10X (0,3 NA). Kształt i wysokość polipa koralowca różni się w zależności od próbki (zwykle 1-2 mm), a głębokość obrazowania jest również ograniczona odległością roboczą obiektywu obrazowania.
  4. Użyj trybu skanowania kafelków, aby zebrać około 25-100 (5 x 5 lub 10 x 10 kafelków) obrazów na płaszczyznę ogniskową w xy i 50-100 obrazów przez oś z w odstępach 10 lub 20 μm, co daje w sumie około 5 000-10 000 obrazów/polip koralowy.
  5. Wyobraź sobie trzy do czterech obszarów polipów, aby reprezentować rdzeń i gatunek koralowca. UWAGA: Czas akwizycji obrazu waha się od 2 do 5 godzin/obszar polipa.
  6. Przechowuj wszystkie obrazy w formacie surowych danych na dysku twardym systemu jako LSM 5. Renderuj 3D w oprogramowaniu do analizy i renderowania obrazów 3D.

3. 3D Renderowanie objętości i wizualizacja danych spektralnej fluorescencji SBFI i dwufotonowej fluorescencji spektralnej

.
  1. Przytnij dane 2D, aby zmniejszyć rozmiar pliku, skupiając się na pojedynczym polipie za pomocą narzędzia do przycinania kwadratowego w programie i skompiluj jako pojedynczy plik tiff (zmniejsz rozmiar pliku również poprzez zapisanie pliku w formacie 8-bitowym) w oprogramowaniu do akwizycji.
  2. Otwórz zmontowane pliki danych SBFI (zebranych w kroku 1.5.1) lub ułożonych kafelkowo wielokrotnych stosów z dwóch fotonowych sekcji optycznych (zebranych w kroku 2.1.4) w module programu Imaris Surpass w algorytmie głośności.
  3. Rzutowanie danych SBFI renderowanych w 3D przy użyciu rzutowania cienia. Utwórz tryb izopowierzchni, w którym woksele są progowane w celu utworzenia szyku powierzchni bryłowej (SI Wideo 3).
  4. Wizualizuj projekcje 3D za pomocą algorytmu płaszczyzny tnącej w trybach ortogonalnych xy, xz i yz, aby ujawnić strukturę 3D i kształt koralowców.
  5. Animuj projekcje za pomocą modułu animacji klatek kluczowych w tym samym programie Imaris (SI Videos 3-7).
  6. Generuj pliki wideo z kompresją 5% i generuj klipy filmowe w formacie avi przy użyciu trybów głośności (SI Videos 4 i 6), 3D i Isosurface (SI Videos 5 i 7).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Specjalnie zaprojektowana aparatura SBFI (wyprodukowana specjalnie na potrzeby niniejszego badania; Rysunek 3) opracowano pierwsze szczegółowe cyfrowe mapy wysokościowe 3D (DEM) tekstury i morfologii zewnętrznej powierzchni polipów koralowych M. annularis i M. faveolature (Rysunek 4 i filmy SI 1-2). W ten sposób uzyskano obrazy wcześniej nieopisanych ułożonych w stos płatów tkanki koralowej koncentrycznie promieniujących na zewnątrz od środka każdego po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania raf koralowych są wysoce interdyscyplinarnym przedsięwzięciem badawczym, obejmującym analizę jednoczesnych zjawisk fizycznych, chemicznych i biologicznych zachodzących w środowisku morskim. Badanie złożonych ekosystemów raf koralowych najlepiej zatem przeprowadzić w ramach kontekstowych "potęg dziesięciu" (rys. 10). Ta kompilacja graficzna pokazuje, że ekosystem koralowców obejmuje szeroki zakres wymiarów przestrzennych (10-9 do 10,5 m). Co więcej, ćwiczenie to pokazuje, że ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Donnie Epps, histologowi z Institute for Genomic Biology, University of Illinois Urbana-Champaign (UIUC), za jej kompetentną pomoc techniczną w przygotowaniu próbki i jej sekcji. Praca ta została wsparta grantem badawczym dla B.W. Fouke z Biura Badań Marynarki Wojennej (N00014-00-1-0609). Ponadto C.A.H. Miller otrzymał granty z Wydziału Geologii UIUC Wanless Fellowship, funduszu Leighton Wydziału Geologii UIUC oraz funduszu badań terenowych Wydziału Geologii UIUC Roscoe Jacksona. Interpretacje przedstawione w tym manuskrypcie są interpretacjami autorów i niekoniecznie muszą reprezentować interpretacje instytucji przyznających pomoc. Dziękujemy również Karaibskiemu Laboratorium Badań i Zarządzania Bioróżnorodnością (Carmabi) na Curaçao za wsparcie i współpracę w zbieraniu próbek z biopsji tkanki koralowej. Dziękujemy Claudii Lutz, specjaliście ds. komunikacji medialnej IGB za umiejętną korektę językową.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
