Artykuł metodologiczny

Zabójcze sztuczne komórki prezentujące antygen (KaAPC) do skutecznego zubożania in vitro ludzkich limfocytów T specyficznych dla antygenu

DOI:

10.3791/51859

⸱

11 sierpnia 2014

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Institute of Cell Engineering, Johns Hopkins University, 2Department of Internal Medicine I, University of Regensburg, 3Department of Rheumatology, Asklepios Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono wytyczne dotyczące generowania zabójczych komórek prezentujących sztuczny antygen, KaAPC, skutecznego narzędzia do in vitro wyczerpywania ludzkich limfocytów T specyficznych dla antygenu oraz alternatywnego rozwiązania dla immunoterapii komórkowej w leczeniu chorób autoimmunologicznych za pośrednictwem limfocytów T w sposób specyficzny dla antygenu bez narażania pozostałego układu odpornościowego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecne leczenie chorób autoimmunologicznych za pośrednictwem limfocytów T opiera się głównie na strategiach globalnej immunosupresji, której w dłuższej perspektywie towarzyszą niekorzystne skutki uboczne, takie jak zmniejszona zdolność do kontrolowania infekcji lub nowotworów złośliwych. W związku z tym należy opracować nowe podejścia, które będą ukierunkowane tylko na komórki pośredniczące w chorobie i pozostawią pozostały układ odpornościowy nienaruszony. W ciągu ostatniej dekady opracowano różne strategie immunoterapii komórkowej w celu modulowania odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem limfocytów T. Większość z tych podejść opiera się na indukujących tolerancję komórkach prezentujących antygen (APC). Jednak oprócz tego, że są technicznie trudne i kłopotliwe, takie podejścia oparte na komórkach są bardzo wrażliwe na odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T, co ogranicza ich zdolność terapeutyczną. W tym miejscu przedstawiamy protokół wytwarzania niekomórkowych komórek prezentujących sztuczny antygen zabójcy (KaAPC), który pozwala na wyczerpanie patologicznych limfocytów T przy jednoczesnym pozostawieniu pozostałego układu odpornościowego nietkniętego i funkcjonalnego. KaAPC jest alternatywnym rozwiązaniem dla immunoterapii komórkowej, które ma potencjał w leczeniu chorób autoimmunologicznych i odrzucenia przeszczepu alloidalnego poprzez regulację niepożądanych odpowiedzi limfocytów T w sposób specyficzny dla antygenu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatnich dwóch dekad poczyniono znaczne postępy w zrozumieniu patogennych mechanizmów chorób autoimmunologicznych. Jednak najczęstsze metody leczenia nadal opierają się na kortykosteroidach, a także lekach immunosupresyjnych, takich jak analogi puryn, środki alkilujące i inhibitory kalcyneuryny1. Stosowanie takich leków znacznie poprawiło rokowanie pacjentów, jednak leczenie nie zapewnia wyleczenia leżącego u podstaw zaburzenia immunologicznego. Ponadto pacjenci stają się podatni na infekcje i rozwój raka.

Dlatego ostatecznym celem leczenia chorób autoimmunologicznych za pośrednictwem limfocytów T i odrzucenia przeszczepów allogenicznych jest celowanie tylko w komórki T powodujące chorobę, przy jednoczesnym pozostawieniu pozostałego układu odpornościowego nietkniętego i kompetentnego do walki z zaburzeniami immunologicznymi. Wykorzystanie komórek prezentujących antygen (APC) jako leczenia w celu zahamowania odpowiedzi obwodowych limfocytów T zostało po raz pierwszy opisane już w latach 70. przez kilka grup. Od tego czasu opracowano wiele podejść opartych na komórkach (przegląd w Schütz et al.2). Strategie wykorzystujące APC zabójcę z ekspresją FasL jako komórki immunoregulacyjne wykazały obiecujące wyniki wskazujące na potencjał terapeutyczny w leczeniu autoimmunizacji, odrzucenia przeszczepu allogenicznego i przewlekłych infekcji. Istnieją jednak znaczne ograniczenia w strategiach wykorzystujących FasL Killer-APC, które ostatecznie ograniczyły ich zastosowanie kliniczne; (i) wytwarzanie lub izolowanie APC jest czasochłonne, pracochłonne i kosztowne, (ii) pacjenci cierpiący na cytopenię z powodu immunosupresji dostarczają ograniczoną ilość i jakość komórek, (iii) powlekanie lub transdukcja APC z sygnałami indukującymi apoptozę, takimi jak FasL, skutkuje bardzo zmiennymi fenotypami oraz (iv) Killer-APC są wrażliwe na cytotoksyczne funkcje efektorowe limfocytów T, co w konsekwencji zmniejsza ich potencjał terapeutyczny. W związku z tym trudno jest zagwarantować zdefiniowany, powtarzalny fenotyp Killer-APC, który można wykorzystać do specyficznej dla antygenu modulacji odpowiedzi limfocytów T in vivo.

