Zabójcze sztuczne komórki prezentujące antygen (KaAPC) do skutecznego zubożania in vitro ludzkich limfocytów T specyficznych dla antygenu

Podsumowanie

Przedstawiono wytyczne dotyczące generowania zabójczych komórek prezentujących sztuczny antygen, KaAPC, skutecznego narzędzia do in vitro wyczerpywania ludzkich limfocytów T specyficznych dla antygenu oraz alternatywnego rozwiązania dla immunoterapii komórkowej w leczeniu chorób autoimmunologicznych za pośrednictwem limfocytów T w sposób specyficzny dla antygenu bez narażania pozostałego układu odpornościowego.

Streszczenie

Obecne leczenie chorób autoimmunologicznych za pośrednictwem limfocytów T opiera się głównie na strategiach globalnej immunosupresji, której w dłuższej perspektywie towarzyszą niekorzystne skutki uboczne, takie jak zmniejszona zdolność do kontrolowania infekcji lub nowotworów złośliwych. W związku z tym należy opracować nowe podejścia, które będą ukierunkowane tylko na komórki pośredniczące w chorobie i pozostawią pozostały układ odpornościowy nienaruszony. W ciągu ostatniej dekady opracowano różne strategie immunoterapii komórkowej w celu modulowania odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem limfocytów T. Większość z tych podejść opiera się na indukujących tolerancję komórkach prezentujących antygen (APC). Jednak oprócz tego, że są technicznie trudne i kłopotliwe, takie podejścia oparte na komórkach są bardzo wrażliwe na odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T, co ogranicza ich zdolność terapeutyczną. W tym miejscu przedstawiamy protokół wytwarzania niekomórkowych komórek prezentujących sztuczny antygen zabójcy (KaAPC), który pozwala na wyczerpanie patologicznych limfocytów T przy jednoczesnym pozostawieniu pozostałego układu odpornościowego nietkniętego i funkcjonalnego. KaAPC jest alternatywnym rozwiązaniem dla immunoterapii komórkowej, które ma potencjał w leczeniu chorób autoimmunologicznych i odrzucenia przeszczepu alloidalnego poprzez regulację niepożądanych odpowiedzi limfocytów T w sposób specyficzny dla antygenu.

Wprowadzenie

W ciągu ostatnich dwóch dekad poczyniono znaczne postępy w zrozumieniu patogennych mechanizmów chorób autoimmunologicznych. Jednak najczęstsze metody leczenia nadal opierają się na kortykosteroidach, a także lekach immunosupresyjnych, takich jak analogi puryn, środki alkilujące i inhibitory kalcyneuryny¹. Stosowanie takich leków znacznie poprawiło rokowanie pacjentów, jednak leczenie nie zapewnia wyleczenia leżącego u podstaw zaburzenia immunologicznego. Ponadto pacjenci stają się podatni na infekcje i rozwój raka.

Dlatego ostatecznym celem leczenia chorób autoimmunologicznych za pośrednictwem limfocytów T i odrzucenia przeszczepów allogenicznych jest celowanie tylko w komórki T powodujące chorobę, przy jednoczesnym pozostawieniu pozostałego układu odpornościowego nietkniętego i kompetentnego do walki z zaburzeniami immunologicznymi. Wykorzystanie komórek prezentujących antygen (APC) jako leczenia w celu zahamowania odpowiedzi obwodowych limfocytów T zostało po raz pierwszy opisane już w latach 70. przez kilka grup. Od tego czasu opracowano wiele podejść opartych na komórkach (przegląd w Schütz et al.²). Strategie wykorzystujące APC zabójcę z ekspresją FasL jako komórki immunoregulacyjne wykazały obiecujące wyniki wskazujące na potencjał terapeutyczny w leczeniu autoimmunizacji, odrzucenia przeszczepu allogenicznego i przewlekłych infekcji. Istnieją jednak znaczne ograniczenia w strategiach wykorzystujących FasL Killer-APC, które ostatecznie ograniczyły ich zastosowanie kliniczne; (i) wytwarzanie lub izolowanie APC jest czasochłonne, pracochłonne i kosztowne, (ii) pacjenci cierpiący na cytopenię z powodu immunosupresji dostarczają ograniczoną ilość i jakość komórek, (iii) powlekanie lub transdukcja APC z sygnałami indukującymi apoptozę, takimi jak FasL, skutkuje bardzo zmiennymi fenotypami oraz (iv) Killer-APC są wrażliwe na cytotoksyczne funkcje efektorowe limfocytów T, co w konsekwencji zmniejsza ich potencjał terapeutyczny. W związku z tym trudno jest zagwarantować zdefiniowany, powtarzalny fenotyp Killer-APC, który można wykorzystać do specyficznej dla antygenu modulacji odpowiedzi limfocytów T in vivo.

Na podstawie naszej poprzedniej pracy z FasL z ekspresją Killer-APC^3-5 i sztucznymi komórkami prezentującymi antygen (aAPC)^6,7, opracowaliśmy podejście oparte na koralikach (KaAPC) do specyficznego dla antygenu hamowania lub eliminacji autoreaktywnych limfocytów T in vitro. KaAPC składa się z dimeru HLA-A2-Ig (sygnał 1) i anty-Fas mAb (sygnał indukujący apoptozę) kowalencyjnie unieruchomionych na powierzchni paramagnetycznego kulki lateksowej o wielkości 4,5 μm. Zubożają one limfocyty T specyficzne dla antygenu w sposób pośredniczy w Fas/FasL z hodowli komórek T o wielu specyficznościach w sposób specyficzny dla antygenu i niezależnie od szlaku śmierci komórki indukowanej aktywacją (AICD). Zależna od dawki apoptoza w docelowych limfocytach T jest indukowana szybko już po 30^minutach8.

KaAPC może być łatwo wygenerowany w kontrolowany sposób, zapewniając zdefiniowany fenotyp z półki i przezwyciężając większość niedociągnięć strategii wyczerpywania się opartych na komórkach. W związku z tym KaAPC wykazuje ogromny potencjał w leczeniu chorób autoimmunologicznych za pośrednictwem limfocytów T i odrzucania przeszczepów allogenicznych, przyczyniając się do postępu w dziedzinie strategii leczenia specyficznych dla limfocytów T.

Protokół

1. Generowanie KaAPC opartych na HLA-A2-Ig

1. Przygotować sterylny bufor boranowy. Sporządzić 0,1 M roztwór kwasu borowego w wodzie i dostosować pH do 7,0. Bufor przefiltrować sterylnie (0,22 μm) i przechowywać w temperaturze 4 °C.
2. Przygotować sterylny bufor do płukania kulek. Użyć fosforanowo-solnej soli buforowej (PBS) bez magnezu i wapnia. Dodać ludzką surowicę grupy AB do stężenia końcowego 3%. Dodać kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) do stężenia końcowego 2 mM. Dodać azotek sodu (NaN₃) do stężenia końcowego 0,01%. Bufor przefiltrować sterylnie (0,22 μm) i przechowywać w temperaturze 4 °C.
3. Przenieść 250 μl kulek epoksydowych (około 100 x 10⁶ kulek) ze stanu zapasów do sterylnej szklanej fiolki z zakrętką.
4. Dodać 250 μl buforu boranowego.
5. Umieścić szklaną fiolkę na magnesie i pozostawić kulki do przylgnięcia na 2 min; odessać bufor i zdjąć szklaną fiolkę z magnesu.
6. Przepłukać kulki raz 1 ml buforu boranowego.
7. Resuspendować kulki w 550 μl roztworu HLA-A2-Ig o stężeniu 0,018 μg/ml i przeciwciała mAb anty-CD95 ludzkiego (klon CH11) o stężeniu 3,64 μg/ml, a następnie delikatnie wymieszać poprzez potrząsanie. (Dodatkowe informacje znajdują się w sekcji dyskusji).
8. Inkubować szklaną fiolkę na rotatorze w trybie end-over-end w temperaturze 4 °C przez 24 h.
9. Odwirować kulki przy 300 x g przez 2 min.
10. Umieścić szklaną fiolkę na magnesie na 2 min i odessać „roztwór ładujący KaAPC”; zdjąć szklaną fiolkę z magnesu, dodać 1 ml buforu do płukania kulek i ostrożnie resuspendować poprzez potrząsanie.
11. Powtórzyć krok 1.10 dwukrotnie.
12. Inkubować szklaną fiolkę na rotatorze w temperaturze 4 °C przez 24 h w 1 ml buforu do płukania kulek. Na tym etapie wszystkie pozostałe miejsca wiązania białek zostaną zablokowane przez ludzką surowicę grupy AB zawartą w buforze do płukania kulek.
13. Odwirować kulki przy 300 x g przez 2 min.
14. Umieścić szklaną fiolkę na magnesie na 2 min i odessać bufor do płukania kulek; zdjąć szklaną fiolkę z magnesu i zastąpić roztwór 1 ml PBS.

