Artykuł metodologiczny

Ulepszona redukcyjna eliminacja β w żelu dla kompleksowych O-sprzężonych i sulfoglikomów za pomocą spektrometrii mas

DOI:

10.3791/51840

⸱

20 listopada 2014

 ,  ,  ,  , 
1Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Georgia, 3Research Institute for Bioresources and Biotechnology, Ishikawa Prefectural University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby kompleksowo zbadać różnorodność glikanów sprzężonych z O, nowa procedura redukcyjnej eliminacji β w żelu, połączona z permetylacją i metodą szybkiego podziału fazy, jest stosowana do analizy glikanów sprzężonych z O, bezpośrednio uwalnianych z glikoprotein rozdzielonych przez SDS-PAGE i podatnych na późniejszą analizę glikomiczną za pomocą spektrometrii mas.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Separacja białek za pomocą SDS-PAGE, a następnie proteolityczne trawienie w żelu rozdzielonych prążków białkowych pozwoliło na przeprowadzenie analizy proteomicznej próbek biologicznych w wysokiej rozdzielczości. Podobne podejścia, które pozwoliłyby na dogłębną analizę glikanów przenoszonych przez glikoproteiny rozdzielone przez SDS-PAGE, wymagają specjalnych rozważań w celu maksymalizacji odzysku i czułości przy użyciu spektrometrii mas (MS) jako metody wykrywania. Główną przeszkodą, którą należy pokonać w celu uzyskania wysokiej jakości danych, jest usunięcie zanieczyszczeń pochodzących z żelu, które zakłócają analizę stwardnienia rozsianego. Przedstawiony tutaj przepływ pracy próbki jest solidny, wydajny i eliminuje potrzebę czyszczenia HPLC na linii produkcyjnej przed stwardnieniem rozsianym. Kawałki żelu zawierające białka docelowe są myte w acetonitrylu, wodzie i octanie etylu w celu usunięcia zanieczyszczeń, w tym fragmentów polimerowego akrylamidu. Glikany sprzężone z O są uwalniane z białek docelowych przez redukcyjną eliminację β w żelu i odzyskiwane za pomocą solidnych, prostych procedur oczyszczania. Zaletą tego przepływu pracy jest to, że poprawia czułość wykrywania i charakteryzowania siarczanowanych glikanów. Procedury te pozwalają na skuteczne oddzielenie siarczanowych permetylowanych glikanów od niesiarczanowych (sjalowanych i obojętnych) permetylowanych glikanów poprzez szybki podział fazowy przed analizą MS, a tym samym usprawniają analizy glikomiczne i sulfoglikomiczne glikoprotein rozpoznawanych przez SDS-PAGE.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glikozylacja jest niezbędnym białkiem po modyfikacji, przyczyniającym się do fizjologii organizmu, patologii tkanek i rozpoznawania komórkowego 1-3. Pomimo znacznych postępów w glikonauce analitycznej, scharakteryzowanie pełnej różnorodności glikanów na określonym białku pozostaje niezwykle trudnym zadaniem, zwłaszcza w przypadku białek wyizolowanych z pierwotnych źródeł biologicznych. Niemniej jednak mikroheterogeniczność glikanów glikoproteinowych często wpływa na funkcjonalne interakcje z innymi białkami. Dlatego charakterystyka różnorodności glikanów jest niezbędna do zrozumienia fizjologicznego znaczenia glikozylacji komórkowej i tkankowej 4,5. Aby zrozumieć wpływ glikozylacji glikoproteiny na fizjologię i patofizjologię tkanek, coraz ważniejsze stają się solidne, czułe i kompleksowe techniki analizy glikomicznej. W analizie proteomicznej identyfikacja białek jest na ogół osiągana za pomocą analizy LC-MS/MS peptydów tryptycznych 6. Trawienie białek można przeprowadzić przy użyciu oczyszczonego białka lub białek rozpuszczonych przez SDS-PAGE po trawieniu w żelu z proteazami, takimi jak trypsyna 7-9. Wstępne wzbogacenie mieszanki białkowej przez SDS-PAGE zwiększa głębię i dokładność identyfikacji białek. Opracowanie analogicznych strategii analizy glikomicznej glikozylacji glikoproteiny leży w czołówce glikonauki.

Dwie główne klasy glikanów są przyłączone do szkieletu białkowego poprzez N-sprzężenie lub O-wiązanie. Glikany związane z N są przyłączone do reszt asparaginy (Asn) znajdujących się jako część sekwonu zdefiniowanego jako Asn-X-Ser / Thr / Cys (X to dowolny aminokwas z wyjątkiem proliny) i mogą być uwalniane przez trawienie enzymatyczne z peptydo-N-glikanazą (PNGaseF lub A), w roztworze, w żelu lub na blot 10-12. Glikany związane z O są głównie przyłączone do reszt seryny (Ser) lub treoniny (Thr). Jednak zidentyfikowano tylko jeden enzym, który jest zdolny do uwalniania glikanów związanych z O z glikoproteiny i ma bardzo ograniczoną specyficzność glikanową, uwalniając tylko najprostsze glikany związane z O. Strategie uwalniania chemicznego pozostają metodą z wyboru w celu kompleksowego uwalniania glikanów sprzężonych z O-z glikoprotein. Redukcyjna lub nieredukcyjna eliminacja β lub hydrazynoliza są dobrze scharakteryzowanymi technikami uwalniania chemicznego i są obecnie najczęściej stosowanymi metodami uwalniania glikanów sprzężonych z O z glikoprotein 13,14. Chociaż redukcyjna eliminacja β została zastosowana do uwolnienia glikanów sprzężonych z O z glikoprotein oddzielonych przez SDS-PAGE, poprzednie podejścia wymagały separacji HPLC do późniejszej analizy 15-17.