Na podstawie naszej poprzedniej pracy z FasL z ekspresją Killer-APC3-5 i sztucznymi komórkami prezentującymi antygen (aAPC)6,7, opracowaliśmy podejście oparte na koralikach (KaAPC) do specyficznego dla antygenu hamowania lub eliminacji autoreaktywnych limfocytów T in vitro. KaAPC składa się z dimeru HLA-A2-Ig (sygnał 1) i anty-Fas mAb (sygnał indukujący apoptozę) kowalencyjnie unieruchomionych na powierzchni paramagnetycznego kulki lateksowej o wielkości 4,5 μm. Zubożają one limfocyty T specyficzne dla antygenu w sposób pośredniczy w Fas/FasL z hodowli komórek T o wielu specyficznościach w sposób specyficzny dla antygenu i niezależnie od szlaku śmierci komórki indukowanej aktywacją (AICD). Zależna od dawki apoptoza w docelowych limfocytach T jest indukowana szybko już po 30minutach8.

KaAPC może być łatwo wygenerowany w kontrolowany sposób, zapewniając zdefiniowany fenotyp z półki i przezwyciężając większość niedociągnięć strategii wyczerpywania się opartych na komórkach. W związku z tym KaAPC wykazuje ogromny potencjał w leczeniu chorób autoimmunologicznych za pośrednictwem limfocytów T i odrzucania przeszczepów allogenicznych, przyczyniając się do postępu w dziedzinie strategii leczenia specyficznych dla limfocytów T.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generacja KaAPC opartego na HLA-A2-IG

  1. Przygotować sterylny bufor boranowy. Przygotować 0,1 M roztwór kwasu borowego w wodzie i dostosować pH do 7,0. Sterylny bufor filtra (0,22 μm) i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotuj sterylny bufor do płukania kulek. Stosować sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) bez magnezu i wapnia. Dodaj ludzką surowicę AB dla uzyskania 3% końcowego stężenia. Dodać kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) o końcowym stężeniu 2 mM. Dodać azydek sodu (NaN3) dla uzyskania 0,01% stężenia końcowego. Sterylny bufor filtra (0,22 μm) i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Przenieś 250 μl kulek epoksydowych (około 100 x 106 kulek) z wywaru do sterylnej, zakręcanej szklanej fiolki.
  4. Dodać 250 μl buforu boranowego.
  5. Umieść szklaną fiolkę na magnesie i pozwól kulkom przylegać przez 2 minuty; odessać bufor i usunąć szklaną fiolkę z magnesu.
  6. Umyj koraliki raz 1 ml buforu boranowego.
  7. Ponownie zawiesić kulki w 550 μl 0,018 μg/ml HLA-A2-Ig i 3,64 μg/ml anty-ludzkiego mAb CD95 (klon CH11) i delikatnie wymieszać przez wstrząsanie. (Dodatkowe informacje można znaleźć w sekcji dyskusji).
  8. Inkubować szklaną fiolkę na obracaczu w temperaturze 4 °C przez 24 godziny.
  9. Wirować koraliki o gramaturze 300 x g przez 2 min.
  10. Umieścić szklaną fiolkę na magnesie na 2 minuty i odessać "roztwór ładujący KaAPC"; wyjąć szklaną fiolkę z magnesu, dodać 1 ml buforu do przemywania kulek i ostrożnie zawiesić przez wstrząsanie.
  11. Powtórz krok 1.10 dwa razy.
  12. Inkubować szklaną fiolkę na rotatorze w temperaturze 4 °C przez 24 godziny w 1 ml buforze do przemywania kulek. W tym momencie wszystkie pozostałe miejsca wiązania białek zostaną zablokowane przez ludzką surowicę AB zawartą w buforze do płukania kulek.
  13. Wirować koraliki o gramaturze 300 x g przez 2 min.
  14. Umieścić szklaną fiolkę na magnesie na 2 minuty i odessać bufor do płukania kulek; wyjąć szklaną fiolkę z magnesu i zastąpić roztwór 1 ml PBS.