2. Kontrola jakości, załadunek peptydów, płukanie, przechowywanie i stabilność KaAPC

1. Przenieś 1,5 x 10⁵ KaAPC do probówki do FACS i przemyj 1 ml buforu do mycia FACS.
2. Resuspenduj kuleczki w 100 μl buforu do mycia FACS i dodaj 1 μl przeciwciała anty-mysiego IgG1 PE (do detekcji części Fc HLA-A2-Ig) oraz 1 μl przeciwciała anty-mysiego IgM FITC (klon R6-60.2, do detekcji przeciwciała mAb przeciw ludzkiemu CD95).
3. Inkubuj przez 15 min w temperaturze 4 °C, przemyj 1 ml buforu do mycia FACS, a następnie resuspenduj w 250 μl buforu do mycia FACS i odczytaj barwienie za pomocą cytometrii przepływowej.

Rycina 1. Barwienie kontroli jakości (QC) partii KaAPC przygotowanej zgodnie z opisem w sekcji protokołu. Barwienie przeprowadzono zgodnie z opisem w sekcji 2 protokołu. HLA-A2-Ig wykryto przy użyciu przeciwciała mAb anty-mouse-IgG1 PE, natomiast anty-human-CD95 (anty-Fas) wykryto za pomocą przeciwciała mAb anty-mouse-IgM FITC (patrz sekcja 2.2 protokołu) (linia niebieska). Wypełnione czarne wykresy reprezentują puste kulki zabarwione odpowiednio przeciwciałem mAb anty-mouse-IgG1 PE lub mAb anty-mouse-IgM FITC. Liczby w prawym górnym rogu oznaczają średnią intensywność fluorescencji (MFI). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

4. W celu załadowania peptydów przenieść 20 x 10⁶ KaAPC do nowej sterylnej fiolki szklanej, umieścić na magnesie na 2 min, odessać PBS i resuspender kuleczki w 500 μl świeżego PBS z 5 μg peptydu (Należy pamiętać, że tylko peptydy ograniczone do HLA-A2 będą wiązać się z dimerem!).
5. Przechowywać załadowane KaAPC w temperaturze 4 °C do czasu użycia, przez co najmniej 3 dni, aby umożliwić wystarczające załadowanie peptydu na dimer HLA-A2-Ig.
6. Bezpośrednio przed użyciem wyprać załadowane peptydem KaAPC zgodnie z instrukcją w punkcie 1.14; powtórzyć ten krok co najmniej 6 razy.
   UWAGA: Jest to kluczowy etap zapewniający całkowite usunięcie wolnego peptydu, aby uniknąć fałszywie dodatnich wyników cytotoksyczności; wykazano, że pozostały wolny peptyd indukuje apoptozę w kulturach limfocytów T specyficznych dla antygenu⁹. Aby wykluczyć efekt rozpuszczalnego peptydu, należy przeprowadzić analizę kontrolnych próbek nadsączu z załadowanych peptydem i wypranych KaAPC (patrz 3.8).
7. Policzyć kuleczki za pomocą hemocytometru i oznaczyć datą, nazwą peptydu oraz stężeniem.
   UWAGA: Załadowane KaAPC pozostają funkcjonalne w temperaturze 4 °C przez co najmniej jeden miesiąc. Po upływie miesiąca ponowne załadowanie tym samym peptydem pozwala na wykorzystanie KaAPC przez okres do jednego roku.

