Artykuł metodologiczny

Połączenie mikrostereolitografii i elektroprzędzenia w celu wytworzenia membran wyposażonych we wnęki do regeneracji rogówki

13.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51826

⸱

12 września 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Materials Science and Engineering, University of Sheffield, 2Department of Chemistry, University of Sheffield, 3L. V. Prasad Eye Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy technikę wytwarzania mikrokieszeni w membranach elektroprzędzonych, w których można badać zachowanie komórek. W szczególności opisujemy połączenie mikrostereolitografii i elektroprzędzenia w celu produkcji urządzeń z biomateriału rogówki PLGA (poli(laktyd-ko-glikolid)) wyposażonych w mikrocechy.

Streszczenie

Problemy z rogówką dotykają milionów ludzi na całym świecie, znacznie obniżając jakość ich życia. Choroba rogówki może być spowodowana chorobami, takimi jak aniridia lub zespół Stevena Johnsona, a także czynnikami zewnętrznymi, takimi jak oparzenia chemiczne lub promieniowanie. Obecne metody leczenia to (i) stosowanie przeszczepów rogówki oraz (ii) stosowanie komórek macierzystych namnażanych w laboratorium i dostarczanych na nośnikach (np. błonie owodniowej); Zabiegi te są stosunkowo skuteczne, ale niestety mogą się nie powieść po 3-5 latach. Istnieje potrzeba zaprojektowania i wyprodukowania nowych urządzeń do biomateriałów rogówkowych, które będą w stanie szczegółowo naśladować środowisko fizjologiczne, w którym komórki macierzyste znajdują się w rogówce. Rąbkowe komórki macierzyste znajdują się w rąbku (okrągłym obszarze między rogówką a twardówką) w określonych niszach znanych jako Palisady Vogta. W ramach tej pracy opracowaliśmy nową technologię platformy, która łączy dwie najnowocześniejsze techniki wytwarzania (mikrostereolitografia i elektroprzędzenie) do wytwarzania błon rogówki, które do pewnego stopnia naśladują rąbek. Nasze błony zawierają sztuczne mikrokieszenie, które mają na celu zapewnienie komórkom ochrony, tak jak robią to Palisady Vogta w oku.

Wprowadzenie

Rogówka, beznaczyniowa centralna zewnętrzna tkanka oka, jest jedną z najważniejszych tkanek zaangażowanych w widzenie1. Istnieje kilka rodzajów komórek, które utrzymują funkcję rogówki. Górna, najbardziej zewnętrzna warstwa rogówki składa się z komórek nabłonka, które mogą mieć grubość około 5-7 warstw2. Warstwa ta zapobiega inwazji bakterii do rogówki3 i umożliwia wnikanie tlenu4. Doniesiono, że komórki macierzyste nabłonka rogówki leżą w niszach lub kryptach (o rozmiarach 120-150 μm) w obwodowym obszarze rogówki znanym jako rąbek5,6. Gdy komórki macierzyste dzielą się, komórki potomne, znane również jako przejściowe komórki amplifikujące, wychodzą z nisz, a gdy podział trwa, komórki poruszają się dośrodkowo do wewnątrz i w górę, powodując końcowe różnicowanie komórek w centralnym obszarze rogówki7,8. Komórki te są rutynowo usuwane w mgnieniu oka, odsłaniając nowsze komórki pod spodem9.

Oprócz tego, że jest miejscem lokalizacji komórek macierzystych nabłonka, rąbek odgrywa również rolę w utrzymywaniu unaczynionej spojówki z dala od obszaru rogówki10. Uszkodzenie rąbka może być spowodowane oparzeniami termicznymi/chemicznymi, promieniowaniem, a także chorobami genetycznymi10. Kiedy tak się dzieje, bariera rąbka zostaje przerwana, umożliwiając komórkom spojówki przemieszczenie się na rogówkę, unaczyniając obszar, powodując w niektórych przypadkach ból i ślepotę. Stan ten jest znany jako niedobór rąbkowych komórek macierzystych (LSCD)10.

Różne naturalne substraty zostały zgłoszone jako możliwe nośniki komórek macierzystych wspomagających regenerację rogówki. Na przykład błony oparte na kolagenie zostały użyte przez Dravida i wsp. 11 oraz Rama i współpracownicy12 zgłosili stosowanie fibryny w badaniu z udziałem 112 pacjentów. Obecnie jednak najczęściej stosowaną metodą leczenia jest wykorzystanie ludzkiej błony owodniowej z banku tkanek i hodowla komórek nabłonka rąbka na jej powierzchni13,14. Po utworzeniu monowarstwy błona owodniowa jest przyklejana komórką do uszkodzonej rogówki, z której wszystkie komórki spojówkowe i tkanka bliznowata są chirurgicznie usuwane przed przeszczepem komórek14. Błona owodniowa ulega degradacji w ciągu kilku tygodni do miesięcy, pozostawiając komórki nabłonkowe przyczepione do ogołoconego obszaru w celu regeneracji nabłonka15,16. Technika ta okazała się skuteczna w przywracaniu wzroku, jednak nadal istnieje kilka praktycznych problemów, które ograniczają jej powszechne zastosowanie kliniczne. Ponieważ błona owodniowa jest tkanką ludzką, przed użyciem do przeszczepu komórek u pacjentów musi przejść badania przesiewowe przy użyciu dobrych procedur bankowania tkanek. Takie badania przesiewowe jedynie obniżają ryzyko przenoszenia chorób, ale nie mogą go całkowicie wyeliminować17. Oprócz tego pojawiły się doniesienia o zmienności w działaniu błony owodniowej spowodowanej zmiennością między dawcami18,19 i różnymi metodami przetwarzania19,20. Wraz z niewielkim ryzykiem przeniesienia choroby istnieje wymóg, aby ośrodki chirurgiczne miały dostęp do dobrze prowadzonych banków tkanek, które nie są dostępne dla wszystkich.

