Przeszczep rogówki u myszy: model do badania najczęstszej formy przeszczepu narządów litych

Podsumowanie

Myszy były używane jako model do badania wielu form transplantacji, w tym przeszczepu rogówki. W niniejszym raporcie opisujemy mysi model zarówno do ostrego, jak i późnego przeszczepu rogówki.

Streszczenie

Przeszczep rogówki jest najczęstszą formą przeszczepu narządów w Stanach Zjednoczonych, gdzie każdego roku wykonuje się od 45 000 do 55 000 zabiegów. Chociaż istnieje kilka modeli zwierzęcych do tej procedury, a myszy są gatunkiem, który jest najczęściej używany. Powodem wykorzystania myszy jest względny koszt wykorzystania tego gatunku, istnienie wielu genetycznie zdefiniowanych szczepów, które pozwalają na badanie odpowiedzi immunologicznych, oraz istnienie szerokiej gamy odczynników, które można wykorzystać do dalszego definiowania odpowiedzi u tego gatunku. Model ten został wykorzystany do zdefiniowania czynników w rogówce, które są odpowiedzialne za względny status uprzywilejowania immunologicznego tej tkanki, który umożliwia alloprzeszczepom rogówki przetrwanie ostrego odrzucenia przy braku leczenia immunosupresyjnego. Został również wykorzystany do zdefiniowania tych czynników, które są najważniejsze w odrzuceniu takich przeszczepów allogenicznych. W związku z tym wiele z tego, co wiemy o mechanizmach zarówno akceptacji, jak i odrzucenia alloprzeszczepu rogówki, wynika z badań z wykorzystaniem mysiego modelu przeszczepu rogówki. Oprócz opisania modelu ostrego odrzucenia alloprzeszczepu rogówki, po raz pierwszy prezentujemy również model późnego odrzucenia alloprzeszczepu rogówki.

Wprowadzenie

Przeszczep rogówki jest jednym z najbardziej udanych i powszechnych rodzajów transplantacji przeprowadzanych u ludzi. Powody, dla których wykonuje się tę operację, są wynikiem urazu, choroby zakaźnej¹ lub innych form niezakaźnej choroby rogówki². Dane z Eye Bank Association of America wskazują, że w 2011 roku wykonano ponad 46 000 zabiegów (patrz strona internetowa: restoresight.org/eye_banks/eye_banks.html). Wskaźnikiem jego sukcesu jest to, że roczne wskaźniki niepowodzeń w przypadku allogenicznych przeszczepów rogówki wahają się od 10 do 15%, a po 5 latach sukces przekracza 70%^3-8. Jak wykazało wiele badań, sukces alloprzeszczepów rogówki jest bezpośrednio związany z faktem, że oko jest miejscem immunologicznie uprzywilejowanym. Czynniki odpowiedzialne za status rogówki jako miejsca uprzywilejowania immunologicznego obejmują brak naczyń krwionośnych i limfatycznych w rogówce, względny brak komórek prezentujących antygen, czynniki wytwarzane przez rogówkę, które hamują funkcje efektorów immunologicznych^9-15, niską ekspresję antygenów MHC¹⁶ i ekspresję FasL^17-20.

Jednakże, pomimo tych czynników predysponujących te przeszczepy do sukcesu, przechodzą one odrzucenie^3-7. W związku z tym zrozumienie mechanizmów, które pośredniczą w tym odrzuceniu, a także testowanie różnych terapii w celu zapobiegania odrzuceniu, ma kluczowe znaczenie. W tym celu opisujemy tutaj mysi model przeszczepu rogówki, który jest używany od ponad 20 lat do badania przeszczepu rogówki w kontrolowanym środowisku eksperymentalnym. Ponieważ reakcje transplantacyjne obejmują wiele różnych czynników współpracujących ze sobą, które ostatecznie określą, czy przeszczepiona tkanka zakończy się niepowodzeniem, czy sukcesem, nie jest możliwe zrozumienie znaczenia tych czynników w żadnym modelu in vitro. W związku z tym konieczne są badania na nienaruszonych zwierzętach, aby określić, jakie czynniki są ważne dla sukcesu lub porażki przeszczepionej tkanki.

