Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie mikroskalowych wsporników krzemowych do oceny funkcji kurczliwości komórkowej in vitro

DOI:

10.3791/51866

⸱

3 października 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1NanoScience Technology Center, University of Central Florida

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje użycie mikroskalowych wsporników krzemowych jako giętkich powierzchni hodowlanych do pomiaru kurczliwości komórek mięśniowych in vitro. Skurcz komórkowy powoduje zginanie wspornika, które można zmierzyć, zarejestrować i przekształcić w odczyty siły, zapewniając nieinwazyjny i skalowalny system pomiaru funkcji skurczu in vitro.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój bardziej predykcyjnych i biologicznie istotnych testów in vitro opiera się na rozwoju wszechstronnych systemów hodowli komórkowych, które ułatwiają funkcjonalną ocenę zasianych komórek. W tym celu technologia wspornikowa w mikroskali oferuje platformę, za pomocą której można mierzyć kurczliwość szeregu typów komórek, w tym komórek szkieletowych, serca i mięśni gładkich, poprzez ocenę zginania substratu wywołanego skurczem. Zastosowanie multipleksowanych macierzy wspornikowych zapewnia środki do opracowania protokołów o umiarkowanej i wysokiej przepustowości do oceny skuteczności i toksyczności leku, fenotypu i progresji choroby, a także interakcji nerwowo-mięśniowych i innych interakcji komórka-komórka. Niniejszy manuskrypt zawiera szczegółowe informacje na temat wytwarzania niezawodnych układów wspornikowych w tym celu oraz metod wymaganych do pomyślnego hodowania komórek na tych powierzchniach. Przedstawiono dalsze opisy kroków niezbędnych do przeprowadzenia analizy funkcjonalnej typów komórek kurczliwych utrzymywanych na takich matrycach przy użyciu nowatorskiego systemu laserowego i fotodetektora. Przedstawione reprezentatywne dane podkreślają precyzję i odtwarzalność analizy funkcji skurczowej możliwej do wykonania przy użyciu tego systemu, a także szeroki zakres badań, do których można zastosować taką technologię. Udane powszechne przyjęcie tego systemu może zapewnić badaczom środki do przeprowadzania szybkich, tanich badań funkcjonalnych in vitro, co doprowadzi do dokładniejszych przewidywań wydajności tkanek, rozwoju choroby i odpowiedzi na nowatorskie leczenie terapeutyczne.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hodowla in vitro komórek mięśniowych zarówno ze źródeł ludzkich, jak i gryzoniowych jest możliwa od dziesięcioleci1,2. Jednakże, podczas gdy standardowe preparaty szkiełek nakrywkowych są przydatne do oceny biochemicznej, nie ułatwiają analizy podstawowej wydajności funkcjonalnej komórki (kurczliwości), a zatem mają nieco ograniczoną wartość jako sposób oceny dojrzewania i wydajności komórki. Aby zmaksymalizować ilość danych możliwych do uzyskania z takich hodowli in vitro, konieczne jest przyspieszenie rozwoju systemów zdolnych do przechowywania takich komórek w konfiguracjach, które umożliwiają ocenę ich sprawności funkcjonalnej w czasie rzeczywistym. Stworzenie wielu trójwymiarowych modeli mięśni poczyniło pewne postępy w kierunku zaspokojenia tej potrzeby, a takie systemy zostały wykorzystane w wielu publikacjach jako środek do oceny zdolności kurczliwej hodowanych komórek mięśniowych in vitro3-5. Chociaż takie systemy są nieocenione w badaniach modelowania i rekonstrukcji tkanek, ich zastosowanie w badaniach odpowiedzi pojedynczych komórek jest ograniczone. W takich przypadkach, w których konieczne są badania pojedynczych włókien, jedyną opcją pozostają złożone i pracochłonne metodologie ex vivo 6-10. Co więcej, obecny ruch w kierunku rozwoju złożonych, wielonarządowych platform do opracowywania leków i protokołów badań przesiewowych wymaga ustanowienia systemów, które są nieinwazyjne, łatwo skalowalne i które łatwo integrują się z komórkami i modelami tkanek wspomagających11.