3. Test zabijania KaAPC in vitro

1. Przygotować medium do kokultury. Przygotować kompletne medium RPMI uzupełnione o 3% czynnika wzrostu limfocytów T (wykonanego w laboratorium⁶) oraz 3% autologicznej plazmy dawcy. W przypadku braku autologicznej plazmy dawcy należy użyć inaktywowanego termicznie ludzkiego serum AB.
2. Przygotować bufor wiążący AnnexinV. Rozpuścić 8,12 g chlorku sodu (NaCl) i 0,12 g chlorku wapnia (CaCl₂) w 990 ml ddH₂O. Dodać 10 ml buforu HEPES 1M.
3. Wygenerować ludzkie limfocyty T swoiste względem antygenu. (Szczegółowy protokół znajduje się w poprzedniej publikacji⁷ wykorzystującej sztuczne komórki prezentujące antygen (aAPC)). Należy upewnić się, że swoistość peptydowa wynosi co najmniej >75%, co określono poprzez barwienie tetramerami.
4. Dla każdej próbki inkubować 2 x 10⁵ limfocytów T swoistych względem antygenu/studzienkę (w płytce 96-dołkowej o okrągłym dnie) w 200 μl medium do kokultury w stosunku 1:1 z KaAPC przez 48 hr w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C i 5% CO₂.
5. Zebrać próbki i przenieść je do probówki do FACS; przemyć 1 ml buforu wiążącego AnnexinV, odwirować przy 300 x g przez 5 min, odlać nadosad i resuspendować w 100 μl buforu wiążącego AnnexinV.
6. Przebarwić próbki przy użyciu 1 μl AnnexinV FITC i 5 μl 7-AAD przez 10-15 min w temperaturze pokojowej, przemyć 1 ml buforu wiążącego AnnexinV; odwirować przy 300 x g przez 5 min, odlać nadosad i resuspendować w 250 μl buforu wiążącego AnnexinV.
7. Próbki należy niezwłocznie odczytać na cytometrze przepływowym.
8. Przygotować następujące próbki w celu określenia swoistej dla antygenu cytotoksyczności wywołanej przez KaAPC: same limfocyty T; limfocyty T + rozpuszczalne przeciwciało anty-CD95; limfocyty T + nieobciążone KaAPC; limfocyty T + KaAPC obciążone niepoznawczym peptydem; limfocyty T + KaAPC obciążone poznawczym peptydem; limfocyty T + nadosad z KaAPC obciążonych poznawczym peptydem.

Rysunek 2. Test zabijania KaAPC. Kulki KaAPC obciążone peptydem lub kulki kontrolne (kulki tylko z HLA-A2-Ig) inkubowano przez 48 hr w stosunku 1:1 z limfocytami T specyficznymi dla CMVpp65 (~80%), a następnie zebrano i barwiono anneksyną V oraz jodkiem propidium (PI), aby określić stopień apoptozy za pomocą cytometrii przepływowej (patrz sekcja protokołu 3.3-3.7). ^{„poznawcze” (cognate)} odnosi się do kulek obciążonych CMVpp65, a ^{„niepoznawcze” (non-cognate)} do kulek obciążonych peptydem Mart-1. Liczby wskazują procent żywych limfocytów T w dolnym lewym kwadrancie każdego wykresu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

9. Aby przeprowadzić eksperymenty krzyżowe, należy wygenerować limfocyty T specyficzne dla dwóch różnych antygenów.
10. Dalszą ocenę zdolności KaAPC do specyficznego usuwania antygenu należy przeprowadzić wraz z jednoczesną analizą eliminacji specyficznych limfocytów T w heterogenicznej populacji tych komórek. (Szczegółowy protokół znajduje się w pracy Schütz et al.¹⁰).

Wyniki

Cechy tego protokołu obejmują zdefiniowaną generację fenotypu KaAPC, który wyświetla HLA-A2-Ig (sygnał 1) i anty-Fas mAb (sygnał apoptozy) w tym samym czasie, który w porównaniu do metod opartych na komórkach nie jest zmieniany przez skuteczność powlekania lub transdukcji i może być łatwo modulowany podczas produkcji (Rysunek 1). Ponadto KaAPC nie są wrażliwe na cytotoksyczne funkcje efektorowe limfocytów T, a ich funkcjonalność nie zależy od jakości autologicznych komórek prezentujących antygen przed i po manipulacji in vitro.

KaAPC są zdolne do zubożenia limfocytów T specyficznych dla antygenu in vitro, gdy są załadowane pokrewnym peptydem, podczas gdy niepowiązane naładowane KaAPC nie zubożą limfocytów T (Rysunek 2). Dlatego KaAPC indukuje apoptozę limfocytów T w sposób specyficzny dla antygenu. Następnie użyliśmy KaAPC do selektywnego zubożenia limfocytów T specyficznych dla antygenu z mieszaniny o różnych specyficznościach limfocytów T, wykazując, że tylko minimalna cytotoksyczność przeciekała do sąsiednich limfocytów T (Figura 3). W związku z tym KaAPC stanowi znakomite narzędzie do specyficznego dla antygenu in vitro zubożenia ludzkich aktywowanych limfocytów T specyficznych dla antygenu o potencjalnym zastosowaniu klinicznym w leczeniu chorób autoimmunologicznych i odrzucenia przeszczepu allogenicznego.