2. Kontrola jakości, załadunek peptydów, mycie, przechowywanie i stabilność KaAPC

  1. Przenieść 1,5 x 105 KaAPC do probówki FACS i przemyć 1 ml buforu do płukania FACS.
  2. Ponownie zawiesić kulki w 100 μl buforu płuczącego FACS i dodać 1 μl anty-mysiej IgG1 PE (do wykrywania części Fc HLA-A2-Ig) i 1 μl anty-mysiej IgM FITC (klon R6-60.2, do wykrywania anty-ludzkiego mAb CD95).
  3. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C, przemyć 1 ml buforu płuczącego FACS i ponownie zawiesić w 250 μl buforu płuczącego FACS i odczytać barwienie metodą cytometrii przepływowej.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Plama QC partii KaAPC wykonana zgodnie z opisem w sekcji protokołu. Barwienie przeprowadzono zgodnie z opisem w punkcie 2 protokołu. HLA-A2-Ig wykryto za pomocą mAb PE anty-mysiego IgG1, podczas gdy anty-ludzki CD95 (anty-Fas) wykryto za pomocą mAb anty-mysiego IgM FITC (patrz sekcja 2.2 protokołu) (niebieska linia). Wypełnione czarne wykresy reprezentują puste koraliki zabarwione odpowiednio mAb PE anty-myszy-IgG1 lub anty-mysi IgM FITC mAb. Liczby w prawym górnym rogu wskazują średnie natężenie fluorescencji (MIF). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. W celu obciążenia peptydem przenieś 20 x 106 KaAPC do nowej sterylnej szklanej fiolki, umieść na magnesie na 2 minuty, odessaj PBS i ponownie zawieś kulki w 500 μl świeżego PBS z peptydem 5 μg (należy pamiętać, że tylko peptydy z ograniczeniami HLA-A2 zwiążą się z dimerem!).
  2. Załadowany KaAPC należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia, przez co najmniej 3 dni, aby umożliwić wystarczające naładowanie peptydów na dimer HLA-A2-Ig.
  3. Bezpośrednio przed użyciem umyć KaAPC z peptydem w sposób wskazany w ppkt 1.14; powtórzyć ten krok co najmniej 6 razy więcej
    UWAGA: Jest to kluczowy krok w celu zapewnienia, że wolny peptyd musi zostać całkowicie usunięty, aby uniknąć fałszywie dodatnich wyników zabijania; Wykazano, że resztkowy wolny peptyd indukuje apoptozę w hodowlach komórek T specyficznych dla antygenu9. Aby wykluczyć efekt rozpuszczalnego peptydu, należy uruchomić próbki kontrolne supernatantu z peptydem załadowanym i przemytym KaAPC (patrz 3.8).
  4. Policz koraliki za pomocą hemocytometru i etykiety z datą, nazwą peptydu i stężeniem.
    UWAGA: Załadowane KaAPC pozostają sprawne w temperaturze 4 °C przez co najmniej jeden miesiąc. Po miesiącu ponowne załadowanie tym samym peptydem pozwala na użytkowanie KaAPC przez okres do jednego roku.