tkanki koralowej2,5 cm Biopsja z naturalnego środowiska
Punch Coring DeviceC.S. Osborne and CompanyNo. 149Do kolekcji biopsji koralowców
Paraformaldehydowamikroskopia elektronowa SciencesRT 1570016% wstępnie rozcieńczona
mikroskopia elektronowaHistoclear/Safeclear IIRT 64111-04Nietoksyczna alternatywa dla ksylenu, odwodnienia i deparafinizacji
Ksylen i etanolFisher ScientificOdwadniający
wosk parafinowyRichard Allen Scientific TypH REF 8338Roztwór infiltracyjny
VybarProducentSkładnik czerwonego wosku
StearynaProducentSkładnik czerwonego wosku
Sudan IVFisher ChemicalS667-25Czerwony wosk-nieprzezroczyste tło
Agglutynina z kiełków pszenicy (WGA)Life TechnologiesW32466Do etykietowania  Coral Mucus
ProlongGold Life TechnologiesP36095Anty-blaknięcie Nośnik montażowy
Fluoro DishWorld Precision InstrumentsFD-35-100Do obrazowania dwufotonowego
Silnik XY, sterownik i kontrolerLin Engineering211-13-01R0, R325, R256-ROXY Ruch translacyjny
Gorąca płytaCorningDC-220Topienie całego wosku
Piec konwekcyjnyYamatoDX-600infiltracji i zatapiania
LeicaASP 300Odwodnienie, mikrotom infiltracyjny
LeicaRM2055Noże jednorazowe
Mikroskop stereoskopowyCarl ZeissStereolumar V 121,5x (30 mm WD) Obiektywowy
mikroskop fluorescencyjny z ApoTomeCarl ZeissAxiovert M 200, System ApoTome IObrazowanie cienkiego przekroju polipa: Kamera Zooxanthellae
AxiocamCarl ZeissMRmKamera monochromatyczna 1388x1040 pikseli
Oprogramowanie AxiovisionCarl ZeissWersja 4.8Program do akwizycji obrazów
Widmo lasera dwufotonowegoMaitai eHP, laser pulsacyjny (70 fs)Z modułem DeepSee
Laserowy mikroskop skaningowyCarl ZeissLSM 710 z detektorem spektralnym34-kanałowa detekcja PMT
Zen SoftwareCarl Zeiss2010 lub nowszydo akwizycji obrazów dwufotonowych i spektralnych
Oprogramowanie Imaris SuiteBitplane, Inc.,wersja 7.0 lub nowszaObjętość 3D, Renderowanie powierzchni ISO, Wizualizacja
Szkielet Arch Sciences świec świec Procesor tkanek do

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Climate Change 2013: The Physical Science Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. Stocker, T. F., Qin, D., Plattner, G. -K., Tignor, M., Allen, S. K., Boschung, J., Nauels, A., Xia, Y., Bex, V., Midgley, P. M. , Cambridge University Press. 1535(2013).
  2. Buddemeir, R. W., Kleypas, J. A., Aronson, R. B. Coral Reefs & Global Climate Change: Potential Contributions of Climate Change to Stresses on Coral Reef Ecosystems). 46, Pew Center on Global Climate Change. (2004).
  3. Wilkinson, C. Status of coral reefs of the world. , Australian Institute of Marine Science. Townsville. 1-2 (2004).
  4. Lough, J. M. Climate records from corals. WIREs Clim. Chang. 1, 318-331 (2010).
  5. Harvell, C. D., et al. Tropical Archaea: diversity associated with the surface microlayer of corals. Mar. Ecol. Prog. Ser. 273, 81-88 (2004).
  6. Coral Health and Disease. Rosenberg, E., Loya, Y. , Springer. (2004).
  7. Rohwer, F., Breitbart, M., Jara, J., Azam, F., Knowlton, N. Diversity of bacteria associated with the Caribbean coral Montastrea franksi. Coral Reefs. 20, 85-91 (2001).
  8. Frias-Lopez, J., Zerkle, A. L., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. Partitioning of bacterial communities between seawater and healthy, black band diseased, and dead coral surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2214-2228 (2002).