Wsporniki mikroskalowe oferują prostą metodę oceny funkcjonalnej zdolności kurczliwości pojedynczych komórek/małych populacji komórek12,13. Technika ta opiera się na zmodyfikowanej technologii mikroskopii sił atomowych (AFM)14 i wykorzystuje system lasera i fotodetektora do pomiaru ugięcia wspornika w mikroskali w odpowiedzi na aktywność kurczliwą hodowlanych mięśniówek. Zmodyfikowane równania Stoney'a są następnie wykorzystywane do obliczania naprężenia w miotubie oraz siły wywieranej przez miotubę w celu wygenerowania obserwowanego ugięcia podłoża15. Napisano program skanujący, który umożliwia jednoczesną ocenę multipleksowanych macierzy kantylowych, oferując potencjalne zastosowania o umiarkowanej i wysokiej przepustowości do badań toksyczności/skuteczności leków15,16. Taka technologia może okazać się nieoceniona w opracowywaniu funkcjonalnych, przedklinicznych testów do przewidywania skuteczności leków in vivo. Co więcej, wytwarzanie chipów wspornikowych w krzemie nie utrudnia przetwarzania komórek po analizie do standardowych testów biomolekularnych, takich jak barwienie immunologiczne, western blotting i PCR.

Ten manuskrypt zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące produkcji i przygotowania mikroskalowych wsporników krzemowych, konfiguracji sprzętu i oprogramowania oraz wytycznych operacyjnych do oceny funkcjonalności komórek kurczliwych hodowanych na tych chipach. Do powlekania i konserwacji komórek na tych powierzchniach można zastosować standardowe techniki hodowli komórkowej, dlatego każdy typ komórek kurczliwych, dla których istnieją wiarygodne parametry hodowli, powinien być w stanie łatwo zintegrować się z tym urządzeniem. Stosunkowo proste parametry hodowli 2D wykorzystywane w tym systemie sprawiają, że integracja innych modeli komórkowych lub dodawanie typów komórek, które mogą wchodzić w interakcje z mięśniami (takimi jak unerwione neurony) jest proste, co znacznie zwiększa możliwości zastosowania tego modelu w rozwoju bardziej złożonych funkcjonalnych testów in vitro i wielonarządowych modeli układów ssaków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja chipów wspornikowych

Ilustrowane szczegóły opisanych etapów produkcji znajdują się na rysunku 1.