Podczas gdy inne gatunki zwierząt były wykorzystywane do badania przeszczepu rogówki, model mysi ma kilka zalet w porównaniu do innych gatunków. Pierwszym z nich jest istnienie wielu szczepów myszy, które wykazują ekspresję pewnych transgenów lub są ukierunkowane na geny pozbawione ekspresji specyficznych czynników immunologicznych, których funkcję w transplantacji można lepiej zbadać. Ponadto istnieje wiele odczynników (zarówno czynników rekombinowanych, jak i przeciwciał neutralizujących czynniki), które są specyficzne dla myszy i które nie występują dla wielu innych gatunków zwierząt. Ze względu na istnienie tych czynników, model ten był szeroko stosowany do identyfikacji istotnych czynników zaangażowanych w ostre odpowiedzi alloprzeszczepu rogówki ^{15,17,18,20-29}. Co więcej, wiadomo również, że wiele czynników związanych z przeszczepem rogówki jest funkcjonalnych w przeszczepianiu innych tkanek.

Protokół

UWAGA: Wszystkie zwierzęta wykorzystywane w tej procedurze są traktowane zgodnie z oświadczeniem Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką dotyczącą wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych, a także wytycznymi ustalonymi przez komitet nadzoru nad zwierzętami na Uniwersytecie Saint Louis.
UWAGA: Wszystkie narzędzia i roztwory chirurgiczne są sterylizowane przed operacją, aby ograniczyć infekcję mikrobiologiczną oka. Należy zauważyć, że chociaż zwierzęta odczuwają pewien ból po tym zabiegu, nie stosujemy środków przeciwbólowych. Powodem tego jest to, że wszystkie leki przeciwbólowe są przeciwzapalne, a reakcje przeszczepu rogówki obejmują stan zapalny, Stosowanie leków przeciwzapalnych zagroziłoby naszej zdolności do określenia, jakie czynniki są zaangażowane w niewydolność przeszczepu rogówki.

1. Znieczulenie

1. Myszy dawców i biorców należy poddać znieczuleniu ogólnemu poprzez wstrzyknięcia IP ketaminy (86,98 mg / kg) i ksylazyny (13,04 mg / kg).
2. Utrzymuj mysz biorcę w znieczuleniu przez cały czas trwania zabiegu, który zwykle trwa od 30 minut do godziny. W związku z tym należy stale monitorować mysz pod kątem oznak odzyskania przytomności.
3. Nałóż maść puralube na oko, które nie zostanie poddane operacji po znieczuleniu zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu.

2. Szczepienie rogówki

1. Uzyskanie guzika rogówki dawcy.
   1. Gdy zwierzę jest w pełni znieczulone, osiągnij odpowiednie rozszerzenie źrenic, podając kilka kropli do oczu zawierających 1% tropikamidu i 2,5% chlorowodorku fenylefryny.
   2. Ułóż głowę zwierzęcia dawcy poziomo na desce umieszczonej na solidnym ruchomym wsporniku. Przymocuj głowę paskiem taśmy na szyi, aby upewnić się, że oko jest w pozycji poziomej przez całą operację.
   3. Za pomocą trepanacji o średnicy 2 mm, której końcówka została zabarwiona błękitem metylowym, obrysuj centralne miejsce przeszczepu rogówki.
   4. Ostrym ostrzem wbij się w rogówkę i wstrzyknij healon do przedniej komory, aby ją pogłębić, aby zmniejszyć ryzyko uszkodzenia śródbłonka dawcy i leżącej pod nim soczewki.
   5. Wytnij przeszczep dawcy nożyczkami vannas i umieść w naczyniu zawierającym zbilansowany roztwór soli Hanksa do czasu użycia.
   6. Po usunięciu przeszczepu dawcy należy poddać mysz dawcy eutanazji poprzez wdychanie CO₂ .
2. Przygotowanie łóżka do przeszczepu.
   1. Powtórz te same kroki, które opisano w punktach od 2.1.1 do 2.1.2 dla odbiorcy.
   2. Za pomocą trefiny o średnicy 1,5 mm obrysuj miejsce przeszczepu biorcy.
   3. Ostrym ostrzem wbij się w rogówkę i wstrzyknij healon do przedniej komory, aby ją pogłębić i zmniejszyć ryzyko uszkodzenia leżącej pod spodem soczewki.
   4. Usuń zarysowany centralny guzik rogówki od odbiorcy za pomocą nożyczek vannas i wyrzuć.
3. Zszywanie przeszczepu
   1. Umieść rogówkę dawcy nad łożem przeszczepu w rogówce biorcy. Upewnij się, że pod rogówką dawcy znajduje się odpowiednie gojenie, aby chronić komórki śródbłonka dawcy przed uszkodzeniem przez bezpośredni kontakt z soczewką.
   2. Używając mikrokleszczyków z bardzo cienką końcówką, umieść pierwszy kęs nylonowego szwu 11-0 po stronie dawcy, przez dawcę z 90% głębokością pełnej grubości po stronie biorcy, a następnie zwiąż.
   3. Gdy rogówka zostanie zakotwiczona na miejscu, wykonaj szwy przerywane środkowe, tak aby rogówka miała od 8 do 10 szwów całkowitych, a rogówka dawcy była bezpiecznie wyrównana i przymocowana do łożyska przeszczepu rogówki biorcy.
4. Pogłębienie komory przedniej
   1. Pogłębić komorę przednią, wstrzykując HBSS lub pęcherzyk powietrza do komory przedniej i delikatnie sprawdzić integralność przeszczepu rogówki pod kątem wycieków za pomocą gąbki celulozowej.
      UWAGA: Jeśli komory przedniej nie można zreformować, istnieje duże prawdopodobieństwo wystąpienia zaćmy, co bardzo utrudni przyszłe oceny przeszczepionej rogówki, a także potencjalnie doprowadzi do dysfunkcji śródbłonka rogówki dawcy, a tym samym niepowodzenia przeszczepu.
5. Ocena końcowa
   1. Obserwuj oko, aby stwierdzić, czy źrenica jest okrągła, a głębokość przedniej komory jest normalna.
      UWAGA: Jeśli źrenica nie jest okrągła, oznacza to, że podczas szycia tęczówka została uszkodzona, a zatem przeszczep jest uważany za awarię techniczną.
   2. Nałóż maść z antybiotykiem na oko. Opcjonalnie: Zamknij powiekę jedwabnym szwem 7-0.
   3. Obserwuj myszy, aż w pełni się obudzą, a następnie trzymaj je indywidualnie przez co najmniej dwa dni po operacji.