3. Test zabijania in vitro KaAPC

  1. Przygotuj pożywki do wspólnej hodowli. Przygotuj kompletną pożywkę RPMI uzupełnioną 3% czynnikiem wzrostu limfocytów T (wyprodukowanym w laboratorium6) i 3% autologicznym osoczem dawcy. Jeśli autologiczne osocze dawcy jest niedostępne, należy użyć inaktywowanej termicznie ludzkiej surowicy AB.
  2. Przygotować preparat buforu wiążącego AnnexinV. Rozpuścić 8,12 g chlorku sodu (NaCl) i 0,12 g chlorku wapnia (CaCl2) w 990 ml ddH2O. Dodać 10 ml 1M buforu HEPES.
  3. Generuj ludzkie limfocyty T specyficzne dla antygenu. (Szczegółowy protokół znajduje się w poprzedniej publikacji7 wykorzystującej sztuczne komórki prezentujące antygen (aAPC)). Upewnij się, że swoistość peptydów wynosi co najmniej >75%, jak określono za pomocą barwienia tetramerowego.
  4. Dla każdej próbki inkubować 2 x 105 limfocytów T specyficznych dla antygenu/basenik (w 96-dołkowej okrągłej płytce dennej) w 200 μl pożywki do kohodowli w stosunku 1:1 z KaAPC przez 48 godzin w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  5. Pobrać próbki i przenieść je do probówki FACS; przemyć 1 ml buforu wiążącego AnnexinV, odwirować w czasie 300 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 100 μl buforu wiążącego AnnexinV
  6. Próbki barwić 1 μl AnnexinV FITC i 5 μl 7-AAD przez 10-15 min w temperaturze suchej, przemywać 1 ml buforu wiążącego AnnexinV; wirować przy 300 x g przez 5 min, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 250 μl buforu wiążącego AnnexinV
  7. Odczytać próbki natychmiast na cytometrze przepływowym.
  8. Przygotować następujące próbki w celu określenia swoistego dla antygenu zabijania przez KaAPC: tylko limfocyty T; Limfocyty T + rozpuszczalny anty-CD95; Limfocyty T + niezaładowany KaAPC; Limfocyty T + niepokrewny peptyd obciążony KaAPC; Limfocyty T + pokrewny peptyd obciążony KaAPC; Limfocyty T + supernatant pokrewnego peptydu obciążonego KaAPC.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Test uśmiercania KaAPC. Naładowany peptydami KaAPC lub kulki kontrolne (tylko kulki HLA-A2-Ig) hodowano przez 48 godzin w stosunku 1: 1 z limfocytami T specyficznymi dla CMVpp65 (~ 80%), zebrano, a następnie wybarwiono Aneksyną V i jodkiem propidyny (PI) w celu określenia apoptozy za pomocą cytometrii przepływowej (patrz sekcja protokołu 3.3-3.7). "pokrewny" odnosi się do kulek załadowanych CMVpp65, a "niepokrewny" do kulek załadowanych peptydem Mart-1. Liczby wskazują procent żywotnych limfocytów T w lewym dolnym kwadrancie każdego wykresu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Aby przeprowadzić eksperymenty krzyżowe, wygeneruj specyficzne dla antygenu limfocyty T o dwóch różnych specyficznościach.
  2. Dalsza ocena specyficznych dla antygenu zdolności KaAPC do zubożenia z jednoczesną analizą specyficznej dla antygenu eliminacji limfocytów T w heterogenicznej populacji limfocytów T. (Szczegółowy protokół znajduje się w Schütz et al.Rozdział 10).

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cechy tego protokołu obejmują zdefiniowaną generację fenotypu KaAPC, który wyświetla HLA-A2-Ig (sygnał 1) i anty-Fas mAb (sygnał apoptozy) w tym samym czasie, który w porównaniu do metod opartych na komórkach nie jest zmieniany przez skuteczność powlekania lub transdukcji i może być łatwo modulowany podczas produkcji (Rysunek 1). Ponadto KaAPC nie są wrażliwe na cytotoksyczne funkcje efektorowe limfocytów T, a ich funkcjonalność nie zależy od jakości autologicznych komórek prezentujących antygen przed i po manipulacji in vitro.