  1. Umieść wafle Silicon-On-Insulator (SOI) w piekarniku i piecz w temperaturze 125 °C przez 20 minut, aby je odwodnić.
  2. Umieść warstwę tlenku krzemu o grubości 1,5 μm na warstwie uchwytu odwodnionej płytki SOI za pomocą narzędzia do chemicznego osadzania z fazy gazowej wspomaganej plazmą (PECVD).
  3. Umieść wafel na uchwycie do powlekania wirowego warstwą urządzenia skierowaną do góry. Upewnij się, że wafel jest wyśrodkowany, dozuj 2 ml startera P20 na środek płytki i wiruj z prędkością 3,000 obr./min przez 60 sekund z przyspieszeniem 1,000 obr./s. Podkład P20 wspomaga przyleganie fotorezystu do warstwy urządzenia.
  4. Gdy wafel jest jeszcze na uchwycie wirującym, naniej 2 ml fotorezystu S1818 na środek płytki i wiruj z prędkością 3,000 obr./min przez 60 sekund z przyspieszeniem 1,000 obr./s, aby uzyskać warstwę fotorezystu o grubości 1,5 μm.
  5. Umieść wafel na gorącym talerzu i piecz na miękko w temperaturze 115 °C przez 1 minutę.
  6. Wykonaj twardą kontaktową ekspozycję na promieniowanie UV za pomocą fotolitograficznej wyrównywacza maski kontaktowej w celu przeniesienia wzoru z maski wspornikowej na fotorezystor na warstwie urządzenia. Oblicz czas naświetlania na podstawie wartości energii ekspozycji 125 mJ/cm2 dla fotorezystu S1818.
  7. Wywołaj fotorezyst, zanurzając płytkę w wywoływaczu fotorezystu 726 MIF na 1 minutę, delikatnie potrząsając płytką w przód iw tył.
  8. Opłucz wafel wodą dejonizowaną (DI) i wysusz go, najlepiej za pomocą suszarki do płukania wirowego (SRD).
  9. Usuń fotorezyst z krawędzi wafla (do 5 mm od krawędzi) za pomocą bawełnianego wacika zamoczonego w acetonie.
  10. Załaduj wafel do narzędzia do głębokiego reaktywnego wytrawiania jonowego (DRIE), stroną fotorezystu skierowaną do góry, i uruchom przepis na wytrawienie wzorzystej warstwy krzemu przez warstwę urządzenia. Zakopana warstwa tlenku działa jako ogranicznik wytrawiania, więc wytrawianie należy wykonywać z 50% do 100% więcej cykli, niż jest to konieczne do zapewnienia całkowitego wytrawienia.
  11. Umieść wafel w gorącym roztworze kąpieli fotorezystu na 20 minut, aby usunąć fotorezyst. Przenieś wafel do szybkozłączki do płukania (QDR), aby przepłukać wafel wodą DI. Podążając za paskiem fotorezystu, załaduj wafel do narzędzia SRD, aby wypłukać i wysuszyć wafel. Sprawdź płytkę pod mikroskopem, aby upewnić się, że wzór wspornika wygląda zgodnie z oczekiwaniami.
  12. Umieść warstwę niedomieszkowanego tlenku krzemu o grubości 1 μm na warstwie urządzenia płytki za pomocą narzędzia PECVD. Ta warstwa tlenku działa jako warstwa ochronna dla wsporników podczas dalszych etapów obróbki.
  13. Umieść wafel na uchwycie do powlekania wirowego warstwą uchwytu skierowaną do góry, aby rozpocząć obróbkę tylnej strony wafla. Upewnij się, że wafel jest wyśrodkowany, dozuj 2 ml startera P20 na środek płytki i wiruj z prędkością 3,000 obr./min przez 60 sekund z przyspieszeniem 1,000 obr./s.
