Ta metoda tworzy namacalne, znajome środowisko dla myszy do nawigacji i eksploracji podczas obrazowania mikroskopowego lub jednokomórkowych zapisów elektrofizjologicznych, które wymagają mocnego unieruchomienia głowy zwierzęcia.
Artykuł metodologiczny
Płaska podłoga podniesiona powietrznie: nowa metoda łączenia zachowania z mikroskopią lub elektrofizjologią na obudzonych, swobodnie poruszających się gryzoniach
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Powszechnie uznaje się, że stosowanie środków znieczulających może podważyć znaczenie danych elektrofizjologicznych lub mikroskopowych uzyskanych z mózgu żywego zwierzęcia. Co więcej, długa rekonwalescencja po znieczuleniu ogranicza częstotliwość powtarzających się epizodów rejestracji/obrazowania w badaniach podłużnych. W związku z tym oczekuje się, że nowe metody, które pozwoliłyby na stabilne zapisy od nieznieczulonych myszy zachowujących się, przyczynią się do postępu w dziedzinie neuronauk komórkowych i poznawczych. Istniejące rozwiązania obejmują zarówno zwykłe fizyczne ograniczenia, jak i bardziej wyrafinowane podejścia, takie jak bieżnie liniowe i sferyczne używane w połączeniu z komputerowo generowaną rzeczywistością wirtualną. W tym miejscu opisano nowatorską metodę, w której mysz z głową może poruszać się po podniesionej powietrzem mobilnej klatce domowej i badać jej otoczenie w bezstresowych warunkach. Metoda ta pozwala naukowcom na przeprowadzanie testów behawioralnych (np. uczenia się, habituacji lub rozpoznawania nowych obiektów) jednocześnie z obrazowaniem mikroskopowym dwufotonowym i/lub zapisami patch-clamp, a wszystko to połączone w jednym eksperymencie. Ten artykuł wideo opisuje zastosowanie urządzenia do fiksacji głowy wybudzonego zwierzęcia (mobilna klatka domowa), demonstruje procedury przyzwyczajania zwierząt i ilustruje szereg możliwych zastosowań tej metody.
Wprowadzenie
Ekscytującym trendem w neuronaukach jest rozwijanie eksperymentalnych podejść do molekularnego i komórkowego badania sieci neuronalnych w mózgu rozbudzonych, zachowujących się gryzoni. Takie podejścia mogą rzucić nowe światło na procesy neurofizjologiczne, które leżą u podstaw funkcji motorycznych, integracji sensomotorycznej, percepcji, uczenia się, pamięci, a także progresji urazów, neurodegeneracji i chorób genetycznych. Co więcej, zapis z mózgu obudzonego zwierzęcia daje nadzieję na opracowanie nowych środków terapeutycznych i metod leczenia.
Rośnie świadomość, że znieczulenie, które było powszechnie stosowane w eksperymentach neurofizjologicznych, może wpływać na podstawowe mechanizmy funkcjonowania mózgu, potencjalnie prowadząc do błędnej interpretacji wyników eksperymentów. W ten sposób szeroko stosowana znieczulająca ketamina szybko zwiększa tworzenie nowych kolców dendrytycznych i poprawia funkcję synaptyczną1; Inny powszechnie stosowany środek znieczulający, izofluran w znieczuleniu chirurgicznym, całkowicie hamuje spontaniczną aktywność kory mózgowej u nowonarodzonych szczurów i blokuje oscylacje wrzeciona u dorosłych zwierząt2. Obecnie tylko ograniczona liczba podejść umożliwia eksperymenty na nieznieczulonych myszach za pomocą obrazowania mikroskopowego dwufotonowego lub zapisów patch-clamp. Podejścia te można podzielić na preparaty swobodnie poruszające się i przytwierdzane do głowy.
Wyjątkowa atrakcyjność preparatu dla swobodnie poruszających się zwierząt polega na tym, że pozwala na ocenę naturalnego zachowania, w tym ruchów całego ciała podczas nawigacji. Jednym ze sposobów na zobrazowanie wnętrza mózgu swobodnie poruszającego się gryzonia jest przymocowanie zminiaturyzowanego mikroskopu montowanego na głowie lub fiberoskopu3-5. Jednak zminiaturyzowane urządzenia mają zwykle ograniczoną wydajność optyczną w porównaniu z obiektywną mikroskopią dwufotonową i nie można ich łatwo połączyć z zapisami z użyciem krosówek całych komórek6.
Istniejące rozwiązania do naprawiania głowy obudzonego gryzonia polegały głównie na fizycznym ograniczeniu7,8 lub na szkoleniu zwierzęcia do dobrowolnego krępowania głowy9. Innym popularnym podejściem jest umożliwienie zwierzęciu poruszania się kończynami poprzez umieszczenie go np. na bieżni sferycznej10; Takie podejście jest często łączone z komputerowo generowaną rzeczywistością wirtualną. Eksperymenty elektrofizjologiczne na myszach z głową wykorzystywały głównie zapisy zewnątrzkomórkowe i były wykorzystywane do badania centralnej regulacji funkcji układukrążenia11, wpływu znieczulenia na aktywność neuronalną12, odpowiedzi słuchowej w pniu mózgu13 i przetwarzania informacji14. Pionierskie zapisy wewnątrzkomórkowe/całokomórkowe u zwierząt zachowujących się w stanie czuwania przeprowadzono w 2000 roku i koncentrowały się na aktywności neuronalnej związanej z percepcją i ruchem15-20. Mniej więcej w tym samym czasie opublikowano pierwsze mikroskopowe badania obrazowe na obudzonych myszach, w których mikroskopia dwufotonowa została wykorzystana w korze czuciowej fizycznie skrępowanych szczurów7 i na myszach biegających na sferycznej bieżni21.