KaAPC są zdolne do zubożenia limfocytów T specyficznych dla antygenu in vitro, gdy są załadowane pokrewnym peptydem, podczas gdy niepowiązane naładowane KaAPC nie zubożą limfocytów T (Rysunek 2). Dlatego KaAPC indukuje apoptozę limfocytów T w sposób specyficzny dla antygenu. Następnie użyliśmy KaAPC do selektywnego zubożenia limfocytów T specyficznych dla antygenu z mieszaniny o różnych specyficznościach limfocytów T, wykazując, że tylko minimalna cytotoksyczność przeciekała do sąsiednich limfocytów T (Figura 3). W związku z tym KaAPC stanowi znakomite narzędzie do specyficznego dla antygenu in vitro zubożenia ludzkich aktywowanych limfocytów T specyficznych dla antygenu o potencjalnym zastosowaniu klinicznym w leczeniu chorób autoimmunologicznych i odrzucenia przeszczepu allogenicznego.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najważniejszym krokiem w protokole jest zapewnienie odpowiedniego stosunku sygnału 1 (peptyd MHC) i sygnału 2 (anty-Fas mAb). Przeprowadziliśmy intensywne eksperymenty miareczkowe, aby określić idealny stosunek dla sygnału 1 i 2; stało się oczywiste, że minimalne różnice wynikające z różnic w stężeniach dimerów Ig HLA-A2 lub mAb anty-Fas mogą zakłócać funkcjonalność KaAPC. W związku z tym stężenie obu sygnałów powinno być zawsze weryfikowane, a jakość obu białek powinna być często badana, nawet jeśli została zamówiona ze źródła komercyjnego. Ponadto stężenia powinny być zawsze oznaczane za pomocą tego samego testu, ponieważ różne testy wykrywania mogą prowadzić do różnych stężeń. Funkcjonalność HLA-A2-Ig może być również osłabiona z powodu niepełnego ponownego fałdowania i/lub nieefektywnego ładowania peptydów. Ponadto cząsteczki dimerów mogą agregować się w różnym stopniu, co może mieć wpływ na aktywność funkcjonalną białka. W związku z tym rzeczywista ilość dimeru potrzebna do wytworzenia funkcjonalnego i specyficznego KaAPC może się różnić. Ponadto odkryliśmy, że idealny zakres dla indukującego śmierć sygnału anty-Fas mAb na KaAPC jest niezwykle wąski. W naszych rękach ilości większe niż 3,64 μg / ml prowadzą do nieswoistego zabijania limfocytów T Fas dodatnich, podczas gdy ilości poniżej 3,64 μg / ml powodowały w zależności od dawki zmniejszoną aktywność zabijania. Chociaż warunki te wydają się dość napięte, zwrócenie uwagi na te szczegóły zaowocuje wygenerowaniem funkcjonalnego i specyficznego KaAPC.

Podczas gdy obecny fenotyp KaAPC jest funkcjonalny w przypadku zubożenia aktywowanych limfocytów T specyficznych dla antygenu, początkowe eksperymenty ukierunkowane na naiwne lub spoczynkowe limfocyty T specyficzne dla antygenu nie wykazały znaczącej indukcji apoptozy specyficznej dla antygenu, ponieważ populacje te mają zmniejszoną ekspresję Fas. Dlatego można sobie wyobrazić dodanie sygnału kostymulującego do KaAPC, aby indukować regulację w górę Fas na spoczynkowych limfocytach T, aby przekształcić je w cel dla KaAPC. Chociaż jest to wykonalne, wszystkie trzy sygnały będą musiały być starannie miareczkowane, aby zapewnić funkcjonalny fenotyp KaAPC.

Dostosowanie platformy perełkowej do biokompatybilnej lub biodegradowalnej matrycy zwiększy możliwości zastosowania KaAPC in vivo. Ostatnio Shen i wsp. donieśli o udanym zastosowaniu in vivo KaAPC przy użyciu kulek lateksowych 5 μm sprzężonych z anty-Fas (klon Jo2) i anty-His/H2-K b-TRP211. Udało nam się wykazać, że ogólna koncepcja sztucznych komórek prezentujących antygen (aAPC) może być z powodzeniem przenoszona z cząstek o wielkości μm na cząstki o wielkości nm12 i że na funkcjonalność ma wpływ geometria cząstek13. W ten sposób, zmieniając rozmiar i/lub kształt przyszłych projektów KaAPC, można być w stanie wpłynąć na funkcjonalność in vivo i biodystrybucję, co może być kluczem do skutecznego leczenia chorób autoimmunologicznych specyficznych dla narządów.