  14. Gdy płytka jest jeszcze na uchwycie do powlekania wirowego, dozuj 2 ml fotorezystu SPR220-4,5 na środek płytki i wiruj z prędkością 2,000 obr./min przez 45 sekund z przyspieszeniem 1,000 obr./min, aby uzyskać warstwę fotorezystu o grubości 6,5 μm.
  15. Umieść wafel na zbliżeniowej płycie grzejnej, aby piec na miękko w temperaturze 115 °C przez 2 minuty.
  16. Używając fotolitograficznego wyrównywania kontaktowego zdolnego do wyrównania przód/tył, wyrównaj maskę tylnej szyby do wzoru wspornika z przodu i wykonaj twardą kontaktową ekspozycję na promieniowanie UV, aby przenieść wzór z maski tylnej szyby na fotorezyst na warstwie uchwytu. Użyj czasu naświetlania obliczonego na podstawie wartości energii ekspozycji 480 mJ/cm2 dla fotorezystu SPR220-4.5.
  17. Po wystawieniu na działanie promieni UV pozostaw wafle w ciemnym miejscu przez 30 minut przed kolejnym etapem przetwarzania.
  18. Wywołaj fotorezyst, zanurzając płytkę w wywoływaczu fotorezystu 726 MIF na 2 minuty, delikatnie potrząsając płytką w przód iw tył.
  19. Opłucz wafel wodą dejonizowaną (DI) i wysusz go, najlepiej za pomocą suszarki do płukania wirowego (SRD).
  20. Wstaw wafle do piekarnika w temperaturze 90 °C na 12 godzin.
  21. Wytrawić warstwę tlenku krzemu na tylnej stronie płytki za pomocą systemu RIE z gazami fluorowanymi i przepisem na wytrawianie tlenku. Wzorzysty tlenek na odwrocie płytki działa jak maska wytrawiająca do dalszej obróbki. Sprawdź płytki pod mikroskopem, aby upewnić się, że tlenek krzemu w odsłoniętym oknie jest całkowicie wytrawiony.
  22. Usuń fotorezystor z krawędzi płytki (do 5 mm od krawędzi) za pomocą wacika do pomieszczeń czystych zamoczonego w acetonie.
  23. Załaduj wafel do narzędzia DRIE za pomocą i uruchom przepis, aby wytrawić wzorzystą warstwę uchwytu na głębokość 500 μm, przy czym zakopana warstwa tlenku działa jako ogranicznik wytrawiania. Podziel to wytrawianie na wiele przebiegów, aby zapobiec nadmiernemu nagrzewaniu się płytki, co powoduje niespójne trawienie krzemu. Ten etap wytrawiania całkowicie usuwa silikon znajdujący się pod wspornikami.
  24. Wykonaj etap trawienia na mokro przy użyciu 25% rozcieńczonego wytrawiacza HF, aby usunąć zakopaną warstwę tlenku poniżej wsporników i ochronną warstwę tlenku na górze wsporników.
    UWAGA: Ten krok zwalnia dolną powierzchnię silikonowych wsporników, a także otwiera okno pod spodem, aby zapewnić dostęp do sondy wspornikowej za pomocą lasera.
  25. Opłucz wafel za pomocą serii kąpieli wodnych DI i ostrożnie osusz azotem. Ponieważ wsporniki są podparte tylko u podstawy, nie należy używać silnych strumieni wody DI lub gazu obojętnego bezpośrednio na wsporniki.
  26. Rozcinaj poszczególne wióry z płytki wzdłuż linii cięcia powstałych podczas etapu wytrawiania warstwy uchwytu.