Wielowymiarowa analiza MS (MS n) stanowi obecnie najbogatsze źródło danych strukturalnych do charakteryzowania glikanów uwalnianych z glikoprotein izolowanych w ilościach oczekiwanych z większości źródeł biologicznych. Głębokość charakterystyki strukturalnej opartej na stwardnieniu rozsianym jest znacznie ułatwiona przez permetylację uwolnionych glikanów przed ich analizą. Permetylacja zwiększa jonizację i ma tendencję do wyrównywania odpowiedzi sygnału molowego w szerokim zakresie struktur glikanowych 18,19. Ponadto permetylacja jednoznacznie oznacza końcowe i podstawione ugrupowania monosacharydowe charakterystycznymi masami, zwiększając w ten sposób wyjaśnienie strukturalne 20-23. Na przykład kwaśne glikany są na ogół trudne do wykrycia przez stwardnienie rozsiane jako gatunki niepermetylowane. Chociaż kwaśne glikany mogą być wykrywane w trybie jonów ujemnych przez MS, niemożliwe jest wykrycie zarówno kwaśnych, jak i obojętnych glikanów w tym samym trybie jonowym. Główną zaletą permetylacji glikanów jest to, że wszystkie wolne grupy hydroksylowe (OH) na podstawnikach monosacharydowych glikanu zostaną pokryte grupą metylową (OCH3 lub OMe), dzięki czemu ładunki glikanu sjalowanego są neutralizowane, dzięki czemu są tak samo wykrywalne jak permetylowane neutralne (azjatyckie) glikany. Jednak hydroksylowe ugrupowania siarczanowe na sulfoglikanach są odporne na permetylację, co powoduje zatrzymanie ładunku anionowego, co hamuje jonizację i zmniejsza czułość. Ta supresja uniemożliwia obecnie kompleksową analizę glikomiczną bardzo złożonych glikoprotein, takich jak mucyny, które zawierają dużą ilość siarczanowych glikanów 24-26.

Ostatnie doniesienia na temat oczyszczania siarczanowych glikanów używały naładowanej, odwróconej chromatografii fazowej do oczyszczania i oddzielania permetylowanych glikanów przed analizą MALDI. Metoda ta polega na całkowitym oddzieleniu glikanów siarczanowych i niesiarczanowych przy użyciu różnych faz ruchomych do elucji, co jak stwierdziliśmy, jest mniej rygorystyczne niż podział faz organicznych. W związku z tym przedstawiono nowe techniki odpowiednie do wykrywania i wzbogacania sulfoglikanów. Techniki te pozwalają na ilościowy odzysk siarczanowanych glikanów w fazie wodnej po ekstrakcji woda:DCM (dichlorometan), która jest rutynowo wykonywana pod koniec reakcji permetylacji glikanów 27. Co ważne, to solidne oddzielenie permetylowanych sulfoglikanów od mieszaniny permetylowanych glikanów niesiarczanowych jednocześnie wzbogaca o naładowane gatunki, jednocześnie upraszczając wzorce fragmentacji MS2. Przedstawiono również kompleksowy protokół ulepszonej analizy glikanów sprzężonych z O-żelem w żelu. Ulepszony protokół zwiększa odzysk glikanów, zwiększa ilość informacji strukturalnych możliwych do uzyskania dzięki analizie permetylowanych glikanów za pomocą MSn oraz poprawia czułość analiz sulfoglykomicznych stosowanych do niezbędnych glikoprotein wyizolowanych ze źródeł biologicznych.

Ten protokół jest przeznaczony do analizy całych ekstraktów glikoproteinowych lub specyficznej glikoproteiny o znaczeniu zmiennym rozpoznanej przez SDS-PAGE i składa się z trzech procedur eksperymentalnych; A) oczyszczanie żelem, B) redukcyjna eliminacja β w żelu oraz C) permetylacja glikanów. Celem jest uzyskanie kompleksowych danych glikomicznych sprzężonych z O, dla glikoprotein zebranych z pierwotnych źródeł o znaczeniu biologicznym (ryc. 1). Glikoproteiny oddzielone za pomocą SDS-PAGE są wizualizowane przez barwienie, a interesujące prążki są wycinane, a powstała opaska żelowa jest krojona na małe kawałki. Kawałki żelu są odbarwiane i poddawane płukaniu octanem etylu w celu usunięcia zanieczyszczeń żelowych (rysunek 2A). Uwalnianie glikanów osiąga się poprzez redukcyjną eliminację β w żelu (ryc. 2B), a uwolnione glikany są permetylowane. Ekstrakcja wodno-organiczna po permetylacji ilościowo oddziela anionowe siarczanowane glikany od niesiarczanowych glikanów obojętnych (ryc. 2C). Redukcyjna eliminacja β w żelu w połączeniu z ekstrakcją wodno-organiczną umożliwia scharakteryzowanie glikanów i sulfoglikanów sprzężonych z O, uwalnianych z niewielkich ilości glikoproteiny oddzielonych przez SDS-PAGE. Przegląd strategiczny podsumowano na rysunku 1, a szczegóły przedstawiono na rysunku 2. Ponadto część odbarwionych i przemytych kawałków żelu może być wykorzystana do identyfikacji białek za pomocą standardowych technik proteomicznych LC-MS/MS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Obawy dotyczące bezpieczeństwa w laboratorium

Zgodnie ze standardowymi najlepszymi praktykami laboratoryjnymi, przestrzegaj następujących zasad. Przechowuj wszystkie rozpuszczalniki organiczne w odpowiednich miejscach. Wszystkie odpady należy przechowywać w pojemnikach na odpady chemiczne z wyraźnym oznakowaniem składu chemicznego. Ponieważ kilka odczynników stosowanych w tych protokołach jest potencjalnie rakotwórczych lub generuje lotne gazy palne, wszystkie odczynniki należy przechowywać w dygestoria z wentylacją. Podczas pracy z rozpuszczalnikami organicznymi należy nosić środki ochrony osobistej, takie jak rękawice, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Procedura dla O-glikomów w żelu. (A) Białka będące przedmiotem zainteresowania są rozpoznawane za pomocą SDS-PAGE, wykrywane za pomocą odpowiednich procedur barwienia (Coomassie lub srebro) i wycinane. Wycięte kawałki żelu są krojone w małe kostki, odbarwiane i myte octanem etylu w celu zmniejszenia zanieczyszczeń, które zakłócają późniejszą analizę MS. Część wycinka żelu może być zarezerwowana do trawienia tryptycznego w żelu, a następnie charakterystyki proteomicznej za pomocą LC-MS / MS. (B) Glikany połączone z O są uwalniane z rozwiązanych glikoprotein przez redukcyjną eliminację β w żelu. Niezbędne kroki obejmują odsalanie i usuwanie boranów za pomocą azeotropu z metanolem. (C) Glikany sprzężone z O, uwalniane w wyniku redukcyjnej eliminacji β, są permetylowane, a następnie dzielone na fazę wodną i organiczną. Sulfoglikany są odzyskiwane ilościowo w górnej (wodnej) fazie, podczas gdy obojętne i sjalilowane glikany rozdzielają się na dolną warstwę (DCM).

figure-protocol-2
Rysunek 2. Szczegółowy schemat blokowy dla glikomiki w żelu. Każdy etap eksperymentu pokazany na rysunku 1 jest zilustrowany indywidualnie. (A) odbarwienie żelu i ekstrakcja EtOAc, (B) bezpośrednia redukcyjna eliminacja β w żelu w celu uwolnienia glikanu sprzężonego z O, oraz (C) permetylacja i podział faz. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję rysunku.

1. Wycinanie żelu i usuwanie zanieczyszczeń pochodzących z żelu

  1. Przed przystąpieniem do zabiegu należy przygotować substancje chemiczne i odczynniki wymienione w Wykazie Materiałów.
  2. Rozpuść białko w żelu SDS-PAGE przy użyciu standardowych systemów buforowych Tris-Glycine. Białka rozwiązywane w barwieniu za pomocą barwienia Coomassie Brilliant Blue lub Silver Stain. Ogólnie rzecz biorąc, odzysk glikanów związanych z O z żeli barwionych srebrem wynosi około 80-90% odzysku osiągniętego z barwionych żeli Coomassie.
  3. Po elektroforezie umieść żel na szklanej płytce i wytnij interesujący Cię obszar za pomocą czystego skalpela lub żyletki.
  4. Aby zwiększyć wydajność O-glikanów, przenieś interesującą nas opaskę żelu na inną szklaną płytkę i pokrój wycięty kawałek żelu w kostkę o średnicy około 2 mm. Unikaj tworzenia kawałków żelu mniejszych niż kostki 1 mm, ponieważ odzysk glikanów jest zmniejszony. Przenieś małe kawałki żelu do zakręcanej szklanej rurki (13 x 100 mm) za pomocą mikroszpatułki ze stali nierdzewnej.
  5. Dodać 1 ml 25 mM wodorowęglanu amonu (AMBIC, NH4HCO3) do probówki z próbką, zakryć szklaną probówkę zakrętką wyłożoną teflonem i delikatnie wymieszać, przesuwając probówkę, a następnie odstawić na 10 minut. Nie stosuj energicznego mieszania, aby uniknąć rozerwania kawałków żelu.
  6. Ostrożnie wyjmij AMBIC ze szklanej rurki za pomocą szklanej pipety Pasteura lub pipety wyposażonej w bardzo długą plastikową końcówkę. Unikaj rozbijania i przenoszenia małych kawałków żelu podczas wyjmowania roztworu AMBIC.
  7. Dodaj 1 ml acetonitrylu (ACN) do szklanej probówki, nakrętki i delikatnie wymieszaj, przesuwając probówkę, a następnie odstaw na 10 minut. Upewnij się, że kawałki żelu są całkowicie pokryte rozpuszczalnikiem. W razie potrzeby zepchnąć kawałki żelu ze ścianki probówki do rozpuszczalnika za pomocą końcówki pipety.
  8. Odpipetuj ACN ze szklanej probówki i powtarzaj kroki 1,5–1,7, aż jasnoniebieski kolor zostanie wyeliminowany. W razie potrzeby powtórz co najmniej pięć sekwencyjnych myć AMBIC/ACN. W przypadku żeli barwionych srebrem użyj zestawu do usuwania plam. Przejdź do następnego kroku, gdy cząsteczka żelu zmieni kolor na jednolicie biały podczas przebywania w ACN.
  9. Odpipetować płyn ze szklanej probówki, ponownie zamknąć probówkę, dodać 1 ml AMBIC i odstawić na 5 minut.
  10. Usunąć AMBIC i dodać 2 ml octanu etylu (EtOAc) do szklanej probówki. Zakryj probówkę nakrętką wyłożoną teflonem i umieść w temperaturze 4 °C na noc z mieszaniem od końca do końca lub alternatywnie wykonaj trzy prania EtOAc w temperaturze pokojowej przez 30 minut każde. Im dłuższe mycie EtOAc, tym skuteczniejsze usuwanie zanieczyszczeń.
  11. Usunąć ostatnie płukanie EtOAc i wykonać trzy płukania, każde z 2 mlH2O. Całkowite usunięcie EtOAc zapewni solidną reakcję redukcyjnej eliminacji β.
  12. Odpipetować H2O i odwodnić żel, przemywając go raz 1 ml ACN.
    UWAGA: Po wyschnięciu odwodnione żele są gotowe do eliminacji w żelu β. Odwodnione kawałki żelu można przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
  13. Zatrzymaj proces mycia na dowolnym etapie i przechowuj kawałki żelu w temperaturze 4 °C przez noc, niezależnie od tego, jaki bufor lub roztwór zostanie nałożony na żel (AMBIC, ACN,H2O). Ponowne przygotowanie próbki należy wznowić w dowolnym momencie w ciągu najbliższych 2 dni.
  14. Użyj części odbarwionych i odwodnionych kawałków żelu do identyfikacji białek za pomocą standardowych metod proteomicznych.

2. Uwalnianie O-glikanów w żelu przez redukcyjną eliminację β

  1. Przygotować roztwór podstawowy 1 M wodorotlenku sodu (NaOH) przy użyciu 50% NaOH lub stałego NaOH i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
    1. Pobrać 5,2 ml 50% NaOH (lub 4 g stałego NaOH) i dostosować objętość do 100 ml, aby uzyskać 1 M roztwór NaOH. Rozcieńczyć 1 M roztwór podstawowy NaOH do 100 mM NaOH, który może być przechowywany w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy bez utraty wydajności w reakcjach redukcyjnej eliminacji β.
  2. Przygotować 2 M borowodorek sodu (NaBH4) w 100 mM NaOH. Rozpuścić 38 mg NaBH4 w 0,5 ml 100 mM NaOH. Zazwyczaj do każdej próbki należy użyć 0,5–1,0 ml roztworu borowodorku. Zmieniaj objętość roztworu reakcyjnego w zależności od ilości wysuszonych kawałków żelu przygotowanych w kroku 1. Spodziewaj się użycia 0,5 ml roztworu borowodorku na 1-2 wycięte kawałki żelu (krok 1.3).
  3. Dodać 500 μl 100 mM NaOH do odwodnionych kawałków żelu i odstawić na 3-5 minut na lód w celu zrównoważenia żelu do podstawowych warunków, które zwiększają odzysk glikanów.
  4. Dodać 500 μl 2 M NaBH4 w 100 mM NaOH, otrzymując końcowe stężenia 1 M NaBH4 w 100 mM NaOH. Delikatnie wymieszać probówkę i inkubować w temperaturze 45 °C przez 18 godzin.
    1. W ciągu pierwszej godziny inkubacji delikatnie mieszaj probówkę co 15 minut. Unikaj silnego mieszania, ponieważ może ono spowodować rozdrobnienie kawałków żelu. Przeprowadzić reakcję w dobrze zbalansowanym inkubatorze/piecu lub w bloku grzewczym. Upewnij się, że kawałki żelu są pokryte roztworem reakcyjnym.
  5. Zatrzymaj reakcję, wyjmując probówkę z próbką z inkubatora lub bloku grzewczego i umieszczając ją na lodzie.
    UWAGA: Po pozostawieniu reakcji eliminacji β przez 18 godzin, proces odsalania należy przeprowadzić w ciągu tego samego dnia.

3. Odsalanie metodą chromatografii kationowymiennej

  1. Trzymając probówkę z próbką na lodzie, aby zapobiec nadmiernemu tworzeniu się ciepła, powoli dodawaj kroplami 10% kwasu octowego (AcOH), aby zneutralizować zasadę. Delikatnie przetrząsnąć probówkę z próbką między dodatkami AcOH. Uważaj, aby dodawać kwas powoli i kroplami, ponieważ dodanie kwasu spowoduje powstanie "wulkanu" bąbelków. W razie potrzeby odwirować probówkę, aby usunąć pęcherzyki i zapobiec rozlaniu.
    1. W celu usunięcia dużej ilości sodu z mieszaniny reakcyjnej, mieszaninę reakcyjną należy przepuścić przez małą kolumnę kationowymienną (żywica Dowex lub AG-50W-X8, forma H+).
    2. Przed użyciem przepłukać żywicę kationowymienną 1 M NaOH i 1 M HCl w celu usunięcia zanieczyszczeń, które zakłócają analizę MS, nawet jeśli żywica jest klasy analitycznej.
    3. Namocz żywicę w 1 M NaOH i usuń roztwór przez dekantację. Dodaj wodę dejonizowaną, usuń wodę, a następnie dodaj 1 M HCl.
  2. Powtarzaj te kroki, aż roztwór nad żywicą stanie się bezbarwny. Oczyszczoną żywicę umyć wodą dejonizowaną i przechowywać w 5% AcOH w temperaturze 4 °C.
  3. Aby zrobić małą szklaną kolumnę, podrap i złamij końcówkę szklanej pipety Pasteura za pomocą ceramicznego noża, tak aby stożek końcówki pipety miał około 1 cm długości. Rozsuń korek z waty szklanej i popchnij w kierunku końcówki, tworząc podparcie dla łoża żywicy. Zabezpiecz kolumnę pipety za pomocą zacisku lub spinacza do bielizny i umieść na szklanej probówce.
  4. Umyć pustą pipetę 1 ml metanolu (MeOH) i 3 ml 5% AcOH. Zawirować zawiesinę żywicy kationitowej H+ Dowex lub AG50 przechowywaną w 5% AcOH i przenieść wystarczającą ilość gnojowicy, aby wytworzyć 1 ml objętości złoża w kolumnie pipety Pasteura.
  5. Przepłukać kolumnę za pomocą pięciu objętości 5% AcOH. Sprawdź przepływ pod kątem pojawienia się cząstek żywicy i nie używaj kolumny, jeśli zostanie wykryta żywica.
  6. Umieść kolumnę na nowej szklanej rurce z nakrętką (16 x 125 mm) i załaduj próbkę. Zebrać przepływ i wymyć glikany o co najmniej 3 objętościach 5% AcOH do tej samej probówki.
  7. Przykryj tubę Parafilmem i wykonaj małe otwory igłą. Umieścić probówkę z próbką w temperaturze -80 °C lub na suchym lodzie. Po zamrożeniu wysuszyć próbkę przez liofilizację. Wysuszony materiał przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.

4. Usuwanie boranów

  1. Przygotuj 10% AcOH w MeOH. Weź 10 ml lodowatego kwasu octowego i dostosuj objętość do 100 ml z metanolem. Przechowuj ten odczynnik w szklanej butelce z nakrętką wyłożoną teflonem do 6 miesięcy.
  2. Dodać 300 μl 10% AcOH w MeOH do wysuszonej, liofilizowanej probówki z próbką i wirować. Usunąć powstały boran trimetylu przez odparowanie pod strumieniemN2.
    UWAGA: Mieszanie soli boranowych z metanolem w warunkach kwaśnych daje boran trimetylu, który jest związkiem lotnym.
  3. Suszyć pod strumieniemN2 w temperaturze 37 °C. Po wysuszeniu dodać kolejną porcję AcOH w MeOH zgodnie z opisem w kroku 4.2. Suszyć ciecz przez 5 minut pod strumieniem azotu (N2) w temperaturze 37 °C.
    1. Powtórzyć ponowne zawieszenie i suszenie co najmniej 3 razy. Wysuszony materiał przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.

5. Oczyszczanie C18

  1. Zrównoważyć kolumnę z wkładem C18 (wielkość 1 ml, 100 mg żywicy) przy użyciu trzech objętości ACN i pięciu objętości 5% AcOH. Przyspieszyć przepływ roztworów równoważących poprzez zastosowanie łagodnego dodatniego ciśnienia powietrza.
  2. Dodać 500 μl 5% AcOH do odsolonej i wolnej od boranu probówki z próbką i rozpuścić przez wir.
  3. Załadować zawieszoną próbkę do zrównoważonej kolumny C18 i zebrać przepływ do szklanej rurki z nakrętką (13 x 100 mm). Eluować O-glikany za pomocą 3 ml 5% AcOH do tej samej probówki.
  4. Sfilmować probówkę, zrobić małe otwory małą igłą lub użyć luźno zamkniętej nasadki wyłożonej PTFE do przykrycia probówki i zamrozić próbkę w temperaturze -80 °C lub na suchym lodzie. Usuń rozpuszczalnik przez liofilizację. Wysuszoną próbkę należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.

6. Przygotowanie bazy do permetylacji

UWAGA: Aby uzyskać solidną permetylację, przygotuj świeżą zawiesinę NaOH. Wszystkie naczynia szklane używane w reakcjach permetylacji powinny być dokładnie oczyszczone.

  1. Aby przygotować odczynnik bazowy do permetylacji, dodaj 400 μl 50% NaOH do czystej szklanej zakręcanej probówki (13 x 100 mm). Dodać 800 μl bezwodnego MeOH i odwirować.
  2. Dodać 4 ml bezwodnego dimetylosulfotlenku (DMSO) i odwirować, aby wytworzyć biały osad.
  3. Wirować przy 600 x g przez 1 minutę w celu osadu. Odpipetować supernatant i wyrzucić. Dodać dodatkowe 4 ml bezwodnego DMSO do osadu. Wir.
  4. Powtórzyć kroki 6.2 i 6.3 co najmniej trzy razy więcej lub do momentu, gdy nie utworzy się biały osad.
  5. Rozpuścić granulowaną bazę w 3 ml bezwodnego DMSO i delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół czystą pipetą Pasteura.
  6. Natychmiast użyj bazy do następnej reakcji permetylacji, ponieważ nie można jej przechowywać.

7. Permetylacja uwolnionych glikanów

  1. Dodać 200 μl bezwodnego DMSO do próbki oczyszczonej z C18 i odwirować lub poddać sonikacji w celu ponownego zawieszenia.
  2. Dodać 300 μl zawiesiny zawiesiny zasadowej do próbki i natychmiast dodać 100 μl jodometanu (MeI). Uszczelnij probówkę nakrętką wyłożoną teflonem i energicznie mieszaj przez 5 minut wirem.
  3. Aby zatrzymać reakcję permetylacji, dodaj 2 ml 5% AcOH na lód i wiruj. Pipetować roztwór w górę i w dół 5 razy, aby zmniejszyć pozostałą objętość MeI przez odparowanie.
    UWAGA: AcOH neutralizuje roztwór, a usunięcie MeI zwiększa wydajność ekstrakcji siarczanowanych glikanów do fazy wodnej podczas podziału fazy.
  4. Dodać 2 ml dichlorometanu (DCM) i odwirować. Wirować przy 600 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej w celu oddzielenia fazy wodnej i organicznej.
  5. Przenieść wierzchnią warstwę (fazę wodną, która zawiera większość permetylowanych glikanów siarczanowych) do nowej szklanej probówki (13 x 100 mm).
  6. Dodać 2 mlH2Odo fazy organicznej i odwirować. Wirować przy 600 x g przez 1 minutę w celu oddzielenia fazy wodnej i organicznej i połączyć tę drugą fazę wodną z pierwszą fazą wodną (etap 7.5).
  7. Kroki 7.6 i 7.5 powtórzyć jeszcze trzy razy, ale nie ma potrzeby zapisywania faz wodnych powstałych w wyniku kolejnych podziałów.
  8. Usunąć ostatnią górną warstwę (faza wodna) tak bardzo, jak to możliwe, z dolnej warstwy (faza organiczna) i przenieść dolną warstwę (faza organiczna) do oddzielnej nowej szklanej probówki za pomocą czystej pipety Pasteura.
  9. Wysuszyć fazę organiczną pod strumieniemN2 w temperaturze 42 °C.
  10. Przykryj tubkę Parafilm i przechowuj w temperaturze -20 °C do momentu użycia.

8. C18 Oczyszczanie permetylowanych siarczanowanych O-glikanów z fazy wodnej

  1. Zrównoważyć kolumnę wkładu C18 trzema objętościami ACN i pięcioma objętościami 5% AcOH.
  2. Załadować na kolumnę fazy wodne zebrane i połączone z kroków 7.5 i 7.6.
  3. Przemyć kolumnę 10 mlH2Ow celu odsalenia.
  4. Odeluj permetylowane siarczanowane O-glikany do nowej szklanej probówki z 2 ml 50% ACN. Użyj dodatkowej elucji z 85% ACN, aby zwiększyć odzysk permetylowanych siarczanowanych O-glikanów na większych oligosacharydach.
  5. Suche eluaty pod strumieniem azotu w temperaturze 42 °C.
  6. Wysuszony materiał należy przechowywać w temperaturze -20 °C do 6 miesięcy przed analizą MS.

9. Spektrometria mas permetylowanych O-glikanów

  1. Analizować permetylowane O-glikany przez bezpośrednią infuzję do odpowiedniego spektrometru masowego przy użyciu źródła nanoelektrorozpylania przy natężeniu przepływu strzykawki 0,40–0,60 μl/min w temperaturze kapilarnej 210 °C. W przypadku fragmentacji przez CID w MS/MS i MSn przyrządu do pułapki jonowej należy zastosować 30–40% energii zderzenia.
  2. W przypadku trybu jonów ujemnych rozpuścić permetylowane siarczanowane O-glikany w 50 μl metanolu/2-propanolu/1-propanolu/13 mM wodnego octanu amonu (16:3:3:2 objętościowo). W przypadku trybu jonów dodatnich rozpuść permetylowane obojętne/sjalowane O-glikany w 50 μl 1 mM wodorotlenku sodu w metanolu/wodzie (1:1).
  3. Skorzystaj z funkcji mapowania całkowitej ilości jonów (TIM) i skanowania utraty neutralnej (NL scan) pakietu oprogramowania Xcalibur w wersji 2.0 do analizy MSn, aby scharakteryzować poszczególne struktury O-glikanów 13,19.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Efekt obróbki octanem etylu przed redukcją β w żelu

Reprezentatywne spektrum masowe permetylowanych próbek glikanów sprzężonych z O, uwolnionych z bydlęcej mucyny za pomocą redukcyjnej eliminacji β w żelu, pokazano na rysunku 3. Mycie kawałków żelu EtOAc skutecznie usuwa zanieczyszczenia SDS i poliakrylu, które zakłócają późniejszą analizę MS 27.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Połączenie redukcyjnej eliminacji β w żelu z ekstrakcją wodno-organiczną zwiększa czułość i głębię danych strukturalnych, które można uzyskać w celu scharakteryzowania siarczanowych i niesiarczanowych glikanów sprzężonych z O, zebranych z niewielkich ilości glikoprotein typu mucynowego oddzielonych od innych białek za pomocą SDS-PAGE. Zasadnicze postępy w zakresie podejść technicznych przedstawionych w tym badaniu to: (a) łatwe usuwanie zanieczyszczeń pochodzących z żelu za pomocą prostych etapów mycia; b) odzysk ilościo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez P01HL107151 grantowe od NHLBI/NIH. Autorzy wyrażają również wdzięczność za wsparcie i dostęp do oprzyrządowania zapewnione dzięki P41GM103490 grantowej z NIGMS/NIH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Woda, woda dejonizowanaSigma-Aldrich 270733-4L- CHROMASOLV - do HPLC
Kwas octowy, GlacialFisherA38-500Certyfikowany ACS ≥ 99,7% w/w
MetanolSigma-Aldrich 34860-4L-RCHROMASOLV, do HPLC, ≥ 99,9%
Wodorowęglan amonuFluka09830-500GBioUltra, ≥ 99,5% (t), Etap 1
AcetonitrylSigma-Aldrich 34998-4LCHROMASOLV Plus, do HPLC, ≥ 99,9%, Krok 1
Octan etyluFluka34972-1L-RLC-MS CHROMASOLV, Krok 1
Borowodorek soduAldrich213462-25GReagentPlus, 99%, Etap 2
JodometanSigma-Aldrich 289566-100GReagentPlus, 99,5%,  Krok 6.  Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C do momentu użycia.  Przed użyciem usiąść w temperaturze pokojowej.
Wodorotlenek sodu, 50% w/wFisherSS254-1, Krok 6
Dimetylosulfotlenek, bezwodnySigma-Aldrich 276855-1LBezwodny, ≥ 99,9%, Step 6
Metanol, bezwodnySigma-Aldrich 322415-100MLBezwodny, 99,8%, Krok 6
DichlorometanSigma-Aldrich 34856-4LCHROMASOL®, do HPLC, ≥ 99,8%, zawiera amylen jako stabilizator, Krok 7
Dowex 50WX8 wodór w postaci 100-200  siatkaSigma-Aldrich 217506-500GStep 3
AG 50W-X8 Żywica Bio-Rad142-1441Krok 3
BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Kolumna ekstrakcyjna do fazy stałej, PP, oktadecyl (C18) Odwrócona fazaJT BakerJT-7020-01Krok 5 i 8
7,5% Mini-PROTEAN TGX Prefabrykowany żel Bio-RadStep 1
Bio-bezpieczna plama Coomassie Bio-Rad161-0786G-250, Step 1
Zestaw srebrnych barwników do spektrometrii masPierce24600Step 1
Zestaw oligosacharydów (maltotrioza, Dp3: R474140)Supelco 47265
Zestaw oligosacharydów (maltotetraoza, Dp4: R474135)Supelco 47265
Jednorazowe pipety Pasteura, szklane, z krótką końcówkąVWR14673-010Umyć przed użyciem
PYREX 13 x 100 mm Jednorazowe rurki hodowlane z okrągłym dnemCorning99447-13Umyć przed użyciem
PYREX 16 x 125 mm Jednorazowe rurki hodowlane z okrągłym dnemCorning99447-16Umyć przed użyciem
Fenolowe nakrętki/zamknięcia z gumową wkładką pokrytą PTFEKimble45066C-13Umyć przed użyciem
Fenolowe nakrętki/zamknięcia z gumową wkładką pokrytą PTFEKimble45066C-15Umyć przed użyciem
Strzykawka Hamilton HPLCHAMILTON81265objętość 500  μ l, rozmiar igły 22 G
Strzykawka Hamilton HPLCHAMILTON81165objętość 250  μ l, rozmiar igły 22 G
Strzykawka Hamilton HPLCHAMILTON81065objętość 100  μ l, rozmiar igły 22s G
Strzykawka Hamilton HPLCHAMILTON80965objętość 50  μ l, rozmiar igły 22s G
Strzykawki kalibrowane HamiltonHAMILTON80300objętość 10  μ l, rozmiar igły 26s G
Szkło do szalek Petriego 100 mm x 15 mmGSC INTERNATIONAL INC1500-4Umyć przed użyciem, Krok 1
Ostrza chirurgiczne Bard-ParkerFisher371310Krok 1
Moduł grzewczy/mieszający Reacti-ThermPierce18870Krok 1, 4 i 7
Bloki grzewczeFisher125DKrok 2
Wełna borokrzemianowa z włókna szklanego Pyrex o wielkości porów 8  μ mAldrichCLS3950Step 3
Nóż do topionej krzemionkiObcinak do rurekalltech3194Step 3
Wirówki wielorurowe VWR444-7063Krok 6
Liofilizator 25EL FreezemobileWirówka Virtis25EL
VWRClinical 50
LTQ Orbitrap DiscoveryThermo Fisher Scientific
Certyfikat

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Varki, A. Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct. Glycobiology. 3 (2), 97-130 (1993).
  2. Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
  3. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
  4. Lowe, J. B., Marth, J. D. A genetic approach to Mammalian glycan function. Annu. Rev. Biochem. 72, 643-691 (2003).
  5. Yan, A., Lennarz, W. J. Unraveling the mechanism of protein N-glycosylation. J. Biol. Chem. 280 (5), 3121-3124 (2005).
  6. Washburn, M. P. Utilisation of proteomics datasets generated via multidimensional protein identification technology (MudPIT). Brief Funct. Genomic Proteomic. 3 (3), 280-286 (2004).
  7. Rosenfeld, J., Capdevielle, J., Guillemot, J. C., Ferrara, P. In-gel digestion of proteins for internal sequence analysis after one- or two-dimensional gel electrophoresis. Anal. Biochem. 203 (1), 173-179 (1992).
  8. Hellman, U., Wernstedt, C., Gonez, J., Heldin, C. H. Improvement of an 'In-Gel' digestion procedure for the micropreparation of internal protein fragments for amino acid sequencing. Anal. Biochem. 224 (1), 451-455 (1995).
  9. Morelle, W., Canis, K., Chirat, F., Faid, V., Michalski, J. C. The use of mass spectrometry for the proteomic analysis of glycosylation. Proteomics. 6 (14), 3993-4015 (2006).
  10. Mortz, E., Sareneva, T., Haebel, S., Julkunen, I., Roepstorff, P. Mass spectrometric characterization of glycosylated interferon-gamma variants separated by gel electrophoresis. Electrophoresis. 17 (5), 925-931 (1996).
  11. Kuster, B., Wheeler, S. F., Hunter, A. P., Dwek, R. A., Harvey, D. J. Sequencing of N-linked oligosaccharides directly from protein gels: in-gel deglycosylation followed by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and normal-phase high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 250 (1), 82-101 (1997).
  12. Kuster, B., Mann, M. 18O-labeling of N-glycosylation sites to improve the identification of gel-separated glycoproteins using peptide mass mapping and database searching. Anal. Chem. 71 (7), 1431-1440 (1999).
  13. Aoki, K., et al. The diversity of O-linked glycans expressed during Drosophila melanogaster development reflects stage- and tissue-specific requirements for cell signaling. J. Biol. Chem. 283 (44), 30385-30400 (2008).
  14. Kozak, R. P., Royle, L., Gardner, R. A., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. Suppression of peeling during the release of O-glycans by hydrazinolysis. Anal. Biochem. 423 (1), 119-128 (2012).
  15. Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. Small-scale analysis of O-linked oligosaccharides from glycoproteins and mucins separated by gel electrophoresis. Anal. Chem. 74 (23), 6088-6097 (2002).
  16. Thomsson, K. A., Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. MUC5B glycosylation in human saliva reflects blood group and secretor status. Glycobiology. 15 (8), 791-804 (2005).
  17. Taylor, A. M., Holst, O., Thomas-Oates, J. Mass spectrometric profiling of O-linked glycans released directly from glycoproteins in gels using in-gel reductive β-elimination. Proteomics. 6 (10), 2936-2946 (2006).
  18. Anumula, K. R., Taylor, P. B. A comprehensive procedure for preparation of partially methylated alditol acetates from glycoprotein carbohydrates. Anal. Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
  19. Aoki, K., Perlman, M., Lim, J. M., Cantu, R., Wells, L., Tiemeyer, M. Dynamic developmental elaboration of N-linked glycan complexity in the Drosophila melanogaster embryo. J. Biol. Chem. 282 (12), 9127-9142 (2007).
  20. Domon, B., Costello, C. E. A Systematic Nomenclature for Carbohydrate Fragmentations in Fab-Ms Ms Spectra of Glycoconjugates. Glycoconj. J. 5 (4), 397-409 (1988).
  21. Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn. Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).
  22. Lapadula, A. J., et al. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 3. OSCAR: an algorithm for assigning oligosaccharide topology from MSn data. Anal. Chem. 77 (19), 6271-6279 (2005).
  23. Ashline, D. J., et al. Carbohydrate structural isomers analyzed by sequential mass spectrometry. Anal. Chem. 79 (10), 3830-3842 (2007).
  24. Thomsson, K. A., et al. The salivary mucin MG1 (MUC5B) carries a repertoire of unique oligosaccharides that is large and diverse. Glycobiology. 12 (1), 1-14 (2002).
  25. Yu, S. Y., Wu, S. W., Hsiao, H. H., Khoo, K. H. Enabling techniques and strategic workflow for sulfoglycomics based on mass spectrometry mapping and sequencing of permethylated sulfated glycans. Glycobiology. 19 (10), 1136-1149 (2009).
  26. Yu, S. Y., et al. Priming mass spectrometry-based sulfoglycomic mapping for identification of terminal sulfated lacdiNAc glycotope. Glycoconj J. 30 (2), 183-194 (2013).
  27. Kumagai, T., Katoh, T., Nix, D. B., Tiemeyer, M., Aoki, K. In-gel β-elimination and aqueous-organic partition for improved O- and sulfoglycomics. Anal. Chem. 85 (18), 8692-8699 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Glikany typu Oredukcyjna beta eliminacjarozdzia SDS PAGEprzemywanie fragment w elupermetylowanie glikan wanaliza rozdzia u fazowegodetekcja spektrometri mascharakterystyka glikan w siarczanowychusuwanie zanieczyszczeoczyszczanie na kolumnie C18

Powiązane artykuły