3. Usuwanie szwów

1. W przypadkach, w których stosuje się szew powiekowy, znieczulij myszy zgodnie z powyższym opisem i zdejmij szew pokrywy po 48 godzinach.
2. Znieczulenie myszy w 7 dniu po operacji. Usunąć szwy mocujące przeszczep rogówki. Gdy szwy zostaną usunięte, a zwierzę w pełni się obudzi, włóż je z powrotem do klatki.

4. Ocena kliniczna

1. Zbadaj oko pod kątem oznak powikłań zabiegowych, które obejmują zaćmę (zmętnienie soczewki), strzępkę (krew w komorze przedniej), przednią komorę, która nie ma odpowiedniej głębokości lub znaczne zmętnienie rogówki. Rozważ te, które wykazują te powikłania, jako "zagrożone" i poddaj je eutanazji przez wdychanie CO₂ .
   1. Wykonaj wszystkie badania na nieznieczulonych myszach. Przytrzymaj mysz jedną ręką, przytrzymując w ten sposób mysz, aby druga ręka mogła podeprzeć oko, aby umożliwić lepszy widok oka. Po zakończeniu obserwacji włóż zwierzę z powrotem do klatki.
2. Niech obserwator niezaznajomiony z grupami terapeutycznymi oceni przeszczepione rogówki 2 do 3 razy w tygodniu pod kątem objawów epizodów odrzucenia przeszczepu rogówki lub niewydolności przeszczepu rogówki. Do tych obserwacji należy użyć mikroskopu chirurgicznego lub biomikroskopu z poziomą lampą szczelinową.
   1. Oceń każdą rogówkę pod kątem zmętnienia za pomocą skali od 0 do 5. Skala jest zdefiniowana w następujący sposób:
      1. Przypisz wynik 0 tym rogówkom, które nie mają oznak zmętnienia.
      2. Przypisz wynik 1 tym rogówkom, które wykazują minimalne powierzchowne zmętnienie.
      3. Przypisz wynik 2 rogówce, która wykazuje łagodne i głębsze zmętnienie, ale leżąca pod spodem źrenica i tęczówka są nadal dostrzegalne.
      4. Przypisz wynik 3 rogówce, która wykazuje zmętnienie zrębu, w którym tęczówka nie jest widoczna w szczegółach, z wyjątkiem brzegów źrenic.
      5. Przypisz wynik 4 rogówce, która wykazuje gęste zmętnienie zrębu i jeśli nie można zobaczyć żadnych leżących pod nią struktur.
      6. Przypisz wynik 5 rogówce, która wykazuje całkowite zmętnienie i intensywny obrzęk zrębu, z całkowicie zasłoniętą źrenicą i tęczówką.
   2. Oceń również każdą rogówkę pod kątem stopnia naciekania naczyń krwionośnych (neowaskularyzacja) za pomocą skali oceny od 1 do 8. Aby to osiągnąć, spójrz na rogówkę jako składającą się z 4 równych kwadrantów i określ ilość naczyń krwionośnych w każdym z tych kwadrantów z punktem, który będzie się wahał od 0 (brak naczyń) do 2 dla rozległego unaczynienia tego kwadrantu. Dodaj indywidualne wyniki z każdej ćwiartki, aby obliczyć ostateczny wynik neowaskularyzacji.
   3. Klasyfikuj rogówki jako ostro odrzucone, jeśli mają wynik 3 w dwóch kolejnych obserwacjach przez punkty czasowe do 5 tygodni.
   4. Sklasyfikuj myszy, których rogówka była czysta po 5 tygodniach, ale czasami >45 dni po wszczepieniu, z wynikiem 3 przez dwa kolejne punkty czasowe, jako te, które przeszły późne odrzucenie alloprzeszczepu rogówki. Użyj krzywych przeżycia Kaplana-Meiera do analizy przeżywalności przeszczepu.