2. Hodowla komórkowa

  1. Przygotować szkiełka nakrywkowe 13F zgodnie z wcześniej opublikowanymi metodami17.
    UWAGA: Jeśli szkiełka nakrywkowe 13F nie są dostępne, można użyć dowolnej powierzchni hydrofobowej o kącie działania powyżej 95°.
  2. Wysterylizuj wióry wspornikowe i szkiełka nakrywkowe 13F w 70% roztworze etanolu i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w okapie przepływowym.
  3. Umieść pojedyncze wióry wspornikowe na wierzchu szkiełek nakrywkowych 13F w standardowej płytce 12-dołkowej.
  4. Pokryj wsporniki biopolimerem lub modyfikacją powierzchni zoptymalizowaną pod kątem używanego typu komórki zgodnie ze standardowymi protokołami hodowli komórkowych.
  5. Ponownie zawiesić komórki w ich specyficznym pożywce wzrostowej do pożądanego stężenia.
    UWAGA: Ten protokół spowoduje, że znaczna liczba komórek wypadnie przez okno wspornikowe i nie będzie przylegać do pożądanej powierzchni wspornika. Preparaty komórkowe powinny być zatem 3-4 razy bardziej skoncentrowane niż w przypadku standardowych preparatów nakrywkowych. Na przykład wysiew komórek satelitarnych mięśni szkieletowych szczurów jest zwykle przeprowadzany przy gęstości wysiewu od 500 do 700 komórek/mm kwadratowy15,16 i jest stosowany z podłożami wspornikowymi przy 2,000 komórek/mm kwadratowy. Eksperymenty optymalizacyjne powinny być przeprowadzane z nowymi źródłami komórek, aby zapewnić odpowiednią gęstość wysiewu.
  6. Odpipetować 200 μl zawiesiny ogniw na powierzchnię wióra wspornikowego, upewniając się, że pęcherzyk medium całkowicie zakrywa okna wspornika. Jeśli medium przenika przez okno i nie tworzy statycznej bańki na wspornikach, wymień szkiełko nakrywkowe 13F i ponów próbę poszycia.
  7. Przenieść płytkę zawierającą wióry do inkubatora i pozostawić komórki do przylegania przez co najmniej 1 godzinę (najlepiej 2-3 godziny).
  8. Po tym okresie powlekania użyj sterylnych kleszczyków, aby przenieść chip do czystej studzienki, bez szkiełka nakrywkowego 13F, i uzupełnij kulturę 1 ml pożywki wzrostowej.
  9. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze.
  10. Utrzymuj komórki zgodnie z ich standardowym protokołem konserwacji in vitro na szkiełkach nakrywkowych. W przypadku komórek mięśni szkieletowych konieczne będzie przełączenie pożywki w celu wywołania tworzenia miotuby, gdy komórki staną się zlewne.

3. Konfiguracja sprzętu i oprogramowania do analizy ugięcia wspornika

  1. Umieść podgrzane naczynie hodowlane w stoliku pionowego mikroskopu elektrofizjologicznego.
  2. Dodać 3 ml pożywki, w której obecnie zawieszone są komórki (+ 10 mM HEPES) do podgrzewanego stolika mikroskopu.
  3. Zamontuj elektrody ze stali nierdzewnej po wewnętrznej stronie podgrzewanej naczynia hodowlanej w odległości 15 mm i podłącz je do generatora impulsów, zdolnego do wytwarzania impulsów stymulacji pola o różnym natężeniu, częstotliwości i kształcie fali, aby umożliwić systemowi wytwarzanie stymulacji pola komórek, gdy jest to właściwe.
  4. Przykręć laser helowo-neonowy, zamontowany na stolikach translacyjnych XY, do spodu stołu mikroskopowego i wyreguluj go tak, aby wiązka lasera była kierowana przez podstawę podgrzewanej naczynia hodowlanej pod kątem 30° w stosunku do płaszczyzny wspornika.
  5. Przykręć kwadrantowy moduł fotodetektora, zamontowany na stolikach translacyjnych XY, do spodu stolika mikroskopu i dostosuj położenie tak, aby odbita wiązka laserowa wylądowała w środku 4 kwadrantów. Rysunek 2 przedstawia przegląd konfiguracji sprzętowej niezbędnej do wdrożenia opisanego protokołu.
  6. Napisz program do sterowania siłownikami liniowymi, które skanują w poprzek wsporników. Napisz program w odniesieniu do schematu blokowego przedstawionego na rysunku 3. Interfejs graficzny zaprogramowany do użytku z tym systemem przedstawiono na rysunku 4.