KaAPC przezwycięża główne niedociągnięcia strategii zmniejszania zużycia komórek w oparciu o metodę łatwą w użyciu, efektywną czasowo i kosztowo, która jest niezależna od stanu dawcy i wstępnego leczenia. KaAPC nie są celami sygnalizacji samozabijania lub parakrynnego i nie są wrażliwe na cytolityczne funkcje efektorowe CTL. KaAPC będzie wymagało identyfikacji odpowiedniego antygenu choroby i będzie opierać się na ich specyficznym typie HLA. Chociaż obecnie zidentyfikowano wiele odpowiednich antygenów z ograniczeniami HLA-A2 dla cukrzycy typu 1, GvHD i stwardnienia rozsianego2, opracowanie dodatkowych cząsteczek dimerów HLA klasy I, a także trwająca identyfikacja nowych antygenów autoimmunologicznych jeszcze bardziej zwiększy i poszerzy możliwości zastosowania KaAPC. Co więcej, można by pomyśleć o użyciu KaAPC skierowanego na różne epitopy, aby celować w wiele antygenów jednocześnie.

Podsumowując, KaAPC stanowi elastyczną technologię platformy do zubożania limfocytów T specyficznych dla antygenu. Ich "podobny do klocków lego" charakter umożliwia włączenie nowych sygnałów, takich jak dodatkowe sygnały kostymulujące lub hamujące, takie jak PD1 lub TRAIL, do różnych matryc, co może poszerzyć i zwiększyć ich późniejsze zastosowanie in vitro i in vivo . Poniżej przedstawiamy krok po kroku protokół generowania KaAPC, pierwszego opartego na kulkach podejścia do eliminacji limfocytów T specyficznych dla antygenu z mieszanin limfocytów T o różnej specyficzności.

Flow cytometry dot plot diagram showing CTL activation and Annexin V-APC staining analysis.
Rysunek 3. KaAPC eliminuje CTL w sposób specyficzny dla antygenu. CTL z aktywowaną pamięcią efektorową Fas+ znakowaną PKH26 i CTL specyficzną dla CMVpp65 znakowaną PKH67 od tego samego dawcy zmieszano w stosunku 1:1 i współhodowano z CMVpp65KaAPC przez 48 godzin. Kultury kontrolne traktowano niezaładowanymKaAPC lub 1 μg/ml rozpuszczalnego anty-Fas-mAb (klon CH11). Minimalną utratę żywotnych komórek stwierdzono w nietraktowanych mieszanych kulturach CTL (T mix). Pokazano oryginalne dane FACS dla każdej populacji CTLmieszaniny T. Analizę apoptozy przeprowadzono zgodnie z wcześniejszymi publikacjami przez oddzielne bramkowanie na obu populacjach limfocytów T10. Liczby przedstawione w lewych górnych kwadrantach reprezentują % wszystkich komórek. Ilustracja pochodzi z jednego reprezentatywnego eksperymentu z trzech niezależnych eksperymentów. Badanie to zostało pierwotnie opublikowane w czasopiśmie Blood. Schütz, C. i wsp. Zabójcze sztuczne komórki prezentujące antygen: nowa strategia usuwania określonych limfocytów T. Krew. 2008; Tamże, s. 111, s. 3546–52. Prawa autorskie Amerykańskiego Towarzystwa Hematologicznego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.S. i M.F. nie mają nic do ujawnienia.

Zgodnie z umową licencyjną pomiędzy NexImmune a Uniwersytetem Johnsa Hopkinsa, dr Schneck i dr Oelke są uprawnieni do udziału w opłatach licencyjnych otrzymywanych przez Uniwersytet od sprzedaży produktów aAPC opisanych w tym artykule. Są również właścicielami akcji NexImmune, które podlegają pewnym ograniczeniom wynikającym z polityki uniwersytetu. Dr Schneck jest członkiem Rady Dyrektorów i Naukowej Rady Doradczej firmy. Warunki tej umowy są zarządzane przez Uniwersytet Johnsa Hopkinsa zgodnie z jego polityką dotyczącą konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta przez Niemiecką Fundację Badawczą (DFG) SCHU-2681/1-1 (C.S.) i KFO 146 (M.F.), grant Departamentu Obrony Departamentu Obrony PC 040972 (M.O.) oraz National Institute of Health granty RO1 CA108835, RO1 Ai44129 (J.P.S.)