Chociaż błona owodniowa jest względnie skuteczna, istnieje potrzeba opracowania nowych syntetycznych biodegradowalnych nośników komórkowych do leczenia chorób rogówki. Syntetyczne nośniki pozwoliłyby uniknąć konieczności przeprowadzania procedur bankowych, a także wyeliminowałyby niewielkie ryzyko przenoszenia chorób i zmienności między dawcami. W tym sensie badano materiały takie jak glikol polietylenowy21,22 i PLGA23,24.

Opracowując syntetyczną alternatywę dla ludzkiej błony owodniowej, istnieje również możliwość zaprojektowania w niej pożądanych cech, które mają nadzieję pomóc przetrwać hodowanym komórkom. Włączenie mikrocech do urządzeń biomateriałowych w celu specyficznej kontroli zachowania komórek jest nowym obszarem zainteresowania. Wielu autorów donosiło o pracach nad rozwojem nisz sztucznych komórek macierzystych25-30. Grupa ta poinformowała niedawno o stworzeniu mikrofabrykowanego, biofunkcjonalizowanego sztucznego rąbka ramienia PEGDA do dostarczania komórek nabłonka rąbka22 oraz metodologii wytwarzania elektroprzędzonych biodegradowalnych membran zawierających mikrofabrykowane kieszenie do podtrzymywania komórek nabłonka rąbka31.

Celem tej pracy jest opracowanie nowej technologii produkcji urządzeń z biomateriałów zawierających mikrocechy, które do pewnego stopnia naśladują mikrośrodowiska, w których komórki macierzyste znajdują się w ciele. Opracowaliśmy technikę łączącą mikrostereolitografię i elektroprzędzenie, która pozwala na wytwarzanie biodegradowalnych membran mikrostrukturalnych, które wykazują duży potencjał w zastosowaniach związanych z regeneracją tkanek.

Ważne jest, aby zauważyć, że chociaż w tej pracy technika ta została zastosowana do produkcji pierścieni do regeneracji rogówki, technologia ta może być zastosowana do produkcji urządzeń do regeneracji szerokiego zakresu tkanek nabłonkowych, np. skóry, błony śluzowej jamy ustnej, jelit, dróg oddechowych i nabłonka pęcherza moczowego. W szczególności w tym badaniu opracowaliśmy syntetyczną biodegradowalną membranę, która działa w podobny sposób jak błona owodniowa, dostarczając komórki do rogówki. Błona ta zawiera mikrokieszenie o wielkości około 300 μm (większe niż krypty rąbkowe Palisades Vogta (około 150 μm)). Na koniec opracowaliśmy protokół pakowania, który pozwala na przechowywanie tych membran w temperaturze -20 °C przez ponad 6 miesięcy bez żadnych oznak rozpadu.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Oczy użyte w tym badaniu zostały użyte zgodnie z Deklaracją Otwartości na Badania na Zwierzętach:

1. Produkcja biodegradowalnych membran PLGA wyposażonych w mikrokieszenie

  1. Rusztowania pierścieniowe powstały w wyniku połączenia technik mikrostereolitografii i elektroprzędzenia31. Zasadniczo proces ten można podsumować w 2 częściach: (i) tworzenie szablonów PEGDA za pomocą mikrostereolitografii oraz (ii) elektroprzędzenie na szablonach w celu odtworzenia leżącej pod spodem struktury PEGDA (w tym przypadku mikrofabrykowanego pierścienia). Te dwa kroki zostały szczegółowo opisane poniżej (rysunki 1 i 2).
    1. Wytwarzanie szablonów PEGDA metodą mikrostereolitografii (microSL)
      1. Wykonaj pierścienie przy użyciu modelu 2-warstwowego, przy czym pierwsza warstwa (L1) stanowi podstawę konstrukcji, a druga warstwa (L2) przedstawia 6 mikrokieszeni o morfologii podkowy w zakresie rozmiarów od 300-500 μm. Wytwarzanie pierścieni PEGDA zostało niedawno opisane przez tę grupę22.
        1. Utwórz L1, rysując czarne koło o średnicy 1,2 cm za pomocą dowolnego odpowiedniego programu do rysowania.
        2. Utwórz L2 w ten sam sposób, ale dołącz 8 białych struktur w kształcie podkowy o wymiarach 0,5 x 0,35 mm. Rozmieść małe białe kształty podkowy w strukturze czarnego koła.
        3. Zapisz L1 i L2 w formacie JPEG.
      2. W fiolce z ciemnego szkła wymieszać diakrylan glikolu polietylenowego (PEGDA, Mn = 250 g/mol) z 1% w/w kamforchinonu, fotoinicjatorem, na mieszadle magnetycznym przez 20 minut.
      3. Rozszerz wiązkę laserową zestawu do mikrostereolitografii za pomocą teleskopowego układu soczewek, a następnie wyświetl ją na programowalnym komputerowo cyfrowym urządzeniu wielozwierciadlanym (zestaw startowy DMD z obsługą UV). UWAGA: DMD odbija obraz (w tym przypadku pierścień) na lustro przez soczewkę tubusu o ogniskowej 10 cm. Obraz jest następnie kierowany przez pokryte srebrem lustro do fiolki zawierającej polimer utwardzalny (PEGDA).
      4. Wyreguluj i ostrożnie wyczyść optykę zestawu mikrostereolitografii.
      5. Umieścić 300 μl mieszaniny PEGDA w studzience na 12-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. Upewnij się, że studzienki są wstępnie pokryte teflonem lub innym materiałem nieprzywierającym, aby ułatwić usunięcie struktury po utwardzeniu.
      6. Włącz niebieski laser (MBL-III 473 nm; 150 mW) i wgraj L1 do oprogramowania ALP3-basic zainstalowanego wcześniej na komputerze. Naświetlić pierwszą warstwę przez 60 sekund. UWAGA: ALP3-basic to interfejs USB, który zapewnia połączenie między komputerem a cyfrowym urządzeniem mikrolustrowym.
      7. Dodać do studzienki 250 μl więcej PEGDA, wgrać L2 jak opisano powyżej i napromieniować L2 przez 60 sekund.
      8. Usuń nieutwardzony polimer i umyj pierścień izopropanolem O/N.
    2. Wytwarzanie biodegradowalnych membran PLGA metodą elektroprzędzenia
      UWAGA: Pierścienie PEGDA zostały użyte jako szablony, nad którymi PLGA został elektroprzędzony, przy czym PLGA odtwarzała leżącą poniżej topografię, gdy jest obracana nad tymi szablonami. Po zawirowaniu arkusz polimeru PLGA został oderwany od kolektora. Ostateczna membrana PLGA nie zawierała pierścieni PEGDA, które pozostały przymocowane do metalowego kolektora.
      1. Rozłóż pierścienie PEGDA na galwanizowanej blasze aluminiowej (12 cm x 20 cm) w celu stworzenia statycznego kolektora elektroprzędzalnego.
      2. Przymocuj pierścienie za pomocą przewodzącej taśmy węglowej. UWAGA: Te pierścienie po uformowaniu mogą być ponownie wykorzystane jako szablony do elektroprzędzenia.
      3. Przygotuj roztwór polimeru do wirowania. Rozpuścić PLGA (50/50 DL-laktyd (52 mol%): glikolid (48 mol%), 44 kg/mol) w dichlorometanie (DCM) w stężeniu 20% m/w.
      4. Wymieszaj O/N przed użyciem.
      5. Umieścić 4 strzykawki insulinowe (tępo zakończone, igły o średnicy wewnętrznej 0,8 cm) na pompie strzykawkowej. UWAGA: Cztery strzykawki zapewniały szybsze elektrowirowanie niż praca z pojedynczą strzykawką.
      6. Do każdej strzykawki wsypać 2,5 ml roztworu PLGA.
      7. Elektrowirowanie przy natężeniu przepływu 30 μl/min i napięciach w zakresie od 12 do 15 kV. Pozostaw odległość między igłami a kolektorem 15 cm.
      8. Elektrowirowanie przez 1 godzinę i 30 minut, a na koniec ostrożne oderwanie elektroprzędzonego arkusza PLGA od kolektora podtrzymującego pierścienie PEGDA.
      9. Pokrój rusztowania elektroprzędzone na okręgi o średnicy 22 mm za pomocą okrągłego dziurkacza i pozostawiając strukturę pierścienia umieszczoną pośrodku.

2. Długoterminowe przechowywanie mikrofabrykowanych membran PLGA

Uwaga: Pierścienie PLGA zostały wyprodukowane i wysterylizowane przez akredytowane firmy zewnętrzne; próbki były napromieniane zewnętrznym zakresem dawek 25-40 KGy.

  1. Zamontuj membranę w małym pojemniku (plastikowa szalka Petriego) i umieść ją w torbie medycznej.
  2. Użyj bibuły filtracyjnej, aby stworzyć małe worki filtracyjne do osuszaczy. Aby utworzyć worki, złóż bibułę filtracyjną (średnica 125 mm) i przetnij powstałe półkole na pół; Następnie uszczelnij końce razem za pomocą taśmy.
    1. Napełnij trzy worki z bibuły filtracyjnej odpowiednio 1 g pomarańczy krzemionkowej, chlorku kobaltu (II) i siarczanu miedzi (II).
    2. Umieść trzy worki ze środkiem osuszającym w torbie medycznej wraz z elektroprzędzoną membraną.
  3. Dodaj do torby dostępną w handlu sześciopunktową kartę wskaźnika wilgotności, aby wykryć nagromadzenie wilgoci w okresie przechowywania.
  4. Użyj próżniowej zgrzewarki do odkurzania i zamykania worka.
  5. Wyślij membrany pierścieniowe do firmy zewnętrznej w celu napromieniowania γ.
  6. Napromieniowane γ membrany PLGA należy przechowywać w szerokim zakresie temperatur od -20 °C do +37 °C w wilgotnym środowisku w inkubatorze zawierającym 5%CO2.
  7. Po przechowywaniu sprawdź wskaźnik wilgotności, aby potwierdzić, że poziom wilgotności jest poniżej 30%.
  8. Użyj skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM), aby ocenić integralność włókien.

3. Izolacja eksplantatów rąbka

Eksplantaty rąbkowe królika zostały wyizolowane z oczu królika (uzyskane z gospodarstwa, gdzie króliki są hodowane do konsumpcji).

  1. Zdezynfekuj oczy królika za pomocą roztworu antyseptycznego (3%).
  2. Oczyść oczy, usuwając nadmiar tkanki otaczającej rogówkę.
  3. Oddziel obszar rąbka (zidentyfikowany jako cienki okrągły obszar między rogówką (przezroczysty) a twardówką (biały)) od reszty rogówki za pomocą mikroskopu preparacyjnego.
  4. Pokrój na segmenty (o długości około 1,5 cm) pod mikroskopem preparacyjnym.
  5. Zdezynfekuj segmenty rąbka w 1,5% roztworze antyseptycznym przez 1 min.
  6. Pokrój segmenty rąbka na małe kawałki (100-500 μm) za pomocą ostrza skalpela.
  7. Przechowywać małe kawałki tkanki w pożywce hodowlanej (DMEM+Glutamax: Ham's F12 (1:1), 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1 U/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny, 2,5 μg/ml amfoterycyny, 10 ng/ml EGF i 5 μg/ml insuliny) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do czasu użycia (nie więcej niż 60 min).

4. Wyrostek komórek z eksplantatów rąbka

Eksplantaty rąbkowe królików zostały umieszczone zarówno na świeżo wytworzonych mikrofabrykowanych membranach, jak i na membranach, które były pakowane próżniowo i przechowywane przez 6 miesięcy w temperaturze -20 °C.

  1. Powlekaj rusztowania pierścieniowe 15 μl kleju fibrynowego (mieszanina fibrynogenu z ludzkiego osocza w stosunku 1:1 o stężeniu 18,75 mg/ml i trombiny z osocza ludzkiego o stężeniu 2,5 U/ml) za pomocą skrobaka do komórek w celu równomiernego rozprowadzenia fibryny.
  2. Umieść eksplantaty tkanek bezpośrednio na mikrokieszeniach PLGA za pomocą igły 25 G i mikroskopu preparacyjnego.
  3. Dodaj pożywkę do hodowli komórkowych bardzo delikatnie, aby uniknąć oderwania eksplantatów.
    1. Zmieniać pożywkę co 3 dni (receptura pożywki opisana w sekcji 3.7) i przechowywać w kulturze przez 2 tygodnie w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5%CO2.
  4. Utrwal próbki 3,7% buforowanym formaldehydem przez 10 minut, a następnie wykonaj 3 płukania PBS.
  5. Wybarwieć przeciwstawnie przez inkubację w 1 μg/ml 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) lub jodku propidyny (PI) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Umyć 3 razy w PBS i przechowywać próbki przykryte folią.
  7. Zobrazuj próbki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego o długości fali 543 nm i 800 nm (dwufotonowe).

5. Ustawianie modeli 3D rogówki zranionej przez królika

  1. Oczyść i zdezynfekuj oczy królika zgodnie z powyższym opisem.
  2. Owiń oczy królika, zanurzając je w 0,14% wodorotlenku amonu na 5 minut.
  3. Przepłukać oczy w PBS i zeskrobać nabłonek nożem do sklerotomów.
  4. Wytnij i odizoluj guzik rogówkowo-twardówkowy, usuwając pozostałą tkankę.
  5. Umieść nabłonek rogówki stroną do dołu na sterylnym kubku i napełnij 0,5% agarem wyprodukowanym w DMEM.
  6. Po ustawieniu umieść nabłonek rogówki stroną do góry, na małych szalkach Petriego i dodaj pożywkę hodowlaną (przepis opisany powyżej) do obszaru rąbka. UWAGA: Nie zakrywaj całej rogówki; Utrzymuj hodowlę narządów na granicy faz powietrze-ciecz.

6. Izolacja eksplantatów rąbków i włączenie rusztowań pierścieniowych do modeli 3D rogówki królika

  1. Pokryj błony pierścieniowe 15 μl kleju fibrynowego (mieszanina fibrynogenu w stosunku 1:1 o stężeniu 18,75 mg/ml i trombiny o stężeniu 2,5 U/ml). Użyj skrobaka do komórek, jak opisano powyżej.
  2. Umieść eksplantaty tkanek bezpośrednio na mikrokieszeniach PLGA za pomocą igły 25 G i mikroskopu preparacyjnego.
  3. Umieść pierścienie z eksplantatami tkanek na ogołoconych rogówkach eksplantatami skierowanymi do góry i w warunkach granicy powietrze-ciecz. (Warunki te zostały już wcześniej opisane22).
  4. Modele hodowli narządów należy utrzymywać przez 4 tygodnie w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , zmieniając pożywkę co 2 dni.

7. Ocena regeneracji rogówki i utrzymania komórek macierzystych

  1. Po 4 tygodniach utrwal rogówki za pomocą 3,7% formaldehydu.
  2. Przetwórz rogówki do konwencjonalnej histologii, aby wytworzyć skrawki parafiny o wielkości 6 μm.
  3. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E).
  4. W przypadku immunocytochemii odparafinuj skrawki ksylenem (3 min) i ponownie uwodnij w 100% etanolu (1 min), 70% etanolu (1 min) i wodzie destylowanej (2 min).
  5. Wytycz sekcje za pomocą wstrzykiwacza Dako, aby wyznaczyć małe obszary i uniknąć nadmiernego stosowania przeciwciał.
    1. Traktuj wyznaczone obszary 0,05% trypsyną (100 μl) przez 20 minut (37 °C).
  6. Dokładnie umyj PBS i dodaj 100 μl 10% koziej surowicy (blokującej) na 1 godzinę.
  7. Próbki inkubować ze 100 μl mysiego przeciwciała monoklonalnego cytokeratyny 3 (CK3) i 100 μl p63 w 1% surowicy koziej O/N w temperaturze 4 °C.
  8. Przemyć PBS i potraktować 100 μl biotynylowanego drugorzędowego przeciwciała przeciw mysim (1:1,000 w 1% surowicy koziej) przez 1 godzinę w temperaturze RT.
  9. Dodaj 100 μl FITC-streptawidyny (1:100 w 1% koziej surowicy) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  10. Potraktuj próbki DAPI zgodnie z powyższym opisem.
  11. Zobrazuj próbki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego o długości fali 800 nm (dwufotonowej) i 488 nm.

Wyniki

Mikrofabrykowane pierścienie elektroprzędzone zostały wykonane przy użyciu kombinacji mikrostereolitografii i elektroprzędzenia (Rycina 1 i 2). Pierścienie z PEGDA o różnych rozmiarach zostały wytworzone metodą mikrostereolitografii (Rycina 3); technika ta umożliwia wytwarzanie struktur rzędu cm przy jednoczesnym włączaniu mikroelementów. W tym przypadku wykonano pierścienie o średnicach od 1,2-1,6 cm zawierające mikrokieszonki o rozmiarach 350-500 µm (Rycina 4).

W zakresie produkcji, sterylizacji i pakowania materiałów do przyszłego zastosowania klinicznego stwierdzono, że pakowanie próżniowe w workach klasy medycznej znacząco poprawiło możliwość długoterminowego przechowywania membran PLGA (Rycina 5); zastosowanie worka klasy medycznej (PET/folia/LDPE) o grubości 0,12 mm pozwoliło na uzyskanie dłuższego okresu przydatności do użycia. Zostało to zbadane poprzez wysłanie membran do naszych współpracowników w Indiach, gdzie membrany były przechowywane przez okres kilku miesięcy w temperaturze -20 °C, w RT oraz w 37 °C w celowo zawilgoconych warunkach (wilgotna inkubator). Rycina 5 pokazuje, że w celowo prowokacyjnych warunkach przechowywania w 37 °C w warunkach wilgotnych, membrany były stabilne tylko przez około 1 miesiąc w przypadku braku pakowania próżniowego, natomiast osiągnięto 3 miesiące przechowywania w warunkach pakowania próżniowego (Rycina 5 i Tabela 1).

Tabela 1 wykazuje poprawę warunków przechowywania, jaką można osiągnąć nawet w warunkach dobranych tak, aby sprzyjały one pobieraniu wody i pęcznieniu włókien, jeśli zwróci się uwagę na wybór zastosowanej torby.

Pierścienie wspierały rozrost komórek z eksplantatów limbalnych w różnych warunkach: (i) pierścienie świeżo przygotowane i (ii) pierścienie przechowywane przez 6 miesięcy (Rysunek 6). Transfer komórek osiągnięto po 4 tygodniach, umieszczając membrany PLGA na trójwymiarowych modelach z ranami. Komórki rozrosły się z eksplantatów tkankowych umieszczonych na membranach, tworząc nowy nabłonek na uprzednio pozbawionych nabłonka rogówkach (Rysunek 7). Kontrole pozytywne (rogówki bez żadnej obróbki) i negatywne (rogówki z ranami) były również utrzymywane w kulturze przez ten sam okres czasu. Kontrole negatywne potwierdziły brak tworzenia nowego nabłonka w przypadku braku dodanych komórek. Immunocytochemia wykazała, że komórki rozrastające się z eksplantatów były komórkami nabłonka rogówki, ponieważ wykazano ich pozytywność w kierunku markera różnicowania rogówki CK3 (Rysunek 7E).

Schemat układu stereolitografii z laserem, ekspanderem wiązki i DMD do druku 3D z użyciem polimerów PEGDA.
Rysunek 1. Schemat układu mikrostereolitografii do tworzenia pierścieni z PEGDA.

Schemat elektroprzędzenia: układ wysokiego napięcia, włókna PEGDA, roztwór PLGA, aluminium pokryte elektrodą.
Rycina 2. Schemat procesu elektroprzędzenia z wykorzystaniem mikrowytworzonych pierścieni PEGDA jako matryc.

Metoda wycinania i przenoszenia filmu złota o różnych średnicach; schemat eksperymentalny i wyniki.
Rycina 3. (A) przedstawia przykład statycznego kolektora (galwanicznie naniesiona warstwa aluminium z pierścieniami z PEGDA) do przędzenia mikrofabrykowanych membran z PLGA. (B) oraz (E) pokazują odrywanie różnych mat elektroprzędzionych ze statycznych kolektorów. (C) przedstawia matryce z PEGDA o różnych rozmiarach, podkreślając wszechstronność zastosowania mikrostereolitografii do wytwarzania powierzchni bazowej. (D) pokazuje mikrofabrykowaną replikę z PLGA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat procesu elektroprzędzenia: obrazy SEM, matryca PEGDA, replika PLGA, analiza morfologii włókien.
Rycina 4. Obraz SEM pierścienia PEGDA z mikroelementem w kształcie podkowy (A); obraz SEM z dużym powiększeniem mikrofabrykowanej kieszonki (B). Obraz w kontraście fazowym pierścienia PLGA z mikroelementem w kształcie podkowy (C); obraz w kontraście fazowym z dużym powiększeniem mikrofabrykowanej kieszonki (D). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Mikrofabrykowane membrany pierścieniowe z PLGA; intensywność włókien w zależności od temp./wieku; SEM włókien; próbki kolorystyczne.
Rysunek 5. Wpływ temperatury i czasu na przechowywanie membran z PLGA (50/50) (44 kg/mol) z mikrofabrykowanymi pierścieniami, pakowanych próżniowo i bezz próżniowo, w ciągu 6 miesięcy. Integralność membrany oceniano jako włókna całkowicie nienaruszone (+++), częściowe pęcznienie włókien (++), zlewanie się włókien (+) lub brak nienaruszonych włókien (-). Obrazy SEM oraz trzy osuszacze (pomarańczowa krzemionka, chlorek kobaltu (II) i siarczan miedzi (II)) nie wykazują zmian w integralności włókien ani wilgotności. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Równowaga statyczna w inżynierii tkankowej; obrazy mikroskopowe oddziaływania eksplantu z rusztowaniem, 300 μm, 150 μm.
Rycina 6. Obrazy fluorescencyjne przedstawiające przerost LEC z eksplantów limbalnych na świeżo wykonanych biodegradowalnych pierścieniach z PLGA (A, B) oraz na pierścieniach po 6 miesiącach przechowywania w temperaturze -20 °C (C, D). Obrazy (A) i (B) odpowiadają komórkom barwionym odpowiednio DAPI (niebieski) i jodkiem propidyny (czerwony). Obraz b to widok ortogonalny z konfokalnego stosu z-stack eksplantu umieszczonego w mikrofabrykowanej kieszeni. Obrazy (C) i (D) wykazują pozytywne barwienie na p63 (zielony). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Trójwymiarowy model uszkodzonej rogówki w szalce Petriego oraz obrazy mikroskopowe przedstawiające wyniki eksplantacji, tkanka rogówki.
Rycina 7. (A) przedstawia model uszkodzonej rogówki królika z pierścieniowym rusztowaniem i eksplantami tkanki umieszczonymi na rusztowaniu, które zostało wcześniej pokryte klejem fibrynowym. (B) i (C) to kontrole pozytywna i negatywna; kontrola pozytywna to świeża rogówka królika, a kontrola negatywna to rogówka, z której celowo usunięto nabłonek (kontrola negatywna była również hodowana przez 4 tygodnie). (D) to obraz barwienia H&E rogówki wytworzonej metodami inżynierii tkankowej po 4 tygodniach hodowli; rycina pokazuje nowy wielowarstwowy nabłonek utworzony przez komórki migrujące z eksplantów umieszczonych w niszach. (E) to obraz immunocytochemiczny przedstawiający rozrost komórek z eksplantu limbalnego; jądra są barwione DAPI (niebieski), a komórki wykazują pozytywne barwienie na cytokeratynę 3, marker różnicowania rogówki (zielony). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

PLGA (50/50)Integralność włókien dla membran przechowywanych w 37 °C wilgotny
Dzień 0Miesiąc 1Miesiąc 2Miesiąc 3Miesiąc 4Miesiąc 5Miesiąc 6
Niepakowane próżniowo+++------
Próżniowo zamknięte (Worek A) (kompozyt PE, PA) Grubość: 0,14 mm++++-----
Próżniowo zapakowane (Worek B) (PET / folia / LDPE) Grubość: 0,75 mm++++++++++---

Tabela 1. Wpływ próżni i różnych worków do przechowywania na integralność membran z PLGA (50/50) (44 kg/mol) badanych w ciągu 6 miesięcy przechowywania. Integralność membran oceniano jako włókna w pełni nienaruszone (+++), częściowe pęcznienie włókien (++), łączenie się włókien (+) lub brak nienaruszonych włókien (-).

Dyskusja

W badaniu tym opisano (a) technikę wytwarzania elektroprzędzonych membran zawierających w sobie mikrocechy oraz (b) sposób przygotowania takich membran do użytku klinicznego poprzez pakowanie próżniowe, promieniowanie gamma, a następnie przechowywanie przed użyciem. W tym konkretnym zastosowaniu opracowaliśmy membrany PLGA zawierające mikrokieszenie, które naśladują cechy fizyczne nisz rąbków komórek macierzystych. Celem tego badania jest (i) opisanie metod dostarczania czytelnikom wiedzy potrzebnej do projektowania i wytwarzania rusztowań zawierających mikrocechy do badań nad wkładem nisz komórek macierzystych w regenerację tkanek oraz (ii) zapewnienie czytelnikowi lepszego zrozumienia, jak przechowywać rusztowania elektroprzędzone przez długi czas.

Z punktu widzenia zastosowań klinicznych przechowywanie błon pierścieniowych ma ogromne znaczenie. W tej pracy degradacja pierścienia była badana przez okres 6 miesięcy. Degradacja membran jest napędzana przez hydrolizę, więc po prostu utrzymując membrany wolne od wilgoci, proces ten zostaje zatrzymany. Blackwood i wsp. stwierdzili, że zmieniając stosunek PLA do PGA, degradacja błony zmienia się32. Badanie to wykazało również, że zwiększając ilość PGA, szybkość degradacji membran elektroprzędzonych wzrosła in vivo22. Tutaj wykazano, że przy pakowaniu próżniowym membran wraz z odrobiną środka osuszającego i napromienianiu ich oraz przechowywaniu w niskich temperaturach przez 6 miesięcy, nie ma zmian w integralności i degradacji włókien. W chwili obecnej 6 miesięcy to tyle, ile badaliśmy z tymi membranami zawierającymi mikrokieszenie, ale dane dotyczące przechowywania przez 1 rok zostały zgłoszone na zwykłych membranach elektroprzędzonych w temperaturze -20 °C22 i mamy teraz niepublikowane dane dotyczące ich przechowywania w temperaturze -20 °C przez 2 lata bez żadnych oznak degradacji. W związku z tym w przypadku długotrwałego przechowywania zaleca się przechowywanie ich w suchym miejscu w temperaturze -20 °C, ale możliwe jest przechowywanie ich w temperaturze pokojowej nawet w Indiach przez co najmniej 6 miesięcy (być może znacznie dłużej). Włączenie wskaźnika wilgotności umożliwia łatwe sprawdzenie, czy opakowanie utrzymuje membrany w stanie suchym, w którym to przypadku będą one odpowiednie do tego celu.

Transfer komórek z tych pierścieni do modeli rogówki 3D wykazano podczas umieszczania eksplantatów rąbka rogówki w mikrokieszeniach. Grupa ta poinformowała niedawno o przeniesieniu komórek do modelu rogówki królika in vitro poprzez umieszczenie eksplantatów na zwykłych błonach PLGA (błonach bez struktur pierścieniowych)24. Korzystając z obecnych mikrofabrykowanych rusztowań, transfer komórek został posunięty o krok dalej, ponieważ możemy teraz konkretnie zlokalizować eksplantaty tkanek w mikrostrukturach. Możliwość umieszczenia eksplantatów bezpośrednio w niszach pozwala również chirurgowi na użycie membran bezpośrednio na sali operacyjnej, unikając konieczności korzystania z pomieszczenia czystego w celu uprzedniego namnażania rąbkowych komórek macierzystych. Chociaż ta praca koncentruje się na rozwoju urządzeń do chorób rogówki, ta technologia mikrowytwarzania może być również stosowana do opracowywania urządzeń do wielu innych zastosowań. Przyszłe prace będą dotyczyły wytwarzania konstruktów do regeneracji innych tkanek, takich jak skóra i kości.

Podczas gdy projektowanie i wstępne wytwarzanie mikrostruktur PEGDA może być czasochłonne, po wyprodukowaniu struktury mogą być wielokrotnie wykorzystywane bez degradacji. W związku z tym późniejsze wytwarzanie mikrostrukturalnych biodegradowalnych membran PLGA metodą elektroprzędzenia może być przeprowadzane z szybkością porównywalną do produkcji zwykłych ("niestrukturalnych") membran po montażu kolektora. Chociaż w tej pracy wykorzystaliśmy mikrostereolitografię do wytwarzania form, można również zastosować inne metody wytwarzania, takie jak druk 3D lub formowanie wtryskowe. W związku z tym leżąca pod spodem forma może być wykonana z innych polimerów lub metali zamiast PEGDA. W związku z tym technika ta jest bardzo wszechstronna, a naukowcy mogą łatwo dostosować ją do własnych potrzeb i obiektów.

Własny zestaw do mikrostereolitografii zastosowany w tym badaniu nie pozwoli na przygotowanie konstruktów o cechach poniżej 30 μm; Nie jest to ograniczenie dla opisanej tutaj aplikacji rogówki, ale może mieć kluczowe znaczenie w projektowaniu innych modeli. W takim przypadku inne techniki, takie jak polimeryzacja 2-fotonowa (2PP), mogą być interesujące, jednak technika elektroprzędzenia może nie pozwalać na odtworzenie struktur w skali submikronowej (jest to obecnie badane przez naszą grupę).

Kluczowymi etapami procesu produkcyjnego są: (i) Unikanie nadmiernego utwardzania matryc PEGDA, które można kontrolować, dostosowując czas i ilość fotoinicjatora. (ii) Kontrolowanie warunków elektroprzędzenia, takich jak temperatura i wilgotność. (iii) Odpowiednie przechowywanie elektroprzędzonych membran pierścieniowych przy użyciu pakowania próżniowego i środków osuszających.

Podsumowując, umieszczając eksplantaty tkanki rąbka w mikrocechach błony, wykazaliśmy wyrost komórek z eksplantatów na obszarach niszy, transfer komórek na zranioną rogówkę królika, a następnie ponowną epitelizację rogówki. Zbadano również degradację membran przechowywanych w różnych temperaturach i opracowano protokół pakowania, który umożliwia długotrwałe przechowywanie membran, przy czym ten ostatni jest niezbędny do opracowania membran do użytku klinicznego.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Z wdzięcznością dziękujemy za fundusze od Wellcome Trust Affordable Healthcare for India oraz stypendium EPSRC Landscape Fellowship dla Ilidy Ortegi, a także za datki od The Electrospinning Company Ltd.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas poli(mlekowy-co-glikolowy)PuracPDLG5004
DichlorometanSigma Aldrich Or Fisher270997 Or Or / 1850/17>99,8% zawiera 50-150 ppm stabilizatora amylenu
Cyfrowe urządzenie do mikrolustra (DMD) Płyta kontrolera Discovery 1100 i Zestaw startowyTexas Instruments1076N732 (UV)
473 nm Laserlaserowy 2000MBL-III150 mW
Diakrylan poli(glikolu etylenowego)Sigma Aldrich475629Mn = 250 g/mol, 500 ml
DEMEM + GlutamaxFisher12077549
Szynka' s F12Labtech biosuraLMH1236/500
Surowica bydlęcaLabtech biosuraFB-1090/50
EGFR& D236-EG-200
Insulina Sigma Aldrich91077C-1G
AmfoterycynaSigma AldrichA2942-100ml
Penicylina/streptomycynaSigmaAldrich P0781-100ml
DAPISigma Aldrich32670
Jodek propidynySigma AldrichP4864
TrombinaSigma AldrichT9326
FibrinogenSigma AldrichF3879
p63Sigma AldrichP3737
CK3Merck MilliporeCLB218
HematoxylinSLSHHS16-500ML
EozynaSigma AldrichHT110232-1L
Torba klasy medycznej (PET / Folia / LDPE) Zrywalna torebkaRiverside Medical Ltd. Derby, Wielka BrytaniaLaminat foliowy PET/Folia/LDPE, (12,7,50)
Napromienianie gamma (sterylizacja)Stosowane technologie sterylizacji (Synergy Health Laboratory Services (SHLS), Abergavenny, UK) - zakres dawek zewnętrznych 25-40 KGy
Żel krzemionkowy pomarańczowySigma Aldrich10087
Chlorek kobaltu (II)Sigma Aldrich232696
Siarczan miedzi (II)Sigma-AldrichC-1297
Sześciopunktowa karta wskaźnika wilgotnościSCC, USA6HIC200
Próżniowa zgrzewarkapróżniowa Andrew James UK Ltd, Bowburn, Wielka BrytaniaVS518
Andrew James Rolki do zgrzewania próżniowego 28 cm x 40 metrówAndrew James UK Ltd, Bowburn, Wielka BrytaniaBR2805
Skaningowy mikroskop elektronowy (SEM)Philips/FEI Mikroskop konfokalny XL-20 SEM
Zeiss LSM 510 META
Videne Roztwór antyseptycznyEcolab, Swindon, Wielka Brytania3%

Bibliografia

  1. Ambati, B. K., et al. Corneal avascularity is due to soluble VEGF receptor-1. Nature. 443, 993-997 (2006).
  2. Reinach, P., Capó-Aponte, J., Mergler, S., Pokorny, K. Ophthalmic Diseases And Drug DeliveryOphthalmology Research. Ch 2, Ocular Transporters. Tombran-Tin, J., Barnstable, C. J. 2, Humana Press. 17-46 (2008).
  3. Kinoshita, S., et al. Characteristics of the Human Ocular Surface Epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 20, 639-673 (2001).
  4. Fatt, I., Bieber, M. T. The steady-state distribution of oxygen and carbon dioxide in the in vivo cornea: I. The open eye in air and the closed eye. Experimental Eye Research. 7, 103-112 (1968).
  5. Shortt, A. J., et al. Characterization of the Limbal Epithelial Stem Cell Niche: Novel Imaging Techniques Permit In Vivo Observation and Targeted Biopsy of Limbal Epithelial Stem Cells. STEM CELLS. 25, 1402-1409 (2007).
  6. Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. British Journal of Ophthalmology. 89, 529-532 (2005).
  7. Thoft, R. A., Friend, J. The X, Y, Z hypothesis of corneal epithelial maintenance. Investigative Ophthalmolog., & Visual Science. 24, 1442-1443 (1983).
  8. Lehrer, M. S., Sun, T. T., Lavker, R. M. Strategies of epithelial repair: modulation of stem cell and transit amplifying cell proliferation. Journal of Cell Science. 111, 2867-2875 (1998).
  9. Djalilian, A., et al. Down-regulation of Notch signaling during corneal epithelial proliferation. Molecular Vision. 14, 1041-1049 (2008).
  10. Dua, H. S., Azuara-Blanco, A. Limbal Stem Cells of the Corneal Epithelium. Survey of Ophthalmology. Survey. 44, 415-425 (2000).
  11. Dravida, S., et al. A biomimetic scaffold for culturing limbal stem cells: a promising alternative for clinical transplantation. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 2, 263-271 (2008).
  12. Rama, P., et al. Limbal Stem-Cell Therapy and Long-Term Corneal Regeneration. New England Journal of Medicine. 363, 147-155 (2010).
  13. Koizumi, N., Inatomi, T., Suzuki, T., Sotozono, C., Kinoshita, S. Cultivated corneal epithelial stem cell transplantation in ocular surface disorders. Ophthalmology. 108, 1569-1574 (2001).
  14. Fatima, A., et al. Technique of cultivating limbal derived corneal epithelium on human amniotic membrane for clinical transplantation. Journal of Postgraduate Medicine. 52, 257-261 (2006).
  15. Nubile, M., et al. Amniotic membrane transplantation for the management of corneal epithelial defects: an in vivo confocal microscopic study. British Journal of Ophthalmology. 92, 54-60 (2008).
  16. Nubile, M., et al. In Vivo Analysis of Stromal Integration of Multilayer Amniotic Membrane Transplantation in Corneal Ulcers. American Journal of Ophthalmology. 151, 809-822 (2011).
  17. Dua, H. S. Amniotic membrane transplantation. British Journal of Ophthalmology. 83, 748-752 (1999).
  18. Gicquel, J., et al. Epidermal Growth Factor Variations in Amniotic Membrane Used for Ex Vivo Tissue Constructs. Tissue Engineering Part A. 15, 1919-1927 (2009).
  19. Connon, C. J., et al. The variation in transparency of amniotic membrane used in ocular surface regeneration. British Journal of Ophthalmology. 94, 1057-1061 (2010).
  20. Hopkinson, A., McIntosh, R. S., Tighe, P. J., James, D. K., Dua, H. S. Amniotic Membrane for Ocular Surface Reconstruction: Donor Variations and the Effect of Handling on TGF-β Content. Investigative Ophthalmolog., & Visual Science. 47, 4316-4322 (2006).
  21. Sitalakshmi, G., et al. Ex Vivo Cultivation of Corneal Limbal Epithelial Cells in a Thermoreversible Polymer (Mebiol Gel) and Their Transplantation in Rabbits: An Animal Model. Tissue Engineering Part A. 15, 407-415 (2008).
  22. Ortega, I., Deshpande, P., Gill, A. A., MacNeil, S., Claeyssens, F. Development of a microfabricated artificial limbus with micropockets for cell delivery to the cornea. Biofabrication. 5, (2013).
  23. Deshpande, P., et al. Using poly(lactide-co-glycolide) electrospun scaffolds to deliver cultured epithelial cells to the cornea. Regenerative Medicine. 5, 395-401 (2010).
  24. Deshpande, P., et al. Simplifying corneal surface regeneration using a biodegradable synthetic membrane and limbal tissue explants. Biomaterials. 34, 5088-5106 (2013).
  25. Wheeldon, I., Ahari, A. F., Khademhosseini, A. Microengineering Hydrogels for Stem Cell Bioengineering and Tissue Regeneration. Charlottesv Va. 15, 440-448 (2010).
  26. Moeller, H. C., Mian, M. K., Shrivastava, S., Chung, B. G., Khademhosseini, A. A microwell array system for stem cell culture. Biomaterials. 29, 752-763 (2008).
  27. Fisher, O. Z., Khademhosseini, A., Langer, R., Peppas, N. A. Bioinspired Materials for Controlling Stem Cell Fate. Accounts Chem. Res. 43, 419-428 (2010).
  28. Raimondi, M. T., et al. Three-dimensional structural niches engineered via two-photon laser polymerization promote stem cell homing. Acta Biomaterialia. 9, 4579-4584 (2013).
  29. Gobaa, S., et al. Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput. Nat Meth. 8, 949-955 (2011).
  30. Truckenmüller, R., et al. Fabrication of cell container arrays with overlaid surface topographies. Biomedical Microdevices. 14, 95-107 (2012).
  31. Ortega, Í, Ryan, A. J., Deshpande, P., MacNeil, S., Claeyssens, F. Combined microfabrication and electrospinning to produce 3-D architectures for corneal repair. Acta Biomaterialia. 9, 5511-5520 (2013).
  32. Blackwood, K. A., et al. Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement. Biomaterials. 29, 3091-3104 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

limbalne kom rki macierzystepier cienie PEG DAmembrany PLGAnisza kom rek macierzystychrusztowania do in ynierii tkankowejtr jwymiarowy model uszkodzonej rog wkianaliza rozrostu kom rkowego
Połączenie mikrostereolitografii i elektroprzędzenia w celu wytworzenia membran wyposażonych we wnęki do regeneracji rogówki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.