4. Rejestrowanie danych dotyczących ugięcia wspornika

  1. Włącz sprzęt do analizy wspornikowej i powiązane z nim oprogramowanie.
  2. Włóż termistor podgrzewanego stage do medium i poczekaj, aż wskaże 37 °C.
  3. Włóż wiór wspornikowy do stolika z wspornikami skierowanymi w prawą stronę stolika.
  4. Włącz źródło światła mikroskopu.
  5. Ustaw ostrość mikroskop, aby wyświetlić krawędzie wsporników i użyj oprogramowania sterującego laserem/fotodetektorem, aby ustawić wiązkę laserową na końcówce wspornika 1. UWAGA: Zakładając, że wsporniki są zorientowane po prawej stronie stołu montażowego, wspornik 1 jest tym, który znajduje się w lewym górnym rogu tablicy, a liczby biegną w dół do 16 w lewym dolnym rogu. Wspornik 17 znajduje się w prawym górnym rogu i biegnie do 32 w prawym dolnym rogu (Rysunek 5A).
  6. Naciśnij "odtwórz" w oprogramowaniu do nagrywania.
  7. Ustaw fotodetektor tak, aby sygnał wskazywał "0" zarówno w ramkach x, jak i y, regulując silniki krokowe sterujące fotodetektorem.
  8. Ustawić pozycję wspornika 1 w oprogramowaniu sterującym laserem/fotodetektorem (Rysunek 4).
  9. Przesuń laser na końcówkę wspornika 16, powtórz krok 4.7 i ustaw pozycję wspornika 16 w oprogramowaniu sterującym laserem/fotodetektorem.
  10. Przesuń laser na końcówkę cantilever 32, powtórz krok 4.7 i ustaw pozycję cantilever 32 w oprogramowaniu sterującym laserem/fotodetektorem.
  11. Przesuń laser na końcówkę wspornika 17, powtórz krok 4.7 i ustaw pozycję wspornika 17 w oprogramowaniu sterującym laserem/fotodetektorem.
  12. Wyłącz źródło światła mikroskopu i górne światło w laboratorium.
  13. Naciśnij "nagrywaj" w oprogramowaniu do nagrywania.
  14. Ustaw sprzętowy generator impulsów na 40 ms, impulsy 5 V o częstotliwości 1 Hz i włącz maszynę.
    UWAGA: Opcjonalnie zastosuj zoptymalizowane protokoły stymulacji dla określonych źródeł komórek w tym momencie, podane ustawienia są wskazówkami opartymi na zebranych danych przy użyciu źródeł komórek ludzkich i gryzoni12,13,15,16.
  15. Korzystając z oprogramowania sterującego laserem/fotodetektorem, ustaw sprzęt tak, aby skanował w poprzek 32 wsporników, zatrzymując się na 5 sekund na każdym z nich.
  16. Po zakończeniu skanowania 32 wsporników wyłącz stymulator, a następnie zatrzymaj oprogramowanie nagrywające i otwórz plik danych.
  17. Zbadać zarejestrowany ślad z każdego wspornika pod kątem oznak aktywności skurczowej. Zanotuj każdy wspornik z pozytywnymi odpowiedziami. Skurcz definiuje się jako szczyt, jeśli ugięcie jest co najmniej 0,1 V powyżej linii podstawowej.
  18. Usuń wszystkie niereagujące wsporniki z protokołu skanowania w oprogramowaniu sterującym laserem/fotodetektorem.
  19. Aktywne wsporniki można następnie ponownie zeskanować bez stymulacji, aby uzyskać odczyt spontanicznej aktywności skurczowej komórki.
  20. Uruchom skany ze stymulacją elektryczną w szerokim polu lub bez niej, po dodaniu związku terapeutycznego do pożywki w celu zaobserwowania jego wpływu na funkcjonalną wydajność hodowanych komórek.
  21. Przeprowadzaj oceny zmęczenia, stymulując komórki elektrycznie przez dłuższy czas i skanując poziomy kurczliwości, aby zmierzyć, ile czasu potrzeba, aby siła szczytowa spadła poniżej określonego progu.
  22. W eksperymentach, w których neurony ruchowe są utrzymywane w kokulturze z mięśniami, zmierz tworzenie połączeń nerwowo-mięśniowych poprzez traktowanie kokultur kantylowych neuronów ruchowych i mięśniówek stymulantem neuronalnym (takim jak glutaminian) lub inhibitorem synaps (np. D-tubokuraryną) i skanowanie odpowiednio wzrostów i spadków spontanicznej aktywności16.
  23. Wykonaj konkretne skany zgodnie z potrzebami planowanych eksperymentów.