5. Manipulacja modelem

1. Przygotowanie pojedynczych komórek ze śledziony.
   1. Aby przygotować pojedyncze komórki, najpierw poddaj eutanazji mysz dawcy. Następnie usuń śledzionę.
   2. Umieścić śledzionę w sitku do komórek i rozbić ją tłokiem strzykawki ze strzykawki o pojemności 3 ml.
   3. Umyj komórki i ponownie zawieś w 10 ml zbilansowanego roztworu soli Hanksa.
   4. Usunąć 10 μl zawiesiny komórek i dodać do 10 μl 0,4% błękitu trypanowego i wymieszać. Dodaj to do hemocytometru i policz komórki w centralnej siatce. Liczba komórek w probówce to liczba komórek x 10,⁴ x 2 (współczynnik rozcieńczenia w błękicie trypanowym) x 10 (objętość w probówce).
2. Wstrzyknięcie do komory przedniej.
   1. Znieczulenie myszy zgodnie z wcześniejszym opisem.
   2. Wykonaj zastrzyki za pomocą mikroskopu preparacyjnego. Do każdego wstrzyknięcia dokomorowego należy użyć 10⁶ komórek śledziony w objętości 0,005 ml i strzykawki o pojemności 0,25 ml mikrolitra wyposażonej w igłę 33 G.
      UWAGA: Inne manipulacje modelem można wykonać, traktując zwierzęta odczynnikami, które działają jako antagoniści lub agoniści, w celu określenia roli, jaką dany czynnik może odgrywać po ortotopowej operacji alloprzeszczepu rogówki.

Wyniki

Mysi model transplantacji rogówki jest wykorzystywany od ponad 20 lat do skutecznej charakterystyki mechanizmów zarówno odrzucania^19-23, jak i akceptacji^{13,15,16,18, 24-27} allograftu rogówki. Model ten posłużył do wykazania znaczenia ekspresji FasL w akceptacji allograftu rogówki, gdyż zwierzęta z niedoborem FasL nie były w stanie zaakceptować allograftów rogówki¹⁵. Wykorzystano go również do wykazania, że leczenie morfolino przeciwko receptorowi 1 czynnika wzrostu ś...

Dyskusja

Opisany tutaj mysi model przeszczepu rogówki umożliwia badaczowi badanie odrzucenia alloprzeszczepu rogówki u człowieka w modelu, który pozwala przewidzieć, jakie czynniki są najlepiej związane zarówno z odrzuceniem^{15,17,18,20, 26-30,} jak i akceptacją^21-25 alloprzeszczepów rogówki. W przeciwieństwie do przeszczepu ludzkiej rogówki, w którym pacjentom podaje się miejscowe lub ogólnoustrojowe leczenie steroidami w celu leczenia lub zapobiegania odrzuceniu^{przeszczepu 31}, model ten jest zwykl...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mikroskop chirurgiczny Zeiss	Zeiss	Rebuilt
1 ml Strzykawka	BD	305122
3 ml Strzykawka	BD	309657
10 ml Strzykawka	BD	309602
Nożyczki Vannus	Stortz	E-3387
11-0 Szwy	Alcon	717939M
Trephine 2,0 mm	Katena	K 2-7520
Trephine 1,5 mm	Katena	K 2-7510
Chlorowodorek trikainy 0,5%	Alcon	NDC 0065-0741-12
Healon	Abbott	Healon OVD
Kleszcze	FST	11251-20
7-0 Nici	Alcon	8065
2,5% Fenylefryna HCl	Alcon	NDC 61314-342-02
1% tropicamid	Bausch & Lomb	NDC-24208-585-59
Strzykawka Hamilton		Hamilton 7654-01
Igła o rozmiarze 33		90033
Sitko do komórek (100 μ m nylon)	BD Falcon	352360
Hemocytometr	Cardinal Health	B3175
Trypan Blue	Sigma	T8154

Hamilton