  9. Stanley, G. D. Jr The evolution of modern corals and their early history. Earth Sci. Rev. 60, 195-225 (2003).
  10. Piggot, A. M., Fouke, B. W., Sivaguru, M., Sanford, R., Gaskins, H. R. Change in zooxanthellae and mucocyte tissue density as an adaptive response to environmental stress by the coral Montastraea annularis. Mar. Biol. 156, 2379-2389 (2009).
  11. Stanley, G. D. Jr Photosymbiosis and the evolution of modern coral reefs. Evolution. 1, 3(2006).
  12. Gordon, B. R., Leggat, W. Symbiodinium—Invertebrate Symbioses and the Role of Metabolomics. Mar. Drugs. 8, 2546-2568 (2010).
  13. Schlichter, D., Weber, W., Fricke, H. W. A chromatophore system in the hermatypic, deep-water coral Leptoseris fragilis (Anthozoa: Hexacorallia). Marine Biology. 89, 143-147 (1994).
  14. Fouke, B. W., Meyers, W. J., Hanson, G. N., Beets, C. J. Chronostratigraphy and dolomitization of the Seroe Domi Formation, Curacao, Netherlands Antilles. Facies. 35, 293-320 (1996).
  15. Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Jin, Q., Fouke, B. W. Cyanobacteria associated with coral black band disease in Caribbean and Indo-Pacific reefs. Appl. Environ. Microbiol. 69, 2409-2413 (2003).
  16. Frias-Lopez, J., Klaus, J., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. The bacterial community associated with black band disease in corals. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5055-5062 (2004).
  17. Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. Identification of differential gene expression in bacteria associated with coral black band disease using RNA-arbitrarily primed PCR. Appl. Environ. Microbiol. 70, 3687-3694 (2004).
  18. Klaus, J. S., Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Heikoop, J. M., Fouke, B. W. Bacterial communities inhabiting the healthy tissues of two Caribbean reef corals: interspecific and spatial variation. Coral Reefs. 24, 129-137 (2005).
  19. Klaus, J., Janse, I., Sandford, R., Fouke, B. W. Coral microbial communities, zooxanthellae, and mucus along gradients of seawater depth and coastal pollution. Environ. Microbiol. 9, 1291-1305 (2007).
  20. van Duyl, F. C. Atlas of the living reefs of Curacao and Bonaire (Netherlands Antilles). , Diss. Vrije Universiteit. Amsterdam. (1985).
  21. Carricart-Ganivet, J. P. Sea surface temperature and the growth of the West Atlantic reef building coral Montastraea annularis. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 302, 249-260 (2004).
  22. Barnes, D. J., Lough, J. M. Coral skeletons: Storage and recovery of environmental information. Global Chang. Biol. 2, 569-582 (1996).
  23. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 6, 069591(2012).
  24. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Imaging heart development using high-resolution episcopic microscopy. Curr. Opin. Genet. Dev. 21, 573-578 (2011).
  25. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC). Cold Spring Harb. Protoc. 6, 069575(2012).
  26. Rosenthal, J., et al. Rapid high resolution three dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture. Birth Defects Res. C: Embryo Today: Rev. 72, 213-223 (2004).
  27. Slyfield, C. R., et al. Three-dimensional surface texture visualization of bone tissue through epifluorescence-based serial block face imaging. J. Microsc. 236, 52-59 (2009).
  28. Weninger, W., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nat. Genet. 30, 59-65 (2001).
  29. Weninger, W., Mohun, T. Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques. Reporter Genes. , Humana Press. 35-46 (2007).
  30. Gerneke, D. A., et al. Surface imaging microscopy using an ultramiller for large volume 3D reconstruction of wax-and resin-embedded tissues. Microsc. Res. Tech. 70, 886-894 (2007).
  31. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329(2004).
  32. Salih, A., Larkum, A., Cox, G., Kühl, M., Hoegh-Guldberg, O. Fluorescent pigments in corals are photoprotective. Nature. 408, 850-853 (2000).
  33. Sivaguru, M., Mander, L., Fried, G., Punyasena, S. W. Capturing the surface texture and shape of pollen: A comparison of microscopy techniques. PloS one. 7 (6), (2012).
  34. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Coral Polyp ImagingSerial Block Face ImagingTwo Photon MicroscopyFluorescence MicroscopyTissue Morphology AnalysisChromatophore DistributionZooxanthellae LocalizationDecalcified Coral TissueWax Embedding TechniqueMicrotome Sectioning

Powiązane artykuły