5. Analiza danych ugięcia wspornika

  1. Użyj zmodyfikowanych równań Stoney'a15 (szczegółowo opisanych poniżej), aby przekształcić surowe dane dotyczące ugięcia wspornika (w woltach) na odczyt naprężenia w warstwie komórki lub miotubie (w paskalach) oraz bezpośredni pomiar siły skurczu komórki (w nanoniutonach):
    figure-protocol-1 Równanie 1
    figure-protocol-2 Równanie 2
  2. Gdzie δ = ugięcie końcówki wspornika i naprężenie wytwarzane przez rurkę myotube, σ c = naprężenie wytwarzane przez rurkę myotube, przy założeniu jednolitej grubej warstwy na całej szerokości wspornika, detektor C = współczynnik specyficzny dla systemu odnoszący napięcie do położenia lasera na fotodetektorze, θ = kąt lasera i detektora względem płaszczyzny wspornika, ESi = moduł sprężystości krzemu, tSi = grubość wspornika, tf = grubość rurki mięśniowej, vSi = stosunek trucizny krzemu, L = długość wspornika, P = długość drogi lasera od końcówki wspornika do detektora, a wSi = szerokość wspornika. Schemat wyjaśniający terminy używane w tych równaniach znajduje się na rysunku 6.
  3. Zakładając, że miotuba jest jednolitym filmem, siła w miotubie jest równa sile w filmie, co prowadzi do równania 3, poprzez zrównanie obliczenia siły od naprężenia i założonego pola przekroju poprzecznego komórki, które zostało użyte do zastosowania równania Stoneya.
    figure-protocol-3 Równanie 3
  4. Po zebraniu danych funkcjonalnych zamocuj chipy wspornikowe do analizy immunocytochemicznej lub wykorzystaj komórki do analizy białek lub DNA przy użyciu standardowych technik.
  5. Opcjonalnie należy zwrócić komórki do inkubatora, zamiast przygotowywać się do analizy molekularnej, w celu ponownej oceny sprawności funkcjonalnej w późniejszym czasie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Udana hodowla komórek kurczliwych na wspornikach jest stosunkowo prostą procedurą, wykorzystującą standardowe techniki hodowli komórkowej (Rysunek 5). Odsetek wsporników podtrzymujących kurczące się komórki będzie się różnić w zależności od typu badanej komórki i zastosowanej konkretnej techniki hodowli. Wykorzystując pierwotne komórki embrionalne pochodzące z tylnych kończyn szczura, aktywność skurczową wykryto na 12% badanych wsporników (n = 4). Opisana analiza funkcji kurczliwości za pomocą systemu la...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krytycznymi etapami analizy wsporników w mikroskali pod kątem dowodów skurczu komórek jest umieszczenie chipa wspornikowego w stopniu mikroskopu, a następnie wyrównanie lasera i fotodetektora z końcówką narożnych wsporników w układzie. Jeśli nie zostanie to zrobione dokładnie, oprogramowanie nie będzie w stanie ekstrapolować pozycji pozostałych wsporników w tablicy, co może prowadzić do akumulacji wyników fałszywie ujemnych podczas zbierania danych. Operatorzy powinni upewnić się, że chip wspornikowy leży równo z dnem na...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało sfinansowane przez granty National Institute of Health o numerach R01NS050452 i R01EB009429. Produkcja chipów wspornikowych została przeprowadzona na zewnątrz przez współpracowników z NanoFabrication Facility znajdującego się na Uniwersytecie Cornella. Wszystkie urządzenia wykorzystywane w procesie produkcji wsporników znajdowały się w tym obiekcie. Specjalne podziękowania dla Mandy Esch i Jeana-Matthieu Prota za ich pomoc w mikroprodukcji wsporników. Animacja wideo przedstawiająca funkcjonalność wspornika została wygenerowana przez Charlesa Hughesa, Alexa Zelenina i Erica Imperiale'a z Laboratorium Rzeczywistości Syntetycznej na UCF.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pierwotny wzrost mięśni szczura pożywka
Neurobazalna pożywkaLife Technologies21103-049
B27 (50x)Life Technologies175040441x
Glutamax (100x)Life Technologies350500611x
suplement G5Life Technologies17503-0121x
Glejowy Czynnik neurotroficznyNauki o komórkachCRG400B20 ng/ml
Neurotroficzny czynnik neurotroficzny pochodzenia mózgowegoNauki o komórkachCRB600B20 ng/ml
Rzęskowy czynnik neurotroficznyNauki o komórkachCRC400A40 ng/ml
Neurotrofina-3Nauki o komórkachCRN500B20 ng/ml
Neurotrofina-4Nauki o komórkachCRN501B20 ng/ml
Kwaśny czynnik wzrostu fibroblastów LifeTechnologies13241-013 25 ng/ml
Cardiotropin-1Nauki o komórkachCRC700B20 ng/ml
Siarczan heparynySigmaD9809 100 ng/ml
Czynnik hamujący białaczkęSigmaL5158 20 ng/ml
VitronektynaSigmaV0132100 ng / ml
Pierwotne podłoże
NB Activ 4Brain Bits LLCNB4-500
Sprzęt
Klasa 2 czerwony laser diodowyNewport
FotodetektorNoah Industries
Model 2100 Pulse stymulatorA-M
Multiclamp 700B DigitizerAxon Instruments
Mikroskop z zaciskiem krosowym i stolikKontroler
Delta T4 OprogramowanieBioptechs
37 oC, 5% CO2 inkubatorNAPCO
Okap przepływowy mikrobiologiczny klasy 2Labconco
Pipety i końcówkiEppendorf
do różnicowania mięśni szczura Systemy naczyń do hodowli Olympus Axoscope Urządzenia molekularne Oprogramowanie LabVIEW National Instruments