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
PBSCorning21-040-CV
Ludzka surowica ABAtlanta biologicznaS40110
EDTASigma/AldrichE5134
Azydek soduSigma/Aldrich71289
M-450 żywice epoksydoweMagnes Invitrogen/Dynal14011
MPC-1Invitrogen/Dynal12001D
Zakręcana szklana fiolkaFisher Scientific03-338AA
MACSmix Tube RotatorMiltenyi130-090-753
anty-CD95 (klon CH11)Milliore05-201
HLA-A2-Ig dimerBD/Pharmingen551263
Cryo-tube 2 mlCorning430488
anty-mysi IgG1 PEBD/ Pharmingen559320
przeciw mysim IgM FITCBD/Pharmingen553408
Chlorek soduMerckS271-3
Chlorek wapniaSigma/AldrichC5080
HEPEScellgro/Mediatech25-060-CI
RPMIgibco/life technologies11875-085
96-dołkowy okrągły płyta dolnaFalcon353077
AnnexinV FITCPromoKinePK-CA577-1001-1000
7-AADBD/Pharmingen51-68981E
Rurki FACSFalcon352008

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bizzaro, N., Tozzoli, R., Shoenfeld, Y. Are we at a stage to predict autoimmune rheumatic diseases. Arthritis and rheumatism. 56 (6), 1736-1744 (2007).
  2. Schütz, C., Oelke, M., Schneck, J. P., Mackensen, A., Killer Fleck, M. artificial antigen-presenting cells: the synthetic embodiment of a “guided missile. Immunotherapy. 2 (4), 539-550 (2010).
  3. Hoves, S., et al. Mature but not immature Fas ligand (CD95L)-transduced human monocyte-derived dendritic cells are protected from Fas-mediated apoptosis and can be used as killer APC. Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 170 (11), At http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12759415 5406-5413 (2003).
  4. Hoves, S., et al. Elimination of activated but not resting primary human CD4+ and CD8+ T cells by Fas ligand (FasL/CD95L)-expressing Killer-dendritic cells. Immunobiology. 208 (5), 463-475 (2004).
  5. Schütz, C., Hoves, S., Halbritter, D., Zhang, H. -G., Mountz, J. D., Fleck, M. Alloantigen specific deletion of primary human T cells by Fas ligand (CD95L)-transduced monocyte-derived killer-dendritic cells. Immunology. 133 (1), 115-122 (2011).
  6. Oelke, M., Maus, M. V., Didiano, D., June, C. H., Mackensen, A., Schneck, J. P. Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells. Nature. 9 (5), 619-624 (2003).
  7. Chiu, Y. -L., Schneck, J. P., Oelke, M. HLA-Ig based artificial antigen presenting cells for efficient ex vivo expansion of human CTL. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (50), (2011).
  8. Schütz, C., et al. Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells. Blood. 111 (7), 3546-3552 (2008).
  9. Snow, A. L., Pandiyan, P., Zheng, L., Krummey, S. M., Lenardo, M. J. The power and the promise of restimulation-induced cell death in human immune diseases. Immunological reviews. 236 (1), 68-82 (2010).
  10. Schütz, C., et al. A new flow cytometric assay for the simultaneous analysis of antigen-specific elimination of T cells in heterogeneous T cell populations. Journal of immunological. 344 (2), 98-108 (2009).
  11. Shen, C., et al. artificial antigen-presenting cells deplete alloantigen-specific T cells in a murine model of alloskin transplantation. Immunology letters. 138 (2), 144-155 (2011).
  12. Perica, K., et al. Nanoscale artificial antigen presenting Cells for T cell immunotherapy. Nanomedicine nanotechnology, biology, and medicine. 10 (1), 119-129 (2013).
  13. Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells. Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cz steczki HLA Igcz steczki dekstranu elazaanaliza cytometrycznaprotok adowania peptyd wleczenie chor b autoimmunologicznychterapia odrzucania allograft wniekom rkowa immunoterapia

Powiązane artykuły