Osiąganie zgodności z wymuszonymi ćwiczeniami u gryzoni: krytyczny standard oceny wpływu ćwiczeń na zaburzenia i choroby związane ze starzeniem się

Podsumowanie

Ćwiczenia mogą łagodzić zaburzenia zachowania związane z chorobami neurodegeneracyjnymi. Badania nad mechanizmami leżącymi u podstaw efektów za pośrednictwem ćwiczeń nasiliły się w modelach chorób, ale neurobiologiczne tło towarzyszące tym chorobom, w szczególności starzenie się, prawdopodobnie nie jest brane pod uwagę. W tym miejscu ilustrujemy środki zwiększające prawdopodobieństwo udanego paradygmatu ćwiczeń u starszych szczurów.

Streszczenie

Obserwuje się znaczny wzrost świadomości pozytywnego wpływu ćwiczeń na poprawę kilku stanów chorobowych o podłożu neurobiologicznym; obejmują one poprawę funkcji poznawczych i sprawności fizycznej. W rezultacie obserwuje się wzrost liczby badań na zwierzętach z wykorzystaniem ćwiczeń. Twierdzi się, że jedną z nieodłącznych wartości wymuszonych ćwiczeń jest to, że badacz ma kontrolę nad czynnikami, które mogą wpływać na wpływ ćwiczeń na wyniki behawioralne, w szczególności częstotliwością ćwiczeń, czasem trwania i intensywnością reżimu ćwiczeń. Jednak przestrzeganie reżimów wymuszonych ćwiczeń może stanowić problem, zwłaszcza jeśli ma się uniknąć potencjalnych zakłóceń związanych z zastosowaniem wstrząsów stopy. Ważne jest również, aby wziąć pod uwagę, że ponieważ większość zaburzeń poznawczych i ruchomych występuje u osoby w podeszłym wieku, określenie wpływu ćwiczeń na te upośledzenia powinno rozważyć użycie starszych gryzoni o najwyższym możliwym poziomie zgodności, aby zapewnić minimalne zapotrzebowanie na osoby badane. W tym miejscu zostaną przedstawione i omówione odpowiednie kroki i względy niezbędne do osiągnięcia prawie 100% zgodności z ćwiczeniami na bieżni w starszym modelu gryzoni. Niezależnie od konkretnego schematu ćwiczeń stosowanego przez badacza, nasz protokół powinien być przydatny dla badaczy, którzy są szczególnie zainteresowani potencjalnym wpływem wymuszonych ćwiczeń na upośledzenia związane ze starzeniem się, w tym parkinsonizm związany ze starzeniem się i chorobę Parkinsona.

Wprowadzenie

Nieinwazyjne strategie stylu życia, które mogą zapobiegać lub łagodzić zaburzenia funkcji poznawczych i lokomocji, często związane ze starzeniem się, zyskują na popularności jako realne praktyki dla utrzymania zdrowia i dobrego samopoczucia^1,2. Na przykład umiarkowane lub rygorystyczne ćwiczenia co tydzień i konsekwentne u mężczyzn w średnim wieku mogą znacznie zwiększyć zdolności lokomotoryczne w porównaniu z rówieśnikami w podobnym wieku w zaawansowanym wieku³ lat. Co więcej, coraz więcej dowodów sugeruje, że te strategie stylu życia, takie jak ćwiczenia, mogą łagodzić lub nawet odwracać upośledzenia związane z chorobami neurodegeneracyjnymi, takimi jak choroba Parkinsona (PD)⁴.

Wysiłki zmierzające do zrozumienia molekularnych mechanizmów zaburzeń związanych ze starzeniem się były również skierowane na określenie, w jaki sposób nieinwazyjne strategie, takie jak ćwiczenia, odwracają lub osłabiają mechanizmy, które przyczyniają się do takich upośledzeń. Ćwiczenia na bieżni są jedną z takich strategii, coraz częściej stosowaną w modelach PD^5-7 i upośledzenia funkcji poznawczych¹, w których mechanizmy stojące za poprawą funkcji lokomotorycznych lub poznawczych są nadal określane. Należy jednak podkreślić, że starzenie się jest neurobiologicznym podłożem choroby Parkinsona. Tak więc, aby jakiekolwiek potencjalne przełożenie jakichkolwiek korzyści z ćwiczeń w modelu zwierzęcym mogło zostać zrealizowane w kondycji ludzkiej, musi wziąć pod uwagę neurobiologiczne tło starzenia się. Na przykład mechanizmy kompensacyjne, które powstrzymują upośledzenie ruchu podczas progresji choroby Parkinsona, mogą być upośledzone przez proces starzenia^się8. W związku z tym oczywiste jest, że należy opracować paradygmaty ćwiczeń, które nie tylko uwzględniają wpływ starzenia się w obecności lub braku patologii chorobowej, ale także mogą być inicjowane i utrzymywane u starzejących się gryzoni.

Dlatego, biorąc pod uwagę starzenie się na tle neurobiologicznym, wybór szczepu szczurów powinien być starannie rozważony przez badacza. Dostępnych jest kilka szczepów szczurów do badań starzenia, w szczególności Fischer 344 i hybryda Brown-Norway/Fischer 344 F₁ (BNF). Powszechnie stosowany szczur Sprague Dawley (szczep niekrewniaczy) jest również podatny na takie zastosowanie, ponieważ jest powszechnie stosowany w modelach chorób neurodegeneracyjnych, takich jak model PD 6-hydroksydopaminy. Nasze laboratorium wykorzystuje zarówno szczepy Sprague Dawley, jak i BNF w pracy nad starzeniem się i chorobami neurodegeneracyjnymi. W tym raporcie przedstawimy wyniki, podkreślając nasze protokoły ćwiczeń z wykorzystaniem obu szczepów. Dla tych badaczy, którzy koncentrują się wyłącznie na badaniach związanych z wiekiem, szczep BNF oferuje kilka ważnych korzyści. Po pierwsze, jest stosunkowo mniej podatny na zaburzenia związane ze starzeniem się (takie jak nowotwory) i ma wyjątkową długowieczność (typowa długość życia przekracza 30 miesięcy) w porównaniu z innymi szczepami. Charakteryzują się również mniejszą zmiennością w zakresie różnych wyników fizjologicznych i behawioralnych⁹_, a także nadają się do badania podejść, które ingerują w proces starzenia się. Co więcej, eksperymenty, takie jak wymuszone ćwiczenia, wymagają znacznego traktowania przez badacza, a łagodne rozmieszczenie szczepu BNF jest korzystne. Związane ze starzeniem się zmiany w zawartości tkanki dopaminowej w prążkowiu i śródmózgowiu, a także zmiany aktywności lokomotorycznej są podobne u szczurów BNF i naczelnych^10-11. Nasze laboratorium ma również duże doświadczenie w charakteryzowaniu i manipulowaniu sygnalizacją dopaminową prążkowia i śródmózgowia, a także aktywnością lokomotoryczną w szczepie BNF^12-16. Dlatego, ponieważ ryzyko innych chorób o podłożu neurobiologicznym wzrasta wraz z wiekiem, zwierzęce modele chorób neurodegeneracyjnych powinny rozważyć zastosowanie szczepów gryzoni z obszernym doświadczeniem w badaniach nad starzeniem się.

Nasz protokół tutaj również porusza kilka krytycznych kwestii, które badacz musi wziąć pod uwagę przy interpretacji swoich wyników uzyskanych z protokołu ćwiczeń. Bieżnia dla gryzoni (której zastosowanie podkreślimy w tym raporcie) jest zwykle wyposażona w cewki porażeniowe z tyłu każdego pasa bieżni, które można dezaktywować. Jednakże, gdy te cewki elektrowstrząsowe są aktywowane, mały wstrząs stopowy jest dostarczany do obiektu, gdy wchodzi w kontakt z cewkami. Strategia ta jest często stosowana w badaniach ruchowych, aby ułatwić przestrzeganie ćwiczeń na bieżni. Jest to krytyczny punkt do rozważenia, szczególnie dla tych badaczy zaangażowanych w badania behawioralne, na które wpływa sygnalizacja dopaminy lub noradrenaliny. Elektryczny wstrząs stopy jest fizjologicznym stresorem, a jego wpływ na oba układy neuroprzekaźników jest dobrze udokumentowany, ze zwiększoną aktywacją hydroksylazy tyrozynowej^17-18. W związku z tym zwiększona biosynteza któregokolwiek z neuroprzekaźników może zakłócić interpretację jakiegokolwiek efektu ćwiczeń, co sprawia, że badacz jest odpowiedzialny za interpretację, czy jakakolwiek zaobserwowana zmiana w zachowaniu po ćwiczeniach jest ściśle spowodowana reżimem ćwiczeń, czy stresem związanym ze wstrząsem stopy. Co ważne, proponowany reżim wymuszonych ćwiczeń nie wykorzystuje wstrząsów stóp w żadnym momencie okresu aklimatyzacji na bieżni lub treningu fizycznego.

Udane schematy ćwiczeń wymagają również maksymalnej zgodności z ćwiczeniami od badanych. Zastosowanie wstrząsu stopy w celu osiągnięcia zgodności może zakłócić interpretację wyników eksperymentalnych, gdy miara zależna jest związana z sygnalizacją neuroprzekaźnika, na którą wpływa wstrząs stopy (jak omówiono wcześniej). W związku z tym wyzwaniem jest skłonienie gryzoni, a w szczególności gryzoni w podeszłym wieku, do przestrzegania reżimu ćwiczeń. Pożądanym celem każdego schematu ćwiczeń jest osiągnięcie prawie 100% zgodności, ponieważ zmniejszy to liczbę zwierząt niezbędnych do ukończenia schematu ćwiczeń. W szczególności, maksymalna zgodność z ćwiczeniami i interpretacja wyników schematu ćwiczeń można uzyskać w naszym schemacie ćwiczeń w wyniku kilku procedur przedtreningowych, w tym: 1) odwróconego cyklu światło-ciemność, który umożliwia zwierzętom ćwiczenia podczas ich aktywnego cyklu (czuwania), 2) zapewnienia, że podstawy wydolności lokomotorycznej są równe przed segregacją grup kontrolnych i ćwiczących, oraz 3) wprowadzenie badanych w okres aklimatyzacji, który stopniowo zapoznaje ich z wymaganiami reżimu ćwiczeń. W tym miejscu zostaną ocenione i przedstawione wyżej wymienione rozważania eksperymentalne i kroki niezbędne do osiągnięcia prawie 100% zgodności z ćwiczeniami na bieżni u starszego gryzonia (>18 miesięcy). Wreszcie, środowisko związane z ćwiczeniami może być stresujące i jako takie może powodować potencjalne zakłócenia w określaniu efektów fizjologicznych specyficznych dla ćwiczeń. Nasz protokół kontroluje również narażenie na potencjalnie stresujące środowisko bieżni poprzez włączenie grupy niećwiczącej w każdy aspekt fazy aklimatyzacji (w tym skromne bieganie na bieżni) i umieszczenie jej na bieżni stacjonarnej podczas treningu na bieżni. W związku z tym protokół ten ma na celu opisanie środków niezbędnych do określenia fizjologicznego wpływu samych ćwiczeń.

Protokół

Wszystkie poniższe procedury są przeprowadzane zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) w LSU Health Sciences Center-Shreveport i są zgodne z wytycznymi Narodowego Instytutu Zdrowia (National Institute of Health).

1. Procedury przed wysiłkiem

Uwaga: Harmonogram wszystkich istotnych procedur w tym wymuszonym reżimie ćwiczeń przedstawiono na Rysunku 1.

Rysunek 1. Harmonogram wymuszonego planu ćwiczeń. Harmonogram ten szczegółowo przedstawia istotne zdarzenia każdej fazy planu ćwiczeń w każdym tygodniu badania. Faza przedaklimatyzacyjna (tygodnie 1-2) obejmuje manipulacje zwierzętami przez eksperymentatora oraz pomiar bazowej aktywności lokomocyjnej. Podczas fazy aklimatyzacji (tygodnie 3-4) wszystkie szczury przechodzą 3 dni treningu aklimatyzacyjnego, podczas którego przebywają na stacjonarnej bieżni, a następnie 10 dni treningu aklimatyzacyjnego do bieżni. Podczas fazy treningu fizycznego (tygodnie 5-10) wymagane są co najmniej dwie serie ćwiczeń (1 seria = 12 kolejnych dni), po których następuje 2-tygodniowy okres odpoczynku. W trakcie tych okresów odpoczynku można przeprowadzać pomiary behawioralne i/lub neurochemiczne. Ponadto plan ten można zmodyfikować, aby uwzględnić wielokrotne serie ćwiczeń w tej fazie. Masa ciała jest mierzona co tydzień we wszystkich fazach badania oraz przed (pierwsza sesja) i po (ostatnia sesja) każdej fazie planu ćwiczeń. Wyniki treningu na bieżni są przypisywane po wszystkich sesjach aklimatyzacyjnych i treningowych i mieszczą się w zakresie od 1 do 4, gdzie 4 jest najwyższą możliwą oceną. W skrócie, ocenę treningową 4 przypisuje się, gdy szczury ćwiczą przez całą sesję treningową bez pomocy. Analogicznie, ocenę 3 przypisuje się, gdy szczury wymagają minimalnej pomocy eksperymentatora (zdefiniowanej jako: pomoc przez mniej niż 25% czasu sesji treningowej). Ocenę 2 przypisuje się, gdy szczury wymagają znacznej pomocy eksperymentatora (zdefiniowanej jako: pomoc przez więcej niż 25% czasu sesji treningowej) podczas sesji ćwiczeń. Na koniec, ocenę 1 przydziela się szczurom, które nie współpracują i nie kończą sesji ćwiczeń.

1. Po przybyciu do kolonii zwierząt rozdzielić wszystkie osobniki i umieścić je w pojedynczych, standardowych klatkach typu shoebox. Zapewnić zwierzętom swobodny dostęp do pokarmu i wody (ad libitum) przez cały okres trwania badania.
2. W kolonii zwierząt utrzymywać odwrócony 12-godzinny cykl światło-ciemność (światło od godziny 18:00 do 06:00) i pozwolić zwierzętom na aklimatyzację do tego cyklu przez minimum jeden tydzień. Wszystkie eksperymenty behawioralne przeprowadzać podczas aktywnej (ciemnej) fazy cyklu, na 1-2 godziny przed zmianą cyklu światło-ciemność.
3. Zacząć dwa tygodnie przed rozpoczęciem eksperymentów behawioralnych od codziennego obchodzenia wszystkich osobników testowych przez kilka minut, aby zapoznać zwierzęta z eksperymentatorem oraz zmniejszyć stres wywołany nowością w nieznanym środowisku, takim jak komora lokomocyjna i bieżnia.
4. Mierzyć masę ciała każdego osobnika raz w tygodniu oraz bezpośrednio przed (pierwsza sesja) i po (ostatnia sesja) każdym głównym przedziale czasowym w schemacie ćwiczeń.

2. Podstawowe oceny aktywności lokomotorycznej: wyznaczanie przydziału do grup ćwiczeń wymuszonych

1. Oceniaj spontaniczną aktywność lokomotoryczną każdego osobnika przez 60 min/dobę przez 5 kolejnych dni w celu ustalenia bazowych zdolności lokomotorycznych. Sesje aktywności lokomotorycznej przeprowadzaj w zautomatyzowanych komorach do pomiaru aktywności w otwartym polu, składających się z pudełka z pleksiglasu (45 x 45 x 20 cm³) z siatką wiązek podczerwieni zamontowanych poziomo i pionowo, zgodnie z zaleceniami w instrukcji obsługi produktu.
2. Na początku każdego dnia oceny aktywności lokomotorycznej uruchom i skonfiguruj komputer oraz program oprogramowania połączony z komorami aktywności w otwartym polu, aby zarejestrować liczbę przerw w wiązkach (aktywność lokomotoryczna) podczas każdej sesji.
3. Przed każdą sesją wysyp na dno komory lokomotorycznej około 2 szklanek ściółki z wiórów sosnowych.
4. Przenoś osobniki z kolonii zwierząt do komór aktywności lokomotorycznej w ich domowych klatkach bezpośrednio przed sesją. Umieść osobniki w przypisanych komorach lokomotorycznych pod czerwonym światłem i uruchom 60-minutową sesję na komputerze po ich umieszczeniu w komorze.
5. Po zakończeniu sesji aktywności lokomotorycznej wyjmij osobniki z komory i przenieś je z powrotem do klatek domowych pod czerwonym światłem. Natychmiast zwróć osobniki do kolonii zwierząt.
6. Po każdej sesji usuń ściółkę z komory, a następnie wyczyść ściany i dno komory 50% etanolem.
7. Powtarzaj kroki 2.3-2.6 dla dodatkowych sesji lokomotorycznych każdego dnia w razie potrzeby, aż do przetestowania wszystkich osobników. Wszystkie sesje aktywności lokomotorycznej przeprowadzaj w ciemności, podczas cyklu aktywności zwierząt i 1-2 h przed zmianą cyklu światło-ciemność.
8. Aby uwzględnić możliwość habituacji do komór aktywności, rotuj osobniki między dostępnymi komorami w taki sposób, aby aktywność lokomotoryczna była mierzona w innej komorze niż poprzedniego dnia.
   1. Jeśli w ciągu jednego dnia należy przeprowadzić wiele sesji, zmień kolejność testowania tak, aby osobniki były testowane w innej kolejności niż podczas poprzedniej sesji.
9. Na podstawie danych wygenerowanych przez oprogramowanie do pomiaru aktywności lokomotorycznej określ bazową aktywność lokomotoryczną każdego zwierzęcia, korzystając z następujących 5 parametrów lokomotorycznych: całkowita przebyta odległość (cm), aktywność pozioma (liczba przerw w wiązkach), liczba ruchów (liczba zainicjowanych ruchów), czas ruchu (sec) oraz prędkość ruchu (cm/sec).
   1. W celu przypisania osobników do grupy ćwiczącej i niećwiczącej, oblicz wartość średnią z wszystkich 5 sesji dla każdego z 5 parametrów lokomotorycznych wymienionych w kroku 2.9 powyżej.
10. Na podstawie tych 5 parametrów wyznacz grupy ćwiczącą i niećwiczącą (kontrolną) w taki sposób, aby w obu grupach reprezentowany był równy zakres aktywności lokomotorycznej. W ten sposób dobieraj szczury w pary na podstawie podobnych zdolności ruchowych, przypisując jednego szczura do grupy ćwiczącej, a drugiego do grupy niećwiczącej. Na przykład dobierz w parę dwa szczury, które wykazują najwyższą średnią dla wszystkich 5 parametrów lokomotorycznych, a następnie przypisz jednego do grupy ćwiczącej i drugiego do grupy niećwiczącej (przypisanie do grupy jest losowe). Powtórz ten proces dla pozostałych osobników.
    1. Utrzymuj parowanie przez cały okres wymuszonego schematu ćwiczeń oraz podczas wszystkich analiz danych.
11. Jeśli eksperymentatora interesuje wpływ ćwiczeń na aktywność lokomotoryczną, zmierz aktywność lokomotoryczną po ćwiczeniach, stosując te same procedury opisane w krokach 2.1-2.8.1, zaczynając od dnia następującego po ostatniej sesji ćwiczeń na bieżni. UWAGA: Jeśli badacz jest zainteresowany i/lub oprogramowanie do pomiaru aktywności lokomotorycznej na to pozwala, przeanalizuj mierniki związane z lękiem (t.j. czas spędzony na peryferiach w porównaniu z centrum komory aktywności), aby ocenić względowy poziom lęku osobników podczas oceny aktywności lokomotorycznej.

3. Aklimatyzacja do bieżni

1. Wszystkie procedury związane z ćwiczeniami na bieżni należy przeprowadzać na zmotoryzowanej bieżni dla gryzoni z torami oddzielonymi przezroczystymi ściankami z pleksiglasu podczas aktywnego cyklu zwierząt, na 1-2 h przed zmianą cyklu światło-ciemność.
2. W miejsce cewek wstrząsowych znajdujących się z tyłu każdego toru należy zastosować ogranicznik z pleksiglasu, zaprojektowany specjalnie do tej bieżni, aby badane zwierzęta mogły ćwiczyć w sposób ciągły, nie wchodząc w kontakt z cewkami wstrząsowymi. Aby zapobiec przesuwaniu się ogranicznika podczas sesji treningowych, należy go przymocować za pomocą zacisku śrubowego o rozmiarze 1,5 in.
3. Ze względu na konieczność obsługi przez eksperymentatora podczas treningu na bieżni, wszystkie sesje ćwiczeń należy przeprowadzać przy zapalonym świetle.
4. Przenosić zwierzęta w ich domowych klatkach na bieżnię bezpośrednio przed sesją treningową. Gdy bieżnia jest zatrzymana, należy umieścić szczury na bieżni w przypisanych im torach, przesuwając ogranicznik w górę na tyle, aby zwierzęta mogły pod niego wpełznąć. Po umieszczeniu zwierzęcia na pasie bieżni należy przesunąć ogranicznik z powrotem do pozycji spoczynkowej. Nie należy rozpoczynać sesji, dopóki wszystkie zwierzęta nie zostaną umieszczone w torach przypisanych na daną sesję.
   1. Podczas pierwszej fazy aklimatyzacji należy umieszczać każdego szczura w jednym z czterech torów zatrzymanej bieżni (zgodnie z opisem w kroku 3.4) przez 5-10 min/dobę przez 3 kolejne dni. Czas każdej sesji należy zwiększać z każdym kolejnym dniem (np. 5 min w dniu 1., 7 min w dniu 2. i 10 min w dniu 3.), aby szczury oswoiły się z urządzeniem i zredukować potencjalny stres związany z nowością aparatury. Ważne: Na tym etapie nie wolno umieszczać szczurów w żadnym innym miejscu na bieżni (np. przy wyłączonych cewkach wstrząsowych) poza zatrzymanym pasem.
5. Podczas drugiej fazy treningu aklimatyzacyjnego należy umieścić każdego szczura w jednym torze zatrzymanej bieżni przed ogranicznikiem. Gdy wszystkie zwierzęta znajdą się na miejscu, należy włączyć bieżnię na wolną prędkość chodu (np. 6 m/min). Niezależnie od grupy eksperymentalnej, wszystkie szczury powinny być trenowane w chodzeniu na bieżni w tej fazie, aby zapewnić, że wszelkie potencjalne efekty zaobserwowane w reżimie wymuszonych ćwiczeń będą wynikiem treningu, a nie jedynie zdolnością do wykonywania ćwiczeń.
6. W momencie uruchomienia pasa bieżni należy upewnić się, że wszystkie szczury idą do przodu. W razie potrzeby należy pomóc szczurom, orientując je lub delikatnie popychając, aż zaczną poruszać się naprzód. W okresie treningu aklimatyzacyjnego należy trenować szczury tak, aby chodziły po bieżni w sposób ciągły, bez pomocy eksperymentatora.