Późniejsze badania mikroskopowe i elektrofizjologiczne in vivo wykazały, że preparat do unieruchomienia głowy można z powodzeniem połączyć z paradygmatami behawioralnymi opartymi na ruchach kończyn przednich, rozpoznawaniu zapachów, ubijaniu i lizaniu8,22-25. Myszy umieszczone na bieżni sferycznej można wyszkolić w poruszaniu się po wirtualnym środowisku wizualnym generowanym przez komputer10,26. Zapisy wewnątrzkomórkowe/zewnątrzkomórkowe wykazały, że u zwierzęcia poruszającego się po takim wirtualnym środowisku z głową można wykryć aktywację komórek miejsca hipokampa27. W wirtualnym środowisku wizualnym myszy wykazują normalny rytm theta związany z ruchem w lokalnym potencjale pola i precesję fazy theta podczas aktywnego ruchu27. Ostatnio wzorce aktywności przestrzennej i czasowej populacji neuronów zostały zarejestrowane optycznie u myszy podczas zadań decyzyjnych pamięci roboczej w środowisku wirtualnym28.
Pomimo umożliwienia przełomowych badań, projekt bieżni sferycznej ma kilka nieodłącznych ograniczeń. Po pierwsze, zwierzę musi poruszać się po nieograniczonej powierzchni obracającej się piłki unoszącej się powietrzem, która nie stwarza żadnych namacalnych przeszkód, takich jak ściany czy bariery. To ograniczenie jest tylko częściowo kompensowane przez generowaną komputerowo "rzeczywistość wirtualną", ponieważ bodźce wizualne są prawdopodobnie mniej skuteczne w przypadku myszy i szczurów w porównaniu z dotykowymi bodźcami sensorycznymi (np. dotykiem wąsów lub lizawką), na których gatunki te naturalnie polegają. Po drugie, znaczna krzywizna powierzchni piłki może być niewygodna dla myszy laboratoryjnych przyzwyczajonych do chodzenia po płaskiej podłodze w swoich klatkach. Wreszcie, sama średnica piłki (co najmniej 200 mm dla myszy i 300 mm dla szczurów) sprawia, że pionowy rozmiar kulistego urządzenia bieżni jest stosunkowo duży. Utrudnia to połączenie bieżni sferycznej z większością dostępnych na rynku zestawów mikroskopowych i często wymaga zbudowania nowej konfiguracji wokół bieżni za pomocą specjalnie wykonanych ram mikroskopowych.
Tutaj opisana jest nowatorska metoda, w której mysz z głową może poruszać się po mobilnej klatce z płaską podłogą i namacalnymi ścianami, a także badać środowisko fizyczne w warunkach bezstresowych. W tym artykule przedstawiono procedury treningu myszy i fiksacji głowy oraz przedstawiono reprezentatywne przykłady, w których mikroskopia dwufotonowa, wewnętrzne obrazowanie optyczne i zapisy patch-clamp są wykonywane w mózgu myszy zachowujących się w stanie czuwania.
Protokół
Wszystkie przedstawione tutaj procedury zostały wykonane zgodnie z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami (Fińska ustawa o doświadczeniach na zwierzętach (62/2006)). Licencja dla zwierząt (ESAVI/2857/04.10.03/2012) została uzyskana od władz lokalnych (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA). Dorosłe myszy (w wieku 1-3 miesięcy, waga 20-40 g) były trzymane w klatkach grupowych w certyfikowanym obiekcie dla zwierząt Uniwersytetu w Helsinkach i zaopatrywane w jedzenie i wodę ad libitum.
1. Implantacja okna czaszkowego
Okno czaszkowe jest wszczepiane zgodnie z opublikowanymi protokołami 29-31 z niewielkimi modyfikacjami, jak pokrótce opisano poniżej:
- Wysterylizuj narzędzia przed rozpoczęciem implantacji okna czaszkowego. Utrzymuj sterylne warunki podczas operacji, aby zminimalizować ryzyko powikłań pooperacyjnych.
- Podać lek przeciwbólowy (ketoprofen, 2,5 mg/kg) 30 minut przed zabiegiem i 24 godziny po zabiegu. Znieczulić mysz za pomocą mieszaniny ketaminy (80 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) wstrzykiwanych dootrzewnowo. Regularnie monitoruj głębokość znieczulenia poprzez szczypanie łapy. Użyj poduszki grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 37.0 °C. W celu zmniejszenia stanu zapalnego wywołanego zabiegiem chirurgