Artykuł metodologiczny

Połączenie sortowania magnetycznego komórek macierzystych i testów fluktuacji w celu analizy niestabilności genomu podczas starzenia się komórek mitotycznych u Saccharomyces cerevisiae

14.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51850

⸱

16 października 2014

 , 
1Department of Biological Sciences, Rensselaer Polytechnic Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Szybkość mutacji w młodych komórkach Saccharomyces cerevisiae mierzona za pomocą testów fluktuacyjnych służy do przewidywania częstości mutacji dla komórek macierzystych w różnym wieku replikacji. Sortowanie magnetyczne i cytometria przepływowa są następnie wykorzystywane do pomiaru rzeczywistej częstości mutacji i wieku komórek macierzystych w celu zidentyfikowania wszelkich odchyleń od przewidywanych częstości mutacji.

Streszczenie

Saccharomyces cerevisiae to doskonały system modelowy do badania mechanizmów i konsekwencji niestabilności genomu. Informacje uzyskane z tego modelu drożdży są istotne dla wielu organizmów, w tym ludzi, ponieważ czynniki naprawy DNA i odpowiedzi na uszkodzenia DNA są dobrze zachowane u różnych gatunków. Jednak S. cerevisiae nie został jeszcze wykorzystany do pełnego wyjaśnienia, czy tempo akumulacji mutacji zmienia się wraz ze wzrostem wieku replikacyjnego (mitotowego) ze względu na ograniczenia techniczne. Na przykład pomiary żywotności replikacji drożdży za pomocą mikromanipulacji obejmują bardzo małe populacje komórek, co uniemożliwia wykrycie rzadkich mutacji. Opracowano metody genetyczne wzbogacania komórek macierzystych w populacjach poprzez indukowanie śmierci komórek potomnych, ale rozmiary populacji są nadal ograniczone przez częstotliwość, z jaką występują losowe mutacje, które zagrażają systemom selekcyjnym. Obecny protokół wykorzystuje sortowanie magnetyczne znakowanych powierzchniowo komórek macierzystych drożdży w celu uzyskania wystarczająco dużych populacji starzejących się komórek macierzystych, aby określić ilościowo rzadkie mutacje poprzez selekcję fenotypową. Częstość mutacji, mierzona za pomocą testów fluktuacji, i częstości mutacji są najpierw ustalane dla młodych komórek i wykorzystywane do przewidywania częstości mutacji w komórkach macierzystych w różnym wieku replikacyjnym. Częstość mutacji jest następnie określana dla posortowanych komórek macierzystych, a wiek komórek macierzystych określa się za pomocą cytometrii przepływowej poprzez barwienie odczynnikiem fluorescencyjnym, który wykrywa blizny po pąkach powstałe na powierzchni komórek podczas podziału komórki. Porównanie przewidywanych częstości mutacji w oparciu o liczbę podziałów komórkowych z częstotliwościami obserwowanymi eksperymentalnie dla komórek macierzystych w danym wieku replikacyjnym może następnie określić, czy występują związane z wiekiem zmiany w tempie akumulacji mutacji. Warianty tego podstawowego protokołu zapewniają środki do badania wpływu zmian w określonych funkcjach genów lub określonych warunkach środowiskowych na akumulację mutacji w celu rozwiązania problemów leżących u podstaw niestabilności genomu podczas starzenia replikacyjnego.

Wprowadzenie

Mikroorganizmy, takie jak drożdże Saccharomyces cerevisiae, są doskonałymi modelami do badania tempa mutacji, ale te modele nie zostały w pełni wykorzystane do badania akumulacji mutacji podczas mitotycznego starzenia się komórek. Przypuszcza się, że akumulacja mutacji w genomie jądrowym przyczynia się do starzenia się, powodując postępującą utratę (lub zmienność) funkcji genów1. Możliwość wykorzystania systemu mikrobiologicznego do badania mechanizmów i konsekwencji akumulacji mutacji podczas starzenia się może znacznie przyspieszyć identyfikację czynników genetycznych i środowiskowych wpływających na ten proces, ze względu na łatwe systemy genetyczne i łatwość ilościowego określania rzadkich zmian fenotypowych w mikroorganizmach. Czynniki naprawy DNA i białka odpowiedzi na uszkodzenia DNA są dobrze zachowane u różnych gatunków2, a podstawowe podobieństwa w starzeniu się organizmów zostały zidentyfikowane dla organizmów tak różnych, jak S. cerevisiae i ssaki3, co sprawia, że prawdopodobne jest, że wyniki uzyskane z badań na drożdżach będą miały znaczenie dla starzenia się wielu organizmów.

Badania nad starzeniem się S. cerevisiae wykorzystują dwa modele starzenia, które mierzą starzenie chronologiczne lub replikacyjne starzenie komórek. Starzenie chronologiczne charakteryzuje się postępującą utratą żywotności w populacjach komórek drożdży, które są w stanie niedzielącym (faza stacjonarna) z powodu wyczerpania składników odżywczych3. Model chronologicznego starzenia się został wykorzystany do wykazania, że mutacje kumulują się wraz ze wzrostem wieku4 lat, ponieważ w tym modelu łatwo można uzyskać duże populacje komórek w celu przeprowadzenia selekcji fenotypowej dla zmutowanych komórek. W tym przypadku wydaje się, że na akumulację mutacji wpływają szlaki sygnalizacji wzrostu i stres oksydacyjny5, a każdy z tych czynników jest istotny dla zrozumienia starzenia się u wielokomórkowych eukariontów3. Model starzenia replikacyjnego wykorzystuje asymetryczny podział między komórkami macierzystymi i potomnymi S. cerevisiae do badania starzenia się zachodzącego wraz z kolejnymi generacjami komórek3. Starzenie replikacyjne drożdży często mierzono za pomocą mikromanipulacji małymi populacjami komórek matki i córki, a ostatnio za pomocą mikroskopii wideo małych populacji komórek drożdży w urządzeniach mikroprzepływowych6,7. Ograniczone rozmiary populacji sprawiają, że podejścia te nie nadają się do badania akumulacji mutacji podczas starzenia się mitotycznego, chyba że informacje o całym genomie są uzyskiwane z pojedynczych komóreklub mierzone są zmiany genetyczne o bardzo wysokiej częstotliwości8. Sekwencjonowanie całego genomu pojedynczych komórek dostarcza obszernych zestawów danych do badania akumulacji mutacji, ale systemy selekcji fenotypowej mają tę ważną zaletę, że zapewniają środki do pomiaru wskaźników mutacji w celu zbadania mechanizmów leżących u podstaw akumulacji mutacji. Badania mające na celu zbadanie częstości i częstości mutacji poprzez selekcję fenotypową w haploidalnych szczepach drożdży podczas starzenia replikacyjnego nie zostały jeszcze opublikowane.

Wskaźniki mutacji są zwykle mierzone za pomocą testów fluktuacji9. Wartości częstości mutacji odzwierciedlają całkowitą liczbę komórek zawierających mutację w sekwencji genu w populacji. Obejmuje to komórki, w których występują niezależne mutacje i wszelkie potomstwo tych komórek, które po prostu dziedziczą istniejące wcześniej mutacje. Natomiast wskaźniki mutacji mierzone za pomocą testów fluktuacji reprezentują liczbę niezależnych mutacji, które pojawiają się nowo w każdym pokoleniu komórek. Testy te zazwyczaj obejmują inokulację wielu powtórzonych kultur przy niskiej gęstości komórek w celu zmniejszenia prawdopodobieństwa dodania komórek z wcześniej istniejącymi mutacjami w sekwencji docelowej, wyhodowania kultur do poziomu bliskiego nasycenia i identyfikacji zmutowanych komórek przez wzrost na selektywnej pożywce. Liczba zmutowanych komórek zidentyfikowanych w populacjach replik jest następnie wykorzystywana w jednym z kilku modeli matematycznych w celu oszacowania liczby niezależnych mutacji, które powstały podczas wzrostu9. Porównanie liczby niezależnych mutacji ze średnią wielkością populacji stanowi miarę wskaźnika mutacji. U S. cerevisiae częstość i tempo mutacji są często mierzone za pomocą genów URA3 i CAN1, ponieważ mutacje powodujące utratę funkcji w tych genach wytwarzają selektywne fenotypy. Utrata funkcji URA3 sprawia, że komórki stają się odporne na kwas 5-fluoroorotyczny (5-FOA), ponieważ białko kodowane przez URA3 przekształca 5-FOA w toksyczną cząsteczkę10. Utrata funkcji CAN1 pozwala komórkom uodpornić się na kanawaninę, toksyczny analog argininy, ponieważ białko kodowane przez CAN1 transportuje argininę i kanawaninę do komórek11.

Zarówno genetyczne, jak i fizyczne strategie sortowania zostały z powodzeniem wykorzystane do uzyskania większych populacji komórek macierzystych S. cerevisiae, aby ułatwić badania nad starzeniem się replikacyjnym. Strategie genetyczne obejmują sprytne podejścia, które dokonują selekcji pod kątem przeżywalności komórek potomnych w populacji. Program wzbogacania matki (MEP) obejmuje indukcję ekspresji rekombinazy Cre beta-estradiolu tylko w komórkach potomnych, co prowadzi do specyficznego dla córki zakłócenia dwóch podstawowych genów, które zostały zmodyfikowane tak, aby zawierały miejsca loxP 12. Szczepy MEP mogą być hodowane normalnie pod nieobecność induktora, ale tylko komórki macierzyste będą nadal dzielić się po indukcji, podczas gdy komórki potomne zatrzymają się w fazie M, zwykle podczas pierwszej progresji przez cykl komórkowy12. Chociaż system ten nie został wykorzystany do szerokiego badania akumulacji mutacji podczas starzenia, został wykorzystany do badania utraty heterozygotyczności, stosunkowo częstej formy niestabilności genomu w diploidalnych szczepach drożdży, a także zmian biochemicznych w starzejących się komórkach macierzystych13,14. Podobnie, układ potomny-zatrzymujący obejmuje specyficzną dla córki ekspresję genu S. cerevisiae URA3 15. Szczepy potomne rosną normalnie, dopóki 5-FOA nie zostanie dodane do pożywki, w którym to momencie komórki potomne eksprymujące URA3 umrą, podczas gdy komórki macierzyste będą nadal rosły15. Są to systemy przydatne do wzbogacania komórek macierzystych, ale zależą one od utrzymania funkcji genów, które składają się na system selekcyjny. Losowe mutacje w jednym lub więcej składnikach systemu selekcyjnego mogą skutkować powstaniem komórek potomnych, które wymykają się selekcji i proliferują wykładniczo. Podczas opracowywania szczepów MEP określono odpowiednie rozmiary populacji, aby uniknąć pojawienia się zmutowanych komórek potomnych, które mogłyby uciec przed selekcją12. Jednak to ograniczenie wielkości populacji utrudnia wykrywanie rzadkich form niestabilności genomu podczas starzenia replikacyjnego. To ograniczenie wielkości populacji można częściowo przezwyciężyć poprzez zastosowanie diploidalnych szczepów drożdży, w których dwie kopie każdego genu przyczyniają się do systemu selekcji, ponieważ większość mutacji byłaby prawdopodobnie recesywna12. Jednak stosowanie szczepów diploidalnych ogranicza rodzaje zdarzeń mutacyjnych, które można łatwo wykryć, w porównaniu z tymi, które można łatwo wykryć w haploidalnych komórkach drożdży.

Fizyczne strategie sortowania obejmują izolację komórek macierzystych z oznaczoną powierzchnią komórki z nieoznakowanych komórek potomnych w celu wzbogacenia dla dużych populacji komórek macierzystych. Obserwacja, że białka powierzchniowe komórek (białka ściany komórkowej) komórek potomnych S. cerevisiae są nowo syntetyzowane podczas pączkowania, została wykorzystana do znakowania komórek macierzystych bez znakowania komórek potomnych, które wytwarzają16. Na przykład początkowa populacja komórek drożdży znakowanych na ich powierzchni biotyną może być hodowana, a następnie izolowana z ich komórek potomnych za pomocą mikrogranulek antybiotyny i sortowania magnetycznego16, ponieważ komórki potomne wygenerowane przez początkową populację nie będą zawierały biotyny na swojej powierzchni. Szeregowy wzrost i sortowanie pozwala na uzyskanie i analizę coraz starszych populacji komórek macierzystych. Procedura ta została z powodzeniem wykorzystana do zbadania zmian w fizjologii komórki i ekspresji genów podczas replikacyjnego starzenia drożdży13,14,17,18. Obecna metoda dostosowuje tę technikę znakowania biotyną i sortowania magnetycznego w celu wzbogacenia komórek macierzystych w celu pomiaru akumulacji potencjalnie rzadkich mutacji lub innych form niestabilności genomu testowanych za pomocą selekcji fenotypowej. Wzrost seryjny i sortowanie fizyczne umożliwiają analizę akumulacji mutacji w coraz starszych komórkach macierzystych, a także w ich populacjach komórek potomnych. Określenie częstości mutacji na pokolenie pozwala na obliczenie przewidywanej częstości mutacji dla komórek macierzystych, które przeszły określoną liczbę podziałów komórkowych. Ponieważ przewidywane wartości częstości opierają się na oczekiwanym wzroście spowodowanym dodatkowymi rundami podziału komórek, znaczne odchylenia w obserwowanych częstościach mutacji w porównaniu z przewidywanymi wartościami dostarczają dowodów na specyficzne dla wieku zmiany w tempie akumulacji mutacji. Korzystając z tego protokołu, fluorescencyjne barwienie blizn po pąkach, które odpowiadają miejscom podziałów komórkowych na komórkach macierzystych, w połączeniu z analizą za pomocą cytometrii przepływowej, może być wykorzystane do szybkiego określenia rozkładu wieku posortowanych i niesortowanych populacji. Podczas tego protokołu można również wykorzystać dodatkowe odczynniki fluorescencyjne, takie jak te używane do wykrywania reaktywnych form tlenu. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten umożliwia skuteczną analizę zależnych od wieku zmian w niestabilności genomu z możliwością korelacji z związanymi z wiekiem zmianami fizjologicznymi komórki w organizmie modelowym, dobrze nadającym się do badania czynników genetycznych i środowiskowych, które wpływają na niestabilność genomu związaną ze starzeniem się.

Protokół

1. Przygotowanie pożywek i roztworów

  1. Hodować komórki w bogatym medium ekstrakt drożdżowy-pepton-glukoza (YPD) zgodnie ze standardowym protokołem. Przygotować roztwór na medium YPD zawierający 2% bacto-peptonu, 1% ekstraktu drożdżowego oraz 2% glukozy i dodać 2% bacto-agaru dla medium stałego19. Sterylizować w autoklawie. W razie potrzeby zastosować alternatywne medium, aby przetestować konkretne warunki wzrostu lub mutanty szczepów drożdży.
  2. Przygotować stałe syntetyczne medium kompletne pozbawione argininy z dodatkiem 60 mg/L kanawaniny (SC-arg + kanawanina) do selekcji mutantów opornych na kanawaninę. Przygotować roztwór zawierający 0,67% bacto-yeast nitrogen base bez aminokwasów, 2% glukozy, 0,2% kompletnej mieszanki suplementów bez argininy (dropout mix) oraz 2% bacto-agaru19. Sterylizować w autoklawie i schłodzić przed dodaniem kanawaniny z roztworu zapasowego o stężeniu 20 mg/ml (sterylizowanego przez filtr, przechowywanego w 4 °C)19.
    1. Przygotować stałe syntetyczne medium kompletne zawierające kwas 5-fluoroorotowy (5-FOA). Przygotować 500 ml roztworu zawierającego 1,34% bacto-yeast nitrogen base bez aminokwasów, 4% glukozy, 0,4% kompletnej mieszanki suplementów oraz 0,2% 5-FOA i sterylizować przez filtr19. Sterylizować w autoklawie 500 ml 4% roztworu bacto-agaru, krótko schłodzić, a następnie zmieszać z 500 ml sterylizowanego przez filtr roztworu odżywczego. Dla innych testów mutacyjnych stosować odpowiednie media alternatywne.
  3. Do znakowania biotyną przygotować 500 ml 1x roztworu soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) zawierającego 137 mM chlorku sodu, 2,7 mM chlorku potasu, 10,14 mM fosforanu sodu dwuzasadowego i 1,77 mM fosforanu potasu dwuzasadowego, pH 8. Przechowywać w 4 °C i trzymać na lodzie podczas użytkowania.
  4. Przygotować świeży roztwór zapasowy biotyny o stężeniu 5 mM w sterylnej, ultrapurej wodzie.
  5. Aby przerwać znakowanie biotyną, przygotować 500 ml 1x PBS z 100 mM glicyną. Przechowywać w 4 °C i trzymać na lodzie podczas użytkowania.
  6. W zależności od liczby użytych komórek i czasu trwania eksperymentu, przygotować 1-2 L buforu do znakowania kulek zawierającego 1x PBS, 2 mM EDTA oraz 0,5% albuminy surowicy bydlęcej. Sterylizować bufor przez filtr i odgazować. Przechowywać w 4 °C i trzymać na lodzie podczas użytkowania.
  7. Przygotować 0,4% roztwór błękitu trypanu w 1x PBS, sterylizować przez filtr i przechowywać w temperaturze pokojowej (RT) do pomiarów żywotności komórek.
  8. Rozdzielić koniugat fluorescencyjny aglutyniny zarodków pszenicy (WGA) na małe objętości (~100 µl) i przechowywać w -20 °C w probówkach do mikrocentryfugi owiniętych folią (lub nieprzepuszczających światła) do określania wieku komórek.

2. Wyznaczanie szybkości i częstości mutacji

  1. Ustal bazową częstość mutacji na pokolenie komórek, wykorzystując testy fluktuacyjne dla komórek hodowanych w standardowych warunkach hodowlanych. Wyhoduj od siedmiu do jedenastu powtórzeń kultur o objętości 1 ml, zaczynając od początkowej gęstości 1 000-5 000 komórek/ml, aż do wczesnej fazy stacjonarnej (~108 komórek/ml).
    1. Dla każdej powtórzonej kultury rozcieńcz komórki w stosunku 1:2 000 i wysej 1-4 µl na podłoże nieselektywne (YPD), aby określić liczbę jednostek tworzących kolonie/ml. Pozostałe komórki odwiruj przy ~2 400 x g przez 1 min w mikrowirówce i resuspenduj w 100 µl wody, aby wysiać je na podłoże selektywne w celu identyfikacji mutantów. Inkubuj płytki przez trzy dni w temperaturze 30 °C przed zliczeniem kolonii (dostosuj czas inkubacji w zależności od tempa wzrostu komórek).
    2. Wyznacz liczbę niezależnych mutacji (m), które wystąpiły w próbie, na podstawie liczby kolonii mutantów (r) uzyskanych na podłożu selektywnym. Użyj estymatora mediany Lea-Coulsona, aby znaleźć m, podstawiając medianę liczby kolonii mutantów za r w poniższym wzorze9. Następnie podstawiaj wartości m, aż lewa strona równania będzie bliska zeru.
      Równanie: r/m - ln(m) - 1,24 = 0; analiza wzoru matematycznego.
    3. Aby określić częstość mutacji, oblicz najpierw średnią liczbę żywych komórek wyseianych na podłoże selektywne, mnożąc średnią liczbę jednostek tworzących kolonie/ml z powtórzeń kultur przez objętość kultury w ml wyseianej na podłoże selektywne. Podziel wartość m z kroku 2.1.2 przez tę średnią liczbę żywych komórek, aby uzyskać częstość mutacji na pokolenie komórek.
  2. Oblicz oddzielnie liczbę żywych komórek wyseianych na podłoże selektywne dla każdego powtórzenia kultury w próbie, zgodnie z opisem w kroku 2.1.3. Podziel liczbę kolonii mutantów (r) uzyskanych dla danej kultury przez liczbę żywych komórek wyseianych na podłoże selektywne, aby uzyskać częstotliwość mutacji. Użyj średniej lub mediany indywidualnych częstotliwości mutacji z powtórzeń kultur z kroku 2.1 jako bazowej częstotliwości mutacji.
  3. Wykonaj pomiary częstotliwości przed i po znakowaniu komórek biotyną (kroki 3.2 i 3.4), aby sprawdzić, czy etap znakowania powoduje jakąkolwiek zmianę w częstotliwości mutacji, którą należałoby uwzględnić podczas badania zmian w akumulacji mutacji specyficznych dla wieku.

3. Znakowanie biotyną

  1. Wysiać S. cerevisiae z zapasu w glicerolu w temperaturze -80 °C na podłoże YPD i inkubować w 30 °C przez 1-3 dni.
  2. Za pomocą sterylnego końcówki do pipety przenieść komórki z płytki z wysiewem do 1 ml (lub więcej) wody, pamiętając, że 1-1,5 cm gęsto porośniętego fragmentu wysiewu dostarczy około 108 komórek. Dokładną gęstość komórek określić za pomocą hemocytometru.
  3. Wyznaczyć 108 komórek na szczep (lub warunek traktowania) dla każdego punktu pobrania, w którym będzie określana częstotliwość mutacji, lub wielkość populacji wystarczającą do uzyskania co najmniej 5-10 kolonii mutantów na próbkę na podłożu selektywnym (na podstawie częstotliwości mutacji z kroku 2.2). Do pomiarów bazowych uwzględnić dodatkowe 108 komórek na szczep/warunek.
  4. Znakować biotyną zgodnie ze standardową procedurą producenta, z wyjątkiem zastosowania 5 mM zapasu odczynnika biotyny i delikatnego kołysania podczas inkubacji. Wszystkie etapy wirowania przeprowadzać przez 5 min w 4 °C przy 3,000 x g, ponieważ wirowanie w temperaturach wyższych niż 4 °C może prowadzić do zwiększonej utraty komórek. Po ostatnim przemyciu zawiesić komórki w wodzie do stężenia 108 znakowanych komórek/ml.
  5. Sprawdzić żywotność komórek za pomocą barwienia błękitem trypanu. Rozcieńczyć 10 µl komórek z 23 µl wody i 67 µl 0,4% błękitu trypanu w 1x PBS. Inkubować przez co najmniej 40 min w RT przed policzeniem komórek żywych (niezbarwionych) i martwych (zbarwionych) za pomocą hemocytometru.
  6. Zmierzyć wartości bazowe dla niestabilności genomu, wieku komórek oraz innych istotnych parametrów (patrz sekcje 5, 6 i 7).
  7. Przenieść komórki znakowane biotyną do kolby Erlenmeyera zawierającej 20 ml podłoża YPD na każde 108 komórek (około 5 x 106 komórek/ml). Hodować kulturę(y) przez 16-18 hr w 20 °C do przybliżonej gęstości 108 komórek/ml (cztery do pięciu generacji komórek), nie dopuszczając do osiągnięcia przez komórki fazy stacjonarnej. W przypadku wzrostu w 30 °C zastosować krótszy czas inkubacji. Jeśli jest to konieczne w celu optymalizacji czasu wzrostu i pobierania próbek, komórki znakowane biotyną można przechowywać w 4 °C do kilku godzin przed dodaniem do podłoża.

4. Znakowanie koralików i sortowanie magnetyczne

  1. Po fazie wzrostu rozcieńczyć alikwot kultury, aby określić gęstość komórek za pomocą hemocytometru. Odwirować komórki przez 5 min w temperaturze 4 °C przy 3,000 x g. Odlać supernatant.
  2. Przemyć komórki, mieszając je w wstrząsarce wirowej (vortex), aby zawiesić osad w 30 ml buforu do znakowania koralikami, a następnie wirować i odlać supernatant zgodnie z sekcją 4.1. Powtórzyć przemywanie.
  3. Całkowicie resuspendować komórki w 50 µl buforu do znakowania koralikami na każde 108 wszystkich komórek za pomocą vortexu. Dodać 2 µl koralików magnetycznych na 108 wszystkich komórek i krótko wymieszać w wstrząsarce wirowej. Inkubować na lodzie przez 10 min, okresowo odwracając probówkę w celu wymieszania (zmodyfikowano protokół dostępny online pod adresem http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf).
  4. Przemyć komórki trzy razy 30 ml buforu do znakowania koralikami.
  5. Dodać 0,5 ml buforu do znakowania koralikami na każde 108 wszystkich komórek i krótko zawiesić osad w wstrząsarce wirowej na średnim ustawieniu, aż do resuspensji komórek. Przelać przez sito komórkowe 40 µm do probówki 50 ml, aby usunąć ewentualne pozostałe skupiska komórek. W razie potrzeby pozostawić komórki na lodzie przez 1-2 h przed nałożeniem na kolumnę.
  6. Postępować zgodnie z protokołem producenta kolumn magnetycznych w celu wiązania, płukania i elucji komórek macierzystych znakowanych koralikami magnetycznymi. Aby zwiększyć odzysk znakowanych komórek, należy użyć co najmniej jednej kolumny na 2 x 109 wszystkich komórek.
    1. Usuwać wszelkie pęcherzyki powietrza powstające podczas nakładania próbek na kolumny, ponieważ mogą one zablokować przepływ. Zjmować i ponownie umieszczać kolumnę w separatorze między płukaniami, aby zapobiec uwięzieniu komórek między koralikami (zmodyfikowano protokół dostępny online pod adresem http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf).
    2. Zatrzymać frakcję przepływową z etapów wiązania i płukania, aby w razie potrzeby przeanalizować młode komórki wytworzone przez komórki macierzyste. Skoncentrować komórki zgodnie z opisem w kroku 4.7.
    3. Używać separatorów wielokolumnowych do jednoczesnego przetwarzania wielu próbek. Eluować zawartość z wielu kolumn tej samej próbki do jednej probówki zbiorczej, aby skrócić czas manipulacji i zmniejszyć stratę komórek.
  7. Skoncentrować eluowane komórki macierzyste przez wirowanie przy 3,000 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Odessać cały bufor z wyjątkiem 1 ml na każde 108 pierwotnych komórek znakowanych biotyną. Krótko wymieszać w wstrząsarce wirowej, aby zawiesić komórki w pozostałym buforze.
  8. Rozcieńczyć alikwot komórek i zabarwić błękitem trypanu, aby określić gęstość i żywotność komórek za pomocą hemocytometru (patrz krok 3.5). Obliczyć całkowitą liczbę odzyskanych komórek.
    1. Jeśli liczba komórek jest znacznie wyższa od oczekiwanej, przepuścić próbkę z elucji przez kolejną kolumnę w celu usunięcia zanieczyszczających młodych komórek. Jeśli liczba komórek jest znacznie niższa od oczekiwanej, przepuścić zachowaną frakcję przepływową przez kolejną kolumnę, aby spróbować zwiększyć wydajność odzysku komórek macierzystych.
  9. Wykorzystać komórki do dalszych analiz, zgodnie z opisem w sekcjach 5 i 6. Alternatywnie, ponownie hodować komórki w bulionie YPD, aby zwiększyć ich wiek replikacyjny (krok 3.7), a następnie przeprowadzić znakowanie koralikami i sortowanie (kroki 4.1-4.8.1), bez konieczności powtarzania znakowania biotyną.

5. Określanie wieku replikacyjnego

  1. W każdym kroku tej sekcji wiruj komórki przez 2 min przy 5,000 x g w temperaturze RT. Przenieś 25 µl odzyskanych komórek (~108 komórek/ml) do probówki do wirowania o pojemności 1,5 ml i przemyj dwukrotnie 1 ml 1x PBS. Odessij nadsącz.
    1. Rozmroź alikwot koniugatu WGA, wymieszaj w wirówce laboratoryjnej (vortex) i krótko odwiruj, aby usunąć agregaty białkowe. Resuspenduj komórki w 180 µl 1x PBS i 20 µl WGA sprzężonego z cząsteczką fluorescencyjną w celu oznakowania blizn pączkowania na powierzchni komórek. Przykryj probówkę do wirowania 1,5 ml folią i inkubuj przy delikatnym kołysaniu w temperaturze 30 °C przez 30 min.
    2. Przemyj trzykrotnie 1 ml 1X PBS.
  2. Do mikroskopii fluorescencyjnej opisz szkiełka i zamontuj preparaty zgodnie ze standardowym protokołem, używając środka przeciw zanikaniu fluorescencji (anti-fade agent). Pozostaw szkiełka do pełnego utwardzenia w ciemności (do kilku dni) przed przyklejeniem szkiełka nakrywkowego, aby uniknąć przemieszczania się komórek podczas obrazowania. Policz blizny pączkowania na co najmniej 50 komórkach na próbkę, aby uzyskać reprezentatywny pomiar wieku komórek. W razie potrzeby przechowuj szkiełka do 1 miesiąca w celu obserwacji blizn pączkowania.
    1. Alternatywnie, określ intensywność sygnału fluorescencyjnego koniugatu WGA, wykonując cytometrię przepływową komórek resuspendowanych w 1 ml 1x PBS po kroku 5.1.2. Dla WGA-Alexa 488 zastosuj laser wzbudzający 405 nm i filtr emisyjny 530/30 nm z filtrem długoprzepustowym 505 nm. Dla każdego punktu poboru prób dołącz kontrolę niebarwioną.
  3. Na wykresie nanieś liczbę blizn pączkowania w młodych i starych komórkach policzonych mikroskopowo na osi y, a znormalizowaną średnią geometryczną (średnia geometryczna barwiona/średnia geometryczna niebarwiona) fluorescencji koniugatu WGA z tych samych populacji komórek na osi x. Wyznacz równanie linii trendu liniowego dla tej zależności. W kolejnych eksperymentach podstaw znormalizowaną średnią geometryczną intensywności fluorescencji koniugatu WGA danej populacji komórek w miejsce x w równaniu i oblicz y, aby określić średni wiek komórek w próbce.

6. Częstotliwość mutacji

  1. Posieć posortowane komórki macierzyste resuspendTime w buforze z kroku 4.7 na podłoże YPD oraz podłoże selekcyjne zgodnie z opisem w kroku 2.1.1. Na podłoże selekcyjne nanieść 1 ml resuspendTime komórek macierzystych i odwirować je z prędkością 5,000 x g przez 1 min.
    UWAGA: Wraz ze wzrostem wieku komórek posiewać większe objętości rozcieńczonych komórek na podłoże YPD, aby zrekompensować rosnącą liczbę komórek nieżywotnych i senescencyjnych w starszych populacjach.
    1. Inkubować płytki z podłożem YPD oraz podłożem selekcyjnym z kroku 6.1 w temperaturze 30 °C odpowiednio przez 3 i 4 dni. W przypadku komórek bardzo starych lub szczepów wolno rosnących wydłużyć czas inkubacji do jednego tygodnia. Obliczyć częstość mutacji zgodnie z opisem w kroku 2.2.

7. Obliczanie przewidywanej częstotliwości mutacji dla danego wieku replikacyjnego

  1. Oblicz średni przyrost wieku replikacyjnego komórek znakowanych biotyną w trakcie eksperymentu, odejmując średni wiek początkowej populacji komórek od średniego wieku posortowanych komórek macierzystych dla odpowiedniego sortowania. Użyj wieku komórek obliczonego w kroku 5.2 lub 5.2.2.
  2. Pomnóż tempo mutacji otrzymane w kroku 2.1.3 przez przyrost średniego wieku komórek obliczony w kroku 7.1. Dodaj tę wartość do bazowej częstotliwości mutacji dla populacji początkowej obliczonej w kroku 2.2, aby określić przewidywaną częstotliwość mutacji dla komórek o odpowiednim wieku replikacyjnym.

Wyniki

Schemat blokowy na Rysunku 1 przedstawia ogólne etapy procedury, w tym punkty, w których mierzone są częstości i tempo mutacji oraz wiek komórek. Dokładne określenie częstości i tempa mutacji (lub innej formy niestabilności genomu) w młodych populacjach komórek jest ważnym pierwszym krokiem, ponieważ jest to niezbędne do wyboru odpowiedniej wielkości populacji do znakowania i sortowania magnetycznego. Wartości tempa mutacji można ustalić za pomocą testów fluktuacyjnych9. Przykładowe wyniki dla szczepów drożdży w tle genetycznym BY474120, wyselekcjonowanych pod kątem mutacji w genie CAN1 nadających oporność na kanawaninę lub mutacji w genie URA3 nadających oporność na 5-FOA, przedstawiono na Rysunku 2. Komórki hodowano w temperaturze 20 °C dla reprezentatywnych eksperymentów dotyczących tempa mutacji oraz w 20 °C i 30 °C dla reprezentatywnych eksperymentów dotyczących częstości mutacji. Temperatury te zastosowano, ponieważ początkowe populacje komórek hodowane w 30 °C były następnie hodowane w 20 °C w kolejnych reprezentatywnych eksperymentach sortowania. Wartości tempa mutacji z niezależnych prób były porównywalne dla początkowej populacji komórek i komórek po znakowaniu biotyną dla szczepu, który posiada gen CAN1 w normalnej lokalizacji na chromosomie V, około 32 kilobaz od telomeru lewego ramienia (www.yeastgenome.com) (Rysunek 2A, kolumny lawendowe). Tempo mutacji CAN1 było znacznie wyższe w populacjach początkowych drugiego szczepu drożdży, który posiada delecję genu CAN1 z jego normalnej lokalizacji na chromosomie V oraz insercję CAN1 na prawym ramieniu chromosomu VIII, około 25 kilobaz od telomeru21 (Rysunek 2B). Częstości mutacji genu CAN1 były również porównywalne dla początkowych populacji komórek i komórek znakowanych biotyną w obu temperaturach wzrostu (Rysunek 2A, kolumny niebieskie). Jednakże stwierdzono, że częstości mutacji uzyskane w 20 °C były wyższe niż częstości mutacji w 30 °C. Aby sprawdzić, czy ten efekt temperatury ograniczał się do genu CAN1, zmierzyliśmy mutacje w URA3, selekcjonując oporność na 5-FOA przy użyciu szczepu drożdży z insercją CAN1 na chromosomie VIII. Szczep ten posiada również delecję URA3 z jego normalnego miejsca na chromosomie V oraz insercję URA3 na prawym ramieniu chromosomu VIII, około 40 kilobaz od telomeru21. Częstości mutacji dla URA3 w tej lokalizacji chromosomowej były również wyższe w 20 °C (Rysunek 2C). Ogólnie dowodzi to, że temperatura wzrostu może wpływać na częstość mutacji, natomiast znakowanie biotyną nie wydaje się wpływać na częstość mutacji. W związku z tym tempo i częstość mutacji dla populacji początkowych muszą zostać określone w tej samej temperaturze wzrostu, która będzie stosowana podczas cykli wzrostu i sortowania. Zaleca się zweryfikować, czy znakowanie biotyną nie wpływa na niestabilność genomu przed zastosowaniem protokołu do badania innych rodzajów mutacji lub rearanżacji genomu.

Zgodnie z oczekiwaniami, wartości tempa mutacji przedstawione na Rysunku 2A są kilkukrotnie niższe niż odpowiadające im pomiary częstości mutacji. Różnica ta wynika z faktu, że tempo mutacji mierzy pojawianie się komórek z nowymi mutacjami w każdym cyklu podziału komórkowego, podczas gdy częstość mutacji mierzy skumulowaną liczbę komórek zmutowanych w populacji na koniec okresu wzrostu. Tempa oraz 95% przedziały ufności dla tych prób wskazują, że powtarzalne wyniki można uzyskać, stosując siedem kultur powtórzonych na próbę, co stanowi minimalną liczbę powtórzeń sugerowaną w niniejszym protokole.

Po ustaleniu wstępnych wartości częstotliwości i tempa należy dobrać wielkość populacji, która zapewni obecność odpowiedniej liczby komórek po wielu rundach sortowania, aby wiarygodnie wyznaczyć częstotliwości mutacji. Oznaczenie populacji 108 komórek dla każdego punktu czasowego analizowanego podczas starzenia jest odpowiednie, gdy częstotliwości i tempa są zbliżone do tych przedstawionych na Rysunku 2A. Decyzja ta zależy również od tego, jak wydajnie odzyskuje się oznakowane komórki macierzyste po każdej rundzie sortowania. Wydajność odzyskiwania oznakowanych komórek macierzystych można szybko i prosto ocenić, używając hemocytometru do wyznaczenia liczby komórek wymytych z kolumn po każdym sortowaniu oraz do zbadania morfologii komórek. Przykład danych dotyczących wydajności odzyskiwania (Rysunek 3A) ilustruje dwa główne punkty: odzyskana liczba komórek może wydawać się wyższa niż oczekiwano po pierwszym sortowaniu, a przy dalszym sortowaniu spodziewana jest niewielka, postępująca utrata komórek. Wyższa niż oczekiwana liczba komórek w niektórych eksperymentach po pierwszym sortowaniu może wynikać z oznakowania pączków w komórkach populacji początkowej. Komórka drożdży z pączkiem byłaby zazwyczaj liczona jako pojedyncza komórka podczas wyznaczania liczby komórek do oznakowania biotyną. Jednak oznakowanie pączków obecnych w populacji początkowej pozwoliłoby na zatrzymanie na kolumnach podczas sortowania również komórek, które rozwiną się z tych pączków. Wpływ tego zjawiska na wyznaczenie wydajności odzyskiwania zależy od frakcji komórek pączkujących w początkowej populacji komórek. Drugim potencjalnym powodem wyższej liczby komórek po pierwszym sortowaniu jest tendencja do występowania w tym punkcie czasowym większej liczby dużych komórek pączkujących, które mogą kończyć podział komórkowy podczas sortowania. W rezultacie duże pączki wciąż przyczepione do komórek macierzystych mogą zostać posortowane, a następnie pojawić się jako odrębne komórki podczas badania wymytych komórek. Chociaż przy każdej rundzie wzrostu i sortowania obserwuje się pewną utratę komórek, protokół może zapewnić wiarygodne zatrzymanie 80-90% komórek po każdej rundzie sortowania. Warto poćwiczyć tę procedurę, aby upewnić się, że izolowanych jest 80% lub więcej oznakowanych komórek, co pozwoli uniknąć konieczności oznakowania niepotrzebnie dużej początkowej populacji komórek. Poddanie komórek łagodnemu stresowi po pierwszym sortowaniu (1 mM nadtlenku wodoru w medium YPD przez 30 min) nie zapobiegło wydajnemu odzyskiwaniu komórek w kolejnych rundach wzrostu i sortowania, choć po stresie wystąpiła pewna zmienność w odzyskiwaniu podczas pierwszego sortowania (Rysunek 3A).

Ocena morfologii i żywotności komórek jest przydatna zarówno do potwierdzenia pomyślnej izolacji komórek macierzystych, jak i do dostosowania rozcieńczeń/objętości stosowanych podczas wysiewania komórek na podłoże nieselektywne w celu wyznaczenia gęstości jednostek tworzących kolonie. Komórki macierzyste stają się coraz większe i przyjmują bardziej nieregularne kształty wraz z wiekiem w porównaniu do komórek potomnych (Ryc. 3B). Próbki komórek macierzystych powinny zatem składać się przede wszystkim z dużych komórek o nieregularnym kształcie w miarę postępu eksperymentu przez kolejne rundy sortowania. Obecność wielu małych, owalnych komórek o regularnym kształcie może wskazywać, że komórki macierzyste nie są odpowiednio oddzielone od komórek potomnych. Żywotność komórek macierzystych powinna również stopniowo spadać z każdą rundą hodowli i sortowania, choć w ciągu pierwszych pięciu do dziesięciu generacji komórkowych zmiany mogą być niewielkie. Liczba komórek zdolnych do tworzenia kolonii może spadać znacznie gwałtowniej niż liczba komórek uznanych za żywe na podstawie bezpośredniego barwienia integralności komórkowej, co wynika z powstawania komórek senescentnych. Gdy żywotność mierzona metodą bezpośredniego barwienia zaczyna po raz pierwszy spadać (do około 80% lub mniej), konieczne może być dostosowanie rozcieńczeń i objętości używanych do pomiaru gęstości jednostek tworzących kolonie, przewidując gwałtowniejszy spadek zdolności żywych komórek do tworzenia kolonii (spadek dwukrotny lub wielokrotny).

Przed analizą danych dotyczących częstości mutacji w komórkach macierzystych w celu wykazania zmian w tempie akumulacji mutacji zależnych od wieku, należy wyznaczyć wiek replikacyjny posortowanych populacji oraz populacji kontrolnych. Można to osiągnąć poprzez manualne liczenie blizn po pączkowaniu w komórkach macierzystych (Rysunek 4) lub za pomocą cytometrii przepływowej w celu ilościowego oznaczenia sygnału odczynnika do wykrywania blizn po pączkowaniu (Rysunek 5). Blizny po pączkowaniu można znakować przy stosunkowo niskim sygnale tła, używając konjugatów WGA z fluorochromem (Rysunek 4C). Rysunek 4A pokazuje, że większość komórek z próbek przepływowych procedury sortowania posiada zero lub jedną bliznę po pączkowaniu. Komórki eluowane z kolumn to głównie starsze komórki macierzyste (Rysunki 4B i 5). Zazwyczaj >90% eluowanych komórek to komórki macierzyste, co można łatwiej zaobserwować na wyniku cytometrii przepływowej na Rysunku 5. Komórki z relatywnie niewielką liczbą blizn po pączkowaniu (<6) uzyskane po więcej niż dwóch rundach sortowania mogą reprezentować komórki zanieczyszczające, które nie zostały znakowane biotyną i przeszły kilka rund podziałów komórkowych podczas odpowiedniej fazy wzrostu, w przeciwieństwie do komórek macierzystych dzielących się bardzo powoli. Zmienność wieku komórek może wzrosnąć w kolejnych rundach sortowania, jeśli nie wszystkie komórki w populacji rosną w sposób jednolity.

Większą populację komórek można wykorzystać do szybszej oceny wieku komórek, jeśli zostanie ustanowiona liniowa zależność między intensywnością sygnału fluorescencji WGA a liczbą blizn pączkowania na komórkę. W tej analizie normalizację wszystkich intensywności sygnału fluorescencji WGA przeprowadza się poprzez podzielenie sygnału z barwionych komórek przez sygnał otrzymany dla odpowiedniej niebarwionej populacji komórek (córki lub matki), aby uwzględnić zwiększoną fluorescencję tła w starszych komórkach. Ryciny 4 i 5 przedstawiają analizę tych samych reprezentatywnych populacji komórek. Ręczne liczenie pozwoliło ustalić średni wiek replikacyjny wynoszący odpowiednio 0,95 i 11,4 dla populacji komórek córki (Rycina 4A) oraz komórek matki (Rycina 4B). Znormalizowane sygnały WGA dla tych dwóch populacji oraz trzech dodatkowych populacji (średni wiek 3,0, 6,9 i 14,4) naniesiono na wykres w funkcji średniej liczby blizn pączkowania dla każdej populacji (Rycina 5B). Tę liniową zależność można następnie wykorzystać z tym samym szczepem i odczynnikami w przyszłych eksperymentach w celu określenia średniego wieku komórek na podstawie znormalizowanego sygnału WGA uzyskanego za pomocą cytometrii przepływowej, co pozwala na szybkie i dokładne określenie wieku komórek. Należy nadal uwzględniać populacje kontrolne, aby zweryfikować podobną wydajność barwienia pomiędzy seriami doświadczalnymi.

Wpływ wieku na akumulację mutacji można przeanalizować po wykonaniu wcześniejszych kroków polegających na wyznaczeniu wartości tempa mutacji, efektywnym sortowaniu komórek oraz określeniu wieku komórek. Liczba punktów czasowych, w których można wyznaczyć częstotliwość, zależy od wielkości populacji komórek znakowanych biotyną oraz liczby komórek, które należy wysiać na podłożu selektywnym w celu uzyskania wiarygodnych wyników. Jeśli tempo mutacji zmienia się wraz z wiekiem, to obserwowane częstotliwości mutacji dla starzejących się komórek macierzystych powinny różnić się od tych oczekiwanych wyłącznie na podstawie dodatkowych rund podziałów komórkowych. Porównanie obserwowanej częstotliwości mutacji z przewidywaną częstotliwością mutacji pozwala zidentyfikować różnice w tempie akumulacji mutacji związane z wiekiem. Jak opisano w sekcji 7 protokołu, przewidywaną częstotliwość można otrzymać z iloczynu bazowego tempa mutacji dla początkowej populacji komórek i wzrostu wieku replikacyjnego komórek macierzystych, dodanego do częstotliwości mutacji dla populacji początkowej. Wzrosty częstotliwości mutacji CAN1 zaobserwowano wraz ze wzrostem średniego wieku komórek w szczepie z CAN1 w normalnej lokalizacji na chromosomie V (Rycina 6A) oraz w szczepie z CAN1 na prawym ramieniu chromosomu VIII (Rycina 6B). Ponieważ obserwowane częstotliwości mutacji dla komórek macierzystych na Rycini 6A są podobne do przewidywanych częstotliwości lub znajdują się tuż poniżej nich, dane te nie dostarczają dowodów na specyficzną dla wieku zmianę tempa mutacji. W przeciwieństwie do tego, częstotliwości mutacji dla komórek macierzystych szczepu z CAN1 na chromosomie VIII były wyższe niż przewidywane częstotliwości (Rycina 6B). Należy zauważyć, że przewidywane częstotliwości na wykresie nie wydają się znacząco rosnąć, ponieważ ze względu na duży wzrost obserwowanej częstotliwości mutacji dla osi y należało zastosować skalę logarytmiczną. Zatem wyniki na Rycini 6B dostarczają dowodów wspierających specyficzny dla wieku wzrost tempa akumulacji mutacji. Różnica w wynikach dla zestawów danych na Rycini 6A i 6B wynika prawdopodobnie z różnych lokalizacji genomicznych CAN1. Tego typu obserwacje stanowią punkt wyjścia do formułowania hipotez w celu zbadania mechanizmów wpływających na tempo mutacji w miarę starzenia się komórek oraz do opracowania modeli wyjaśniających akumulację mutacji w zależności od wieku replikacyjnego.

Schemat starzenia się komórek; znakowanie biotyną, inkubacja, sortowanie; tempo mutacji, analiza częstotliwości.
Rysunek 1. Schemat blokowy ogólnej procedury badania akumulacji mutacji podczas replikacyjnego starzenia się drożdży. Czarny tekst i strzałki wskazują główne etapy procedury. Zakrzywiona strzałka odzwierciedla fakt, że dodatkowe cykle ponownego wzrostu i sortowania tych samych komórek są wykorzystywane w celu uzyskania komórek o coraz większym wieku. Fioletowe strzałki i tekst wskazują etapy, na których wykonywane są określone pomiary. Freq – częstotliwość.

Wykresy słupkowe tempa i częstotliwości mutacji w 20°C i 30°C dla próbek IP i PB w eksperymencie.
Rycina 2. Wyznaczenie częstotliwości i tempa mutacji w młodych populacjach komórek. (A) Kolonie mutantów wyselekcjonowano poprzez wysiew komórek na podłoże SC-arg + kanawanina w celu wyselekcjonowania mutacji utraty funkcji w genie CAN1, a następnie porównano je z całkowitą liczbą żywych komórek wysianych na podłoże selekcyjne, aby obliczyć częstotliwości/tempa. Komórki z populacji początkowych przed znakowaniem biotyną (IP) lub po znakowaniu biotyną (PB) hodowano na podłożu YPD, zwiększając gęstość z początkowej wartości 5,000 cells/ml do poziomu bliskiego nasyceniu. Kolumny lawendowe oznaczają pomiary tempa, a kolumny niebieskie reprezentują pomiary częstotliwości wykonane w podanych temperaturach (20 °C i 30 °C). Dla każdej próby hodowano zestawy siedmiu kultur powtórzonych, a wykonano od dwóch do pięciu niezależnych prób. Przedstawiono indywidualne wartości tempa obliczone dla niezależnych prób, a słupki błędów dla tych prób reprezentują 95% przedziały ufności wyznaczone za pomocą kalkulatora online22. Częstotliwości reprezentują średnie i odchylenia standardowe. (B) Tempa mutacji CAN1 uzyskane i przedstawione zgodnie z opisem w części A, z wykorzystaniem szczepu z genem CAN1 na prawym ramieniu chromosomu VIII. (C) Częstotliwości mutacji uzyskane po selekcji kolonii mutantów na 5-FOA z wykorzystaniem szczepu z genem URA3 zlokalizowanym na prawym ramieniu chromosomu VIII. Pozostałe metody były analogiczne do części A; przedstawiono średnie i odchylenia standardowe dla trzech lub czterech niezależnych prób.

Wykres słupkowy i mikroskopia komórkowa; analiza znakowania komórek, stan po biotinylacji oraz wyniki eksperymentu sortowania.
Rycina 3. Przykład wydajności sortowania określonej poprzez obliczenie liczby eluowanych komórek po każdej rundzie sortowania. (A) Całkowitą liczbę komórek w każdej populacji wyjściowej po znakowaniu biotyną przyjęto za wartość jeden, a całkowitą liczbę komórek obecnych w próbkach eluowanych z każdej rundy magnetycznego sortowania komórek podzielono przez te wartości początkowe, aby uzyskać frakcję komórek znakowanych. Całkowita liczba komórek została określona na podstawie zliczeń wykonanych za pomocą hemocytometru. Pomarańczowe słupki reprezentują średnią i odchylenie standardowe dla trzech niezależnych prób przeprowadzonych zgodnie ze standardowym protokołem. Niebieskie słupki reprezentują średnią i odchylenie standardowe dla dwóch niezależnych prób, w których komórki traktowano 1 mM nadtlenkiem wodoru przez 30 min bezpośrednio po pierwszym sortowaniu. (B) Rozmiar i morfologia komórek po znakowaniu biotyną (post-biotin) oraz komórki macierzyste odzyskane po trzeciej rundzie sortowania magnetycznego (sort 3 mother cells) przedstawione przy użyciu standardowej mikroskopii w polu jasnym i obiektywu 20X. Białe linie w tle to linie ograniczające najmniejsze kwadraty widoczne w standardowym hemocytometrze. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza komórek drożdży; histogram blizn po pączkowaniu (A, B) oraz obraz mikroskopowy struktury komórki (C).
Rycina 4. Określanie wieku replikacyjnego za pomocą ręcznego liczenia blizn po pączkowaniu. Mikroskopia konfokalna została wykorzystana do policzenia blizn po pączkowaniu w poszczególnych komórkach znakowanych koniugatem fluorescencyjnym WGA (pobudzenie przy 488 nm i detekcja z kombinacją filtra pasmowo-przepustowego 458/543 nm oraz filtra długoprzepustowego 505 nm). (A) Ręczne liczenie blizn po pączkowaniu w komórkach z frakcji przepływowej (komórki potomne) po trzeciej rundzie sortowania magnetycznego (n = 62). (B) Ręczne liczenie blizn po pączkowaniu w komórkach elowanych (komórki macierzyste) po trzeciej rundzie sortowania magnetycznego (n = 54). (C) Komórki macierzyste zatrzymane po trzeciej rundzie sortowania magnetycznego, sfotografowane przy użyciu obiektywu imersyjnego 63X z 3-krotnym powiększeniem po barwieniu koniugatem fluorescencyjnym WGA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wykresy intensywności fluorescencji z cytometrii przepływowej, komórki potomne w porównaniu z macierzystymi; wykres blizn pączkowania w stosunku do WGA.
Rycina 5. Określanie wieku replikacyjnego za pomocą cytometrii przepływowej. Próbki po 10 000 komórek zabarwionych koniugatem WGA z fluoresceiną analizowano metodą cytometrii przepływowej przy wzbudzeniu przy 488 nm i detekcji z użyciem zestawu filtrów pasmowoprzepuszczalnego 530/30 oraz długoprzepuszczalnego 505. (A) Histogramy przedstawiające liczbę komórek o określonej intensywności fluorescencji WGA dla populacji komórek potomnych lub eluatu (komórek macierzystych) po trzech rundach sortowania magnetycznego. Populacje odpowiadają tym analizowanym na Rycini 4. Niebieskie linie pionowe wskazują odpowiadającą pozycję dla większości komórek potomnych na histogramie komórek macierzystych. (B) Znormalizowaną średnią geometryczną sygnału fluorescencji dla każdej populacji przedstawionej w A oraz trzech dodatkowych populacji komórek (średni wiek 3,0, 6,9 i 14,4) obliczono jako stosunek średniej geometrycznej komórek zabarwionych do średniej geometrycznej odpowiedniej populacji komórek niezabarwionych. Wartości te naniesiono w porównaniu do średniej liczby blizn pączkowania dla każdej całkowitej populacji (Rycina 4 oraz dane niepokazane). Wartość R2 dla linii trendu tego porównania jest podana na wykresie.

Wykres słupkowy częstości mutacji w zależności od wieku komórek, przedstawiający wyniki eksperymentalne z paskami błędów.
Rycina 6. Porównanie przewidywanej i obserwowanej częstości mutacji podczas starzenia replikacyjnego. Komórki z mutacjami w genie CAN1 wyselekcjonowano zgodnie z opisem dla Ryciny 2, wykorzystując szczepy z genem CAN1 w normalnej lokalizacji na chromosomie V (A) lub na prawym ramieniu chromosomu VIII (B). Komórki hodowano na podłożu stałym w temperaturze 30 °C przed znakowaniem biotyną, a następnie w 20 °C. Obserwowane wartości częstości przedstawiono za pomocą pomarańczowych słupków (Obs), a przewidywane częstości dla komórek starszych za pomocą brązowych słupków (Pre). Pierwszy słupek na każdym wykresie przedstawia średnią i odchylenie standardowe początkowej częstości mutacji po znakowaniu biotyną dla czterech niezależnych prób (PB). Liczby pod słupkami wskazują średnią liczbę blizn po pączkowaniu dla każdej populacji (Wiek komórki). Niezależne wartości przewidywane określono zgodnie z opisem w sekcji 7 protokołu, wykorzystując każdą z początkowych wartości szybkości przedstawionych na Rycini 2A (słupki IP) oraz 2B. Następnie wyciągnięto średnią z tych niezależnych wartości. Wartości obserwowane są średnimi z trzech prób. Paski błędów oznaczają odchylenie standardowe.

Dyskusja

Protokół ten łączy w sobie wiele metod, aby umożliwić efektywne zastosowanie zasobów i podejść dostępnych w systemie modelowym Saccharomyces cerevisiae do badania niestabilności genomu podczas starzenia się komórek mitotycznych. Szeroka gama testów do ilościowego określania różnych form niestabilności genomu poprzez selekcję fenotypową może być połączona z sortowaniem magnetycznym w celu zbadania możliwych specyficznych dla wieku zmian w akumulacji określonych form mutacji lub rearanżacji chromosomów. Podczas gdy sekwencjonowanie całego genomu może dostarczyć więcej informacji na temat ogólnych typów zmian zachodzących w genomie wraz z wiekiem, możliwość wykorzystania systemów selekcji fenotypowej do uzyskania pomiarów szybkości mutacji i preferencyjnego izolowania określonych typów zmian genetycznych jest ważną zaletą w badaniu mechanistycznych aspektów niestabilności genomu związanej ze starzeniem się. Usprawnienie określania wieku komórek i możliwość dokonywania równoległych pomiarów zmian fizjologicznych za pomocą cytometrii przepływowej zapewnia skuteczne metody korelacji niestabilności genomu z innymi zmianami komórkowymi w określonych przedziałach wiekowych. Określenie potencjalnych, zależnych od wieku zmian w tempie akumulacji mutacji wymaga: 1) starannego określenia wskaźników w populacjach młodych komórek, 2) dokładnego określenia wieku komórek oraz 3) zdolności do wiarygodnego wzbogacania wystarczająco dużych populacji komórek macierzystych, aby odtwarzalnie mierzyć niestabilność genomu w starszym wieku. Dzięki takiemu podejściu system modelowy drożdży może przyczynić się do zdefiniowania mechanizmów odpowiedzialnych za zależne od wieku zmiany tempa i/lub częstości niestabilności genomu w komórkach mitotycznych aktywnych. Co więcej, czynniki genetyczne i środowiskowe mogą być szybko ocenione pod kątem wpływu na zależną od wieku niestabilności genomu. Ostatecznie charakterystyki te mogą doprowadzić do opracowania modeli, które uwzględniają sposób, w jaki mutacje akumulują się podczas starzenia replikacyjnego.

Metoda ta zależy od zdolności do wykrywania mutacji lub innych rodzajów niestabilności genomu poprzez pojawienie się wybieralnych fenotypów w celu pomiaru częstości takich zdarzeń. Jednak kreatywność w projektowaniu testów może pozwolić na zbadanie wielu aspektów niestabilności genomu. Na przykład geny URA3 i CAN1 można umieścić w różnych miejscach genomu, aby przetestować dowolny wpływ lokalizacji genomu na wyniki. Odwrócenie specyficznych niefunkcjonalnych alleli genów do funkcjonalnych alleli genów może przetestować określone procesy mutacyjne. Również wprowadzenie wielu nieaktywnych alleli genu lub flankowanie genu sekwencjami powtórzeń może być wykorzystane do zbadania zdarzeń rekombinacji poprzez odpowiednio przywrócenie lub utratę funkcji genu. Testy fluktuacyjne są standardowym podejściem do określania częstości występowania tych różnych zdarzeń niestabilności genomu9. Protokół został napisany przy użyciu dobrze akceptowanego i stosunkowo prostego estymatora mediany Lea-Coulsona w celu określenia wskaźnika mutacji, aby był bardziej dostępny dla różnych badaczy, mimo że metoda estymatora maksymalnego prawdopodobieństwa MSS jest uważana za najlepsze podejście do określania współczynników mutacji9. Estymator maksymalnego prawdopodobieństwa MSS został wcześniej szczegółowo oceniony 9 i może być stosowany jako metoda alternatywna, ale wymaga bardziej wyrafinowanych obliczeń. Alternatywnie, udostępniono darmowe oprogramowanie do obliczania współczynnika mutacji za pomocą tej metody22. Uzyskanie powtarzalnych pomiarów tempa mutacji wymaga zwrócenia uwagi na kilka aspektów projektowania eksperymentalnego, w tym użycie wystarczającej liczby powtórzonych kultur, inokulację kultur przy wystarczająco niskiej początkowej gęstości komórek, aby wielkość populacji wzrosła 10 000 razy lub więcej, oraz wybór odpowiednich objętości kultur, tak aby cała populacja komórek mogła zostać rozprzestrzeniona na selektywną pożywkę. W tym ostatnim punkcie można zastosować wcześniej opisany wzór do dostosowania szybkości mutacji w oparciu o frakcję badanej kultury9. Różnice w tempie wzrostu kultur mogą komplikować określenie powtarzalnego tempa mutacji, a zmodyfikowany estymator oparty na medianie, który może dać bardziej powtarzalne wyniki w takich sytuacjach, został niedawno opisany23.

Zdolność do dokładnego pomiaru wieku komórek jest kolejnym czynnikiem, który jest ważny dla ustalenia, czy częstość występowania niestabilności genomu w starych komórkach różni się od wartości oczekiwanych ze względu na szybkość zdarzeń w młodych komórkach. Stwierdziliśmy, że barwienie WGA jest lepsze niż barwienie bielą kalkofluorową, zarówno pod względem tła, jak i elastyczności, ponieważ WGA jest dostępne w postaci sprzężonej z różnymi cząsteczkami fluorescencyjnymi. Ta elastyczność może zapewnić więcej możliwości jednoczesnych pomiarów innych cech komórek za pomocą odczynników fluorescencyjnych. Wstępne prace mające na celu ustalenie związku między intensywnością sygnału dla barwienia WGA a odpowiednią liczbą blizn po pąkach na komórkach mogą następnie doprowadzić do szybszego określenia wieku komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Podejście to pozwala również na wykorzystanie większych rozmiarów populacji niż te, które byłyby zwykle badane pod mikroskopem, w celu poprawy odtwarzalności pomiarów. Podczas gdy wszystkie określenia wieku można uzyskać za pomocą badania mikroskopowego komórek, uważamy, że podejście oparte na cytometrii przepływowej ułatwia szybkie badania przesiewowe czynników, które wpływają na niestabilność genomu zależną od wieku.

Oprócz wiarygodnego pomiaru wieku komórki, należy wziąć pod uwagę liczbę podziałów komórkowych, którym mogą przechodzić komórki macierzyste w każdej kolejnej rundzie wzrostu i sortowania komórek. Zastosowanie mniejszej początkowej wielkości populacji lub większej objętości hodowli może pozwolić komórkom na przejście większej liczby podziałów komórkowych przed osiągnięciem pożądanej gęstości komórek. Na przykład inni badacze użyli tylko dwóch rund sortowania, aby uzyskać bardzo stare komórki drożdży16, co ma oczywistą zaletę polegającą na uzyskaniu starych komórek przy mniejszej liczbie etapów eksperymentalnych. Rozważając, czy zwiększyć objętość hodowli, aby umożliwić komórkom wykonanie większej liczby podziałów komórkowych przed sortowaniem, należy pamiętać o ograniczeniu całkowitej liczby komórek, które można przetworzyć w jednej kolumnie. Użycie większej objętości hodowli może wymagać użycia wielu kolumn do sortowania jednej populacji komórek. Ponadto, jeśli komórki przechodzą mniej rund podziału komórkowego między sortami/punktami zbierania, istnieje więcej możliwości zaobserwowania odchyleń od oczekiwanych częstotliwości mutacji w różnych punktach czasowych w ciągu życia. Na przykład, pobieranie próbek tylko we wczesnych i późnych punktach czasowych w ciągu życia może dostarczyć danych wskazujących na stały wzrost częstości mutacji, ale pobieranie próbek w dodatkowych okresach pośrednich w ciągu życia może pokazać, że częstość mutacji szybko rośnie, a następnie osiąga plateaus. Ponieważ jednak protokół ten izoluje stare komórki macierzyste, istnieje możliwość uzyskania bardziej bezpośredniego pomiaru zmian w tempie mutacji wraz z wiekiem. Testy fluktuacji można przeprowadzić przy użyciu komórek macierzystych w różnym wieku, aby określić, czy szybkość mutacji będzie się różnić od szybkości uzyskanej przy użyciu młodych komórek. Podczas gdy kultury do tych testów fluktuacji staną się mieszaniną starych i młodych komórek w miarę ich wzrostu, wszelkie odchylenia od szybkości uzyskanych począwszy od młodych komórek można przypisać zastosowaniu starszej populacji wyjściowej.

Zdolność do powtarzalnego uzyskania wystarczająco dużej populacji starzejących się komórek macierzystych, aby dokładnie zmierzyć niestabilność genomu, ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tego podejścia. Podczas gdy protokół opisuje użycie do tego celu określonego systemu sortowania magnetycznego, inne grupy posortowały komórki macierzyste drożdży za pomocą alternatywnych systemów14,18 (patrz tabela materiałów). Takie alternatywne systemy powinny również działać z tą metodą, chociaż może być wymagana pewna optymalizacja protokołów producentów. Niezależnie od zastosowanego systemu, wymagana wielkość populacji różni się w zależności od częstości występowania rodzaju mutacji lub rearanżacji genomu wybranego do badania. Musi być co najmniej wystarczająca liczba komórek macierzystych, aby uzyskać co najmniej jedną zmutowaną kolonię na populację w celu obliczenia częstości mutacji. W praktyce wyniki mogą być dość zmienne, jeśli od wielkości populacji oczekuje się od zera do pięciu zmutowanych kolonii, a nawet niewielki wzrost wielkości populacji, tak że oczekuje się od pięciu do dziesięciu zmutowanych kolonii, może znacznie poprawić odtwarzalność. Podczas znakowania biotyną populacji wyjściowej należy wziąć pod uwagę wydajność odzyskiwania dla każdego rodzaju, aby pomóc w określeniu odpowiedniej wielkości populacji niezbędnej do pomiaru częstotliwości mutacji w starych komórkach macierzystych. Przy 90% odzyskiwaniu komórek macierzystych po każdym sortowaniu, tylko 59% pierwotnej populacji zostałoby odzyskane po pięciu rundach wzrostu i sortowania. Spada to do ~33% odzysku pierwotnej populacji po pięciu rundach wzrostu i sortowania, jeśli tylko 80% znakowanych komórek macierzystych zostanie odzyskanych podczas każdego sortowania. Pomiar i maksymalizacja odzysku ma kluczowe znaczenie w przypadku pomiaru zdarzeń o niskiej częstotliwości, ponieważ dwu- lub trzykrotny spadek wielkości populacji może łatwo doprowadzić do niewiarygodnej liczby kolonii mutantów na populację.

Istnieje wiele opcji rozszerzenia lub modyfikacji tego protokołu w celu uzyskania szerszego zrozumienia niestabilności genomu podczas starzenia się komórek mitotycznych. Proste przykłady obejmują analizowanie, w jaki sposób zmiany w funkcjach genów, zmiany pożywki lub inne zmiany warunków środowiskowych zmieniają akumulację mutacji wraz z wiekiem. Wskaźniki mutacji dla młodych komórek ze zmienioną funkcją genów lub w odpowiednim stanie byłyby mierzone i wykorzystywane do określenia, czy mutacje kumulują się inaczej niż przewidywane przez wartości szybkości i inaczej niż w populacjach komórek kontrolnych. Populacje komórek w różnych momentach starzenia replikacyjnego mogą być narażone na określone czynniki stresogenne, takie jak reaktywne formy tlenu lub czynniki uszkadzające DNA. Przejściowe i łagodne narażenie na stres oksydacyjny nie zmieniło znacząco zdolności do sortowania komórek (ryc. 3), ale ostrzejsze stresy mogą komplikować regenerację komórek. Konieczne byłyby wstępne eksperymenty, aby sprawdzić, czy komórki macierzyste mogą być nadal skutecznie odzyskiwane po określonych stresach. Ponadto można szczegółowo przeanalizować charakterystykę komórkową izolowanych komórek macierzystych, w tym poziomy reaktywnych form tlenu, morfologię mitochondriów i wakuolarów oraz inne cechy fizjologiczne związane ze starzeniemsię 3. Co więcej, komórki macierzyste mogą stanowić populację wyjściową do dalszego leczenia lub manipulacji. Ponieważ komórki macierzyste i potomne są fizycznie oddzielone podczas zabiegu, komórki potomne są nadal dostępne do analizy. Na przykład, zmiany w cechach fizjologicznych komórek potomnych lub asymetryczne dziedziczenie uszkodzonych makrocząsteczek między komórkami matki i potomki drożdży24 można porównać z czasem wystąpienia jakichkolwiek interesujących zmian w częstościach/częstości mutacji. Częstość mutacji dla populacji komórek potomnych można również uzyskać, aby spróbować modelować, czy istnieje asymetryczne dziedziczenie mutacji podczas starzenia replikacyjnego. Podsumowując, połączenie wzbogacania komórek macierzystych poprzez magnetyczne sortowanie komórek z testami fluktuacji umożliwia efektywne zastosowanie zalet systemu modelowego S. cerevisiae do badania mechanizmów odpowiedzialnych za akumulację zmian genetycznych podczas starzenia się komórek mitotycznych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez grant R00AG031911 z National Institute on Aging of the National Institutes of Health dla P. H. M. Treść tego artykułu niekoniecznie odzwierciedla oficjalne poglądy National Institutes of Health.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-BiotinThermo Scientific21335100 mg
mikrogranulki antybiotynyMiltenyi Biotec130-090-4852 ml Mikrokulki sprzężone z monoklonalnymi mysimi przeciwciałami antybiotyny (izotyp: mysia IgG1)
Kolumny MACS LSMiltenyi Biotec130-042-40125 kolumn odpowiednich do separatora QuadroMACS Separator QuadroMACS
Miltenyi Zestawseparator130-090-976
Miltenyi Biotec130-091-051zawiera: separator QuadroMACS (130-090-976), MACS MultiStand (130-042-303), kolumny LS (130-042-401), stojak na probówki MACS 15 ml (130-091-052), jedną jednostkę mikrokulek MACS o pojemności 2 ml. Uwaga: Alternatywne systemy obejmują Dynabeads Biotin Binder i MagnaBind Magnetic Beads
BD Falcon Cell Strainer, 40 µ mBD Nauki biologiczne35234040 & mikro; m do stosowania z probówkami stożkowymi BD Falcon 50 ml. 50 w opakowaniu
Trypan BlueSigma-AldrichT6146, filtrowanie po rozpuszczeniu, ważne dla usunięcia cząstek stałych
aglutyninę z kiełków pszenicy Alexa Fluor488Life TechnologiesW11261Można również zastosować koniugaty o różnych widmach wzbudzenia/emisji
ProLong GoldLife TechnologiesP36930 10ml, można również użyć innych odczynników zapobiegających blaknięciu
startowy QuadroMACS tylko Biotec Można również zastosować proszekMożna również zastosować

Bibliografia

  1. Maslov, A. Y., Vijg, J. Genome instability, cancer and aging. Biochim Biophys Acta. 1790, 963-969 (2009).
  2. Maher, R. L., Branagan, A. M., Morrical, S. W. Coordination of DNA replication and recombination activities in the maintenance of genome stability. J Cell Biochem. 112, 2672-2682 (2011).
  3. Longo, V. D., Shadel, G. S., Kaeberlein, M., Kennedy, B. Replicative and chronological aging in Saccharomyces cerevisiae. Cell Metab. 16, 18-31 (2012).
  4. Madia, F., Gattazzo, C., Fabrizio, P., Longo, V. D. A simple model system for age-dependent DNA damage and cancer. Mech Ageing Dev. 128, 45-49 (2007).
  5. Madia, F., et al. Oncogene homologue Sch9 promotes age-dependent mutations by a superoxide and Rev1/Polzeta-dependent mechanism. J Cell Biol. 186, 509-523 (2009).
  6. Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 4916-4920 (2012).
  7. Xie, Z., et al. Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device. Aging Cell. 11, 599-606 (2012).
  8. McMurray, M. A., Gottschling, D. E. An age-induced switch to a hyper-recombinational state. Science. 301, 1908-1911 (2003).
  9. Foster, P. L. Methods for determining spontaneous mutation rates. Methods Enzymol. 409, 195-213 (2006).
  10. Boeke, J. D., LaCroute, F., Fink, G. R. A positive selection for mutants lacking orotidine-5"-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance. Mol Gen Genet. 197, 345-346 (1984).
  11. Whelan, W. L., Gocke, E., Manney, T. R. The CAN1 locus of Saccharomyces cerevisiae: fine-structure analysis and forward mutation rates. Genetics. 91, 35-51 (1979).
  12. Lindstrom, D. L., Gottschling, D. E. The mother enrichment program: a genetic system for facile replicative life span analysis in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 183, 413-422 (2009).
  13. Lindstrom, D. L., Leverich, C. K., Henderson, K. A., Gottschling, D. E. Replicative age induces mitotic recombination in the ribosomal RNA gene cluster of Saccharomyces cerevisiae. PLoS Genet. 7, e1002015(2011).
  14. Feser, J., et al. Elevated histone expression promotes life span extension. Mol Cell. 39, 724-735 (2010).
  15. Afonso, B., Silver, P. A., Ajo-Franklin, C. M. A synthetic circuit for selectively arresting daughter cells to create aging populations. Nucleic Acids Res. 38, 2727-2735 (2010).
  16. Smeal, T., Claus, J., Kennedy, B., Cole, F., Guarente, L. Loss of transcriptional silencing causes sterility in old mother cells of S. cerevisiae. Cell. 84, 633-642 (1996).
  17. Lam, Y. T., Aung-Htut, M. T., Lim, Y. L., Yang, H., Dawes, I. W. Changes in reactive oxygen species begin early during replicative aging of Saccharomyces cerevisiae cells. Free Radic Biol Med. 50, 963-970 (2011).
  18. Dang, W., et al. Histone H4 lysine 16 acetylation regulates cellular lifespan. Nature. 459, 802-807 (2009).
  19. Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).
  20. Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14, 115-132 (1998).
  21. Maxwell, P. H., Burhans, W. C., Curcio, M. J. Retrotransposition is associated with genome instability during chronological aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 20376-20381 (2011).
  22. Hall, B. M., Ma, C. X., Liang, P., Singh, K. K. Fluctuation analysis CalculatOR: a web tool for the determination of mutation rate using Luria-Delbruck fluctuation analysis. Bioinformatics. 25, 1564-1565 (2009).
  23. Wu, X., et al. A robust estimator of mutation rates. Mutat Res. 661, 101-109 (2009).
  24. Aguilaniu, H., Gustafsson, L., Rigoulet, M., Nyström, T. Asymmetric inheritance of oxidatively damaged proteins during cytokinesis. Science. 299, 1751-1753 (2003).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Starzenie replikacyjne dro d ymagnetyczna sortownia kom rekanaliza testu fluktuacyjnegopomiar cz stotliwo ci mutacjicytometria przep ywowa w badaniach starzeniawykrywanie blizn p czkowaniatest niestabilno ci genomustarzenie Saccharomyces cerevisiaeizolacja kom rek macierzystychobliczanie szybko ci mutacji

Powiązane artykuły