   1. Aklimatyzować wszystkie szczury do bieżni poprzez stopniowe zwiększanie prędkości w okresie od 5-10 min/dobę przez 10 kolejnych dni. Aby dodatkowo ułatwić dostosowanie do ćwiczeń na bieżni, należy trenować szczury przy niskich prędkościach (6-8 m/min) przez 5-10 min podczas pierwszych 5 sesji aklimatyzacyjnych, a następnie zwiększyć prędkość do umiarkowanej (9-10 m/min) przez 5-10 min podczas ostatnich 5 sesji aklimatyzacyjnych.
   2. Należy upewnić się, że do ostatniej sesji okresu treningu aklimatyzacyjnego wszystkie szczury są w stanie utrzymać prędkość 9-10 m/min przez 10 min.
7. Po zakończeniu sesji aklimatyzacyjnej należy zdjąć zwierzęta z bieżni w ten sam sposób, w jaki zostały załadowane (zgodnie z opisem w kroku 3.4). Zwierzęta należy niezwłocznie przenieść do ich domowych klatek i odstawić z powrotem do kolonii zwierząt.
8. Po każdej sesji treningowej należy przemyć każdy tor, w tym ścianki i pas bieżni, za pomocą 50% etanolu.
9. Oceniać zdolności wysiłkowe każdego szczura w trakcie sesji ćwiczeń, przypisując punktową ocenę treningu na bieżni po zakończeniu każdej codziennej sesji. Punktację 4 przypisuje się, gdy szczury ćwiczą przez całą sesję bez pomocy. Punktację 3 przypisuje się, gdy szczury wymagają minimalnej pomocy (definiowanej jako: pomoc przez mniej niż 25% czasu sesji treningowej) ze strony eksperymentatora. Punktację 2 przypisuje się, gdy szczury wymagają znacznej pomocy (definiowanej jako: pomoc przez więcej niż 25% czasu sesji treningowej) ze strony eksperymentatora podczas sesji. Na koniec, punktację 1 przypisuje się szczurom niepodporządkowanym, które nie ukończyły sesji ćwiczeń.
   UWAGA: System punktacji ćwiczeń został częściowo zaadoptowany z innych badań¹⁹.
   1. Należy wykluczyć szczury, które nie mogą ukończyć fazy aklimatyzacji z powodu braku współpracy i/lub urazu uniemożliwiającego ćwiczenia (np. obejmuje to szczury, które otrzymały punktację 1 za trening na bieżni przez więcej niż jeden kolejny dzień treningu aklimatyzacyjnego).
10. Obliczyć średnią ocen z bieżni dla każdego okresu treningowego (np. treningu aklimatyzacyjnego i treningu właściwego), aby określić zdolności wysiłkowe każdego osobnika. Należy upewnić się, że wszystkie szczury są w stanie uzyskać punktację 4 podczas sesji treningowej do końca okresu aklimatyzacji.
    1. Jeśli niektóre szczury nie dostosowują się do maksymalnych prędkości utrzymywanych przez inne osobniki przez całą sesję, należy dostosować prędkość dla tych szczurów tak, aby mogły kontynuować ćwiczenia przez ten sam czas, ale przy wolniejszej prędkości podczas sesji treningowych. W takim przypadku wolniejsze szczury należy trenować w oddzielnych sesjach i zwiększać prędkość w miarę adaptacji zwierząt do wolniejszego tempa.
11. Aby uniknąć potencjalnego wpływu toru na wyniki podczas treningu, należy rotować szczury między dostępnymi torami bieżni, tak aby w każdej kolejnej sesji ćwiczeń trenowały w innym torze.

4. Trening fizyczny na bieżni

1. Rozpocznij sesje treningu wysiłkowego w dniu następującym po ostatniej sesji treningu aklimatyzacyjnego i kontynuuj ćwiczenia szczurów przez 12 kolejnych dni. Prowadź te sesje podczas cyklu aktywności zwierząt, na 1-2 h przed zmianą cyklu światło-ciemność.
2. Stosuj te same procedury przygotowawcze dla każdej sesji treningu wysiłkowego na bieżni, które zostały opisane w krokach 3.2 i 3.4 podczas treningu aklimatyzacyjnego.
3. Na początku każdej sesji uruchom bieżnię z niższą prędkością rozgrzewkową (8 m/min) niż prędkość treningowa (9-11 m/min), która będzie utrzymywana przez resztę sesji treningowej. Utrzymuj tę prędkość rozgrzewkową przez 5-10 min na początku sesji. Następnie dostosuj prędkość do 9-11 m/min na pozostały czas sesji treningowej. Trenuj osobniki średnio przez 30 min podczas każdej sesji przez cały 12-dniowy okres treningu wysiłkowego.
4. Po każdej sesji treningu wysiłkowego przypisz wszystkim szczurom z grupy ćwiczącej ocenę wysiłku na bieżni, korzystając z tego samego systemu oceny opisanego w kroku 3.9. Nie przypisuj oceny treningowej szczurom z grupy kontrolnej (niećwiczącej) w okresie treningu na bieżni.
5. Prowadź sesje dla grupy ćwiczącej i niećwiczącej oddzielnie. Umieść szczury z grupy niećwiczącej na stacjonarnej bieżni na taki sam czas, przez który ich grupa ćwicząca trenowała podczas każdej sesji.
6. Zgodnie z opisem w kroku 3.11, zmieniaj szczury między dostępnymi pasami bieżni w taki sposób, aby podczas każdej kolejnej sesji ćwiczeń trenowały na innym pasie.
7. Po zakończeniu jednej serii ćwiczeń zapewnij osobnikom 14 dni odpoczynku. UWAGA: Ten okres odpoczynku został wybrany na podstawie wyników badania pilotażowego przedstawionego na Rysunkach 2A i 2B.
8. W razie potrzeby przeprowadź różnorodne oceny behawioralne i/lub neurochemiczne po zakończeniu 12-dniowego okresu treningowego. Alternatywnie, po 14-dniowym okresie odpoczynku kontynuuj kolejne serie treningu wysiłkowego.

Wyniki

Schemat osi czasu zdarzeń we wszystkich trzech fazach programu wymuszonego wysiłku fizycznego przedstawiono na Rysunku 1. W celu zwiększenia stopnia dostosowania do programu wymuszonego wysiłku fizycznego, oprócz odwrócenia cyklu światło-ciemność, wprowadzono codzienną obsługę przed jakimikolwiek testami eksperymentalnymi oraz etap 1 treningu aklimatyzacyjnego, podczas którego zwierzęta przebywały na stacjonarnej bieżni przez 5-10 min/dzień przez 3 kolejne dni. Procedury te dodano do protokołu, aby zmini...

Dyskusja

Istnieją dowody sugerujące, że strategie stylu życia, takie jak ćwiczenia, mogą zmniejszać ryzyko przewlekłych chorób związanych z wiekiem i ich głównych objawów, w tym chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera i PD²⁰. Zaletą wymuszonych ćwiczeń na bieżni, w przeciwieństwie do dobrowolnych ćwiczeń na kole do biegania, jest to, że badacz może określić częstotliwość, tempo i/lub intensywność ćwiczeń oraz czas trwania sesji ćwiczeń. W związku z tym po zastosowaniu danego schematu można przewidzie...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bieżnia Exer-4 dla szczurów	Columbus Instruments	96157-2	Columbus posiada różnorodne bieżnie dla zwierząt z różną liczbą torów i innymi opcjami, takimi jak pomiary metaboliczne
Miernik aktywności zwierząt: Opto-Varimex 4-Auto Track	Instrumenty Columbus	0170-R4	Columbus ma kilka opcji komór aktywności o różnych rozmiarach areny, rozstawie wiązek i czujnikach