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bischoff, R. Enzymatic liberation of myogenic cells from adult rat muscle. Anat. Rec. 180, 645-661 (1974).
  2. Yasin, R., et al. A quantitative technique for growing human adult skeletal muscle in culture starting from mononucleated cells. J. Neurol. Sci. 32, 347-360 (1977).
  3. Dennis, R. G., Kosnik, P. E., 2nd, Excitability and isometric contractile properties of mammalian skeletal muscle constructs engineered in vitro. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 36, 327-335 (2000).
  4. Khodabukus, A., Baar, K. Defined electrical stimulation emphasizing excitability for the development and testing of engineered skeletal muscle. Tissue Eng Part C Methods. 18, 349-357 (2012).
  5. Langelaan, M. L. P., et al. Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 5, 529-539 (2011).
  6. Stephenson, G. M., O'Callaghan, A., Stephenson, D. G. Single-fiber study of contractile and biochemical properties of skeletal muscles in streptozotocin-induced diabetic rats. Diabetes. 43, 622-628 (1994).
  7. Harber, M., Trappe, S. Single muscle fiber contractile properties of young competitive distance runners. Journal of applied physiology (Bethesda, Md: 1985). 105, 629-636 (2008).
  8. Hvid, L. G., et al. Four days of muscle disuse impairs single fiber contractile function in young and old healthy men. Experimental gerontology. 48, 154-161 (2013).
  9. Edman, K. A. Contractile performance of striated muscle. Advances in experimental medicine and biology. 682, 7-40 (2010).
  10. Krivickas, L. S., Walsh, R., Amato, A. A. Single muscle fiber contractile properties in adults with muscular dystrophy treated with MYO-029. Muscle Nerve. 39, 3-9 (2009).
  11. Sung, J. H., et al. Microfabricated mammalian organ systems and their integration into models of whole animals and humans. Lab on a chip. 13, 1201-1212 (2013).
  12. Wilson, K., Molnar, P., Hickman, J. J. Integration of functional myotubes with a Bio-MEMS device for non-invasive interrogation. Lab on a chip. 7, 920-922 (2007).
  13. Wilson, K., Das, M., Wahl, K. J., Colton, R. J., Hickman, J. Measurement of contractile stress generated by cultured rat muscle on silicon cantilevers for toxin detection and muscle performance enhancement. PLoS ONE. 5, (2010).
  14. Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Physical Review Letters. 56, 930-933 (1986).
  15. Pirozzi, K. L., Long, C. J., McAleer, C. W., Smith, A. S., Hickman, J. J. Correlation of embryonic skeletal muscle myotube physical characteristics with contractile force generation on an atomic force microscope-based bio-microelectromechanical systems device. Applied physics letters. 103, 83108(2013).
  16. Smith, A., Long, C., Pirozzi, K., Hickman, J. A functional system for high-content screening of neuromuscular junctions in vitro. Technology. 1, 37-48 (2013).
  17. Stenger, D. A., et al. Coplanar molecular assemblies of amino- and perfluorinated alkylsilanes: characterization and geometric definition of mammalian cell adhesion and growth. Journal of the American Chemical Society. 114, 8435-8442 (1992).
  18. Das, M., Rumsey, J. W., Bhargava, N., Stancescu, M., Hickman, J. J. A defined long-term in vitro tissue engineered model of neuromuscular junctions. Biomaterials. 31, 4880-4888 (2010).
  19. Rumsey, J. W., Das, M., Bhalkikar, A., Stancescu, M., Hickman, J. J. Tissue engineering the mechanosensory circuit of the stretch reflex arc: Sensory neuron innervation of intrafusal muscle fibers. Biomaterials. 31, 8218-8227 (2010).
  20. Das, M., Rumsey, J. W., Bhargava, N., Stancescu, M., Hickman, J. J. Skeletal muscle tissue engineering: A maturation model promoting long-term survival of myotubes, structural development of the excitation-contraction coupling apparatus and neonatal myosin heavy chain expression. Biomaterials. 30, 5392-5402 (2009).
  21. Das, M., et al. Developing a novel serum-free cell culture model of skeletal muscle differentiation by systematically studying the role of different growth factors in myotube formation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 45, 378-387 (2009).
  22. Stenger, D. A., Pike, C. J., Hickman, J. J., Cotman, C. W. Surface determinants of neuronal survival and growth on self-assembled monolayers in culture. Brain research. 630, 136-147 (1993).
  23. Hickman, J. J., et al. Rational pattern design for in vitro cellular networks using surface photochemistry. Journal of Vacuum Scienc., & Technology A: Vacuum, Surfaces, and Films. 12, 607-616 (1994).
  24. Das, M., Molnar, P., Devaraj, H., Poeta, M., Hickman, J. J. Electrophysiological and morphological characterization of rat embryonic motor neurons in a defined system. Biotechnology progress. 19, 1756-1761 (2003).
  25. Rumsey, J. W., et al. Node of Ranvier formation on motor neurons in vitro. Biomaterials. 30, 3567-3572 (2009).
  26. Murugan, R., Molnar, P., Rao, K. P., Hickman, J. J. Biomaterial Surface patterning of self assembled monolayers for controlling neuronal cell behavior. International journal of biomedical engineering and technology. 2, 104-134 (2009).
  27. Guo, X., Johe, K., Molnar, P., Davis, H., Hickman, J. Characterization of a human fetal spinal cord stem cell line, NSI-566RSC, and its induction to functional motoneurons. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 4, 181-193 (2010).
  28. Varghese, K., et al. A new target for amyloid beta toxicity validated by standard and high-throughput electrophysiology. PLoS ONE. 5, e8643(2010).
  29. Natarajan, A., et al. Patterned cardiomyocytes on microelectrode arrays as a functional, high information content drug screening platform. Biomaterials. 32, 4267-4274 (2011).
  30. Davis, H., et al. Rat Cortical Oligodendrocyte-Embryonic Motoneuron Co-Culture: An Axon-Oligodendrocyte Interaction Model. Journal of biomaterials and tissue. 2, 206-214 (2012).
  31. Natarajan, A., DeMarse, T., Molnar, P., Hickman, J. Engineered In Vitro Feed-Forward Networks. J Biotechnol Biomater. 3, 2(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Skurcz w kien mi niowychlaserowy system detekcji wiat apomiar ugi cia wspornikamodyfikacja mikroskopu do elektrofizjologiiwysokoprzepustowe badanie przesiewowe lek wanaliza z cza nerwowo mi niowegomiotuby mi ni szkieletowychobliczanie odczytu si y

Powiązane artykuły