Dyskusja

Kluczowym etapem protokołu jest zapewnienie odpowiedniego stosunku sygnału 1 (peptyd MHC) do sygnału 2 (przeciwciało monoklonalne anty-Fas). Przeprowadziliśmy intensywne doświadczenia z miareczkowaniem w celu określenia optymalnego stosunku sygnału 1 i 2; okazało się, że minimalne różnice wynikające z odmiennego stężenia dimeru HLA-A2 Ig lub przeciwciała anty-Fas mogą zakłócać funkcjonalność KaAPC. W związku z tym stężenie obu sygnałów powinno być zawsze weryfikowane, a jakość obu białek regularnie badana, nawet jeśli zostały one zakupione u komercyjnego dostawcy. Ponadto stężenia powinny być zawsze wyznaczane przy użyciu tej samej metody, ponieważ różne testy detekcyjne mogą prowadzić do uzyskania odmiennych wyników stężeń. Funkcjonalność HLA-A2-Ig może być również upośledzona z powodu niepełnego refoldingu i/lub nieefektywnego ładowania peptydów. Co więcej, cząsteczki dimerów mogą agregować w różnym stopniu, co może wpływać na aktywność funkcjonalną białka. W związku z tym rzeczywista ilość dimeru potrzebna do generowania funkcjonalnych i specyficznych KaAPC może się różnić. Ponadto stwierdziliśmy, że optymalny zakres sygnału indukującego śmierć (przeciwciało anty-Fas) na KaAPC jest niezwykle wąski. W naszych badaniach stężenia przekraczające 3,64 μg/ml prowadziły do niespecyficznego zabijania limfocytów T dodatnich dla Fas, natomiast stężenia poniżej 3,64 μg/ml skutkowały zależnym od dawki obniżeniem aktywności cytotoksycznej. Choć warunki te wydają się bardzo rygorystyczne, dbałość o te szczegóły pozwoli na wytworzenie funkcjonalnych i specyficznych KaAPC.

Choć obecny fenotyp KaAPC jest funkcjonalny w zakresie usuwania aktywowanych antygenowo swoistych limfocytów T, wstępne eksperymenty celujące w naiwne lub spoczynkowe antygenowo swoiste limfocyty T nie wykazały istotnej indukcji apoptozy swoistej dla antygenu, ponieważ populacje te charakteryzują się obniżoną ekspresją Fas. W związku z tym można by rozważyć dodanie sygnału kostymulującego do KaAPC w celu indukcji up-regulacji Fas na spoczynkowych limfocytach T, aby uczynić je celem dla KaAPC. Choć jest to wykonalne, wszystkie trzy sygnały będą musiały zostać starannie miareczkowane, aby zapewnić funkcjonalny fenotyp KaAPC.

Dostosowanie platformy koralikowej do matrycy biokompatybilnej lub biodegradowalnej zwiększy możliwości zastosowania KaAPC in vivo. Niedawno Shen et al. zgłosili pomyślne zastosowanie KaAPC in vivo z wykorzystaniem lateksowych koralików o rozmiarze 5 μm skoniugowanych z przeciwciałami anty-Fas (klon Jo2) oraz anty-His/H2-K^b-TRP2¹¹. Wykazaliśmy, że ogólna koncepcja sztucznych komórek prezentujących antygen (aAPC) może zostać z sukcesem przeniesiona z cząstek o rozmiarach mikrometrycznych (μm) na cząstki o rozmiarach nanometrycznych (nm)¹² oraz że funkcjonalność ta jest zależna od geometrii cząstek¹³. Zatem poprzez zmianę rozmiaru i/lub kształtu przyszłych projektów KaAPC można wpłynąć na funkcjonalność i biodystrybucję in vivo, co może mieć kluczowe znaczenie dla skutecznego leczenia narządowych chorób autoimmunologicznych.

KaAPC pokonują główne wady strategii deplekcji opartych na komórkach, stanowiąc łatwą w użyciu, gotową do zastosowania („off the shelf”), a także efektywną pod względem czasu i kosztów metodę, która jest niezależna od stanu dawcy i wcześniejszego leczenia. KaAPC nie są celami dla sygnałów zabijania autokrynnego ani parakrynnego i nie wykazują wrażliwości na cytolityczne funkcje efektorowe CTL. Zastosowanie KaAPC wymaga zidentyfikowania odpowiedniego antygenu chorobowego i opiera się na ich specyficznym typie HLA. Choć obecnie zidentyfikowano liczne odpowiednie antygeny ograniczone przez HLA-A2 dla cukrzycy typu 1, GvHD i stwardnienia rozsianego², opracowanie dodatkowych cząsteczek dimerów HLA klasy I, a także trwająca identyfikacja nowych antygenów istotnych w chorobach autoimmunologicznych, będzie dalej zwiększać i rozszerzać możliwości zastosowania KaAPC. Ponadto można rozważyć wykorzystanie KaAPC skierowanych przeciwko różnym epitopom w celu jednoczesnego uderzenia w wiele antygenów.

Podsumowując, KaAPC stanowią elastyczną platformę technologiczną do usuwania antygenowo swoistych limfocytów T. Ich „klockowa” natura umożliwia włączenie nowych sygnałów, takich jak dodatkowe sygnały kostymulujące lub hamujące, np. PD1 lub TRAIL, na różnych matrycach, co mogłoby rozszerzyć i zwiększyć ich późniejszą przydatność in vitro oraz in vivo. Przedstawiamy tutaj protokół krok po kroku generowania KaAPC, pierwszego podejścia opartego na koralikach w celu eliminacji antygenowo swoistych limfocytów T z mieszanin limfocytów T o różnych swoistościach.

Rycina 3. KaAPC eliminują CTL w sposób swoisty dla antygenu. Oznakowane PKH26 aktywowane Fas⁺ efektorowe komórki pamięci CTL oraz oznakowane PKH67 CTL swoiste dla CMVpp65 od tego samego dawcy zmieszano w stosunku 1:1 i współhodowano z ^CMVpp65KaAPC przez 48 h. Kultury kontrolne traktowano ^{nieobciążonymi} KaAPC lub 1 µg/ml rozpuszczalnego przeciwciała anty-Fas-mAb (klon CH11). Minimalną utratę żywych komórek stwierdzono w nieleczonych mieszanych kulturach CTL (T_mix). Przedstawiono oryginalne dane FACS dla każdej populacji CTL z T_mix. Analizę apoptozy przeprowadzono zgodnie z wcześniejszą publikacją, stosując oddzielne bramkowanie dla obu populacji limfocytów T¹⁰. Liczby przedstawione w górnych lewych kwadrantach oznaczają % wszystkich komórek. Ilustracja pochodzi z jednego reprezentatywnego doświadczenia przeprowadzonego w ramach trzech niezależnych eksperymentów. Badanie to zostało pierwotnie opublikowane w czasopiśmie Blood. Schütz, C. et al. Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells. Blood. 2008; 111, 3546–52. Copyright the American Society of Hematology. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
PBS	Corning	21-040-CV
Ludzka surowica AB	Atlanta biologiczna	S40110
EDTA	Sigma/Aldrich	E5134
Azydek sodu	Sigma/Aldrich	71289
M-450 żywice epoksydowe	Magnes Invitrogen/Dynal	14011
MPC-1	Invitrogen/Dynal	12001D
Zakręcana szklana fiolka	Fisher Scientific	03-338AA
MACSmix Tube Rotator	Miltenyi	130-090-753
anty-CD95 (klon CH11)	Milliore	05-201
HLA-A2-Ig dimer	BD/Pharmingen	551263
Cryo-tube 2 ml	Corning	430488
anty-mysi IgG1 PE	BD/ Pharmingen	559320
przeciw mysim IgM FITC	BD/Pharmingen	553408
Chlorek sodu	Merck	S271-3
Chlorek wapnia	Sigma/Aldrich	C5080
HEPES	cellgro/Mediatech	25-060-CI
RPMI	gibco/life technologies	11875-085
96-dołkowy okrągły płyta dolna	Falcon	353077
AnnexinV FITC	PromoKine	PK-CA577-1001-1000
7-AAD	BD/Pharmingen	51-68981E
Rurki FACS	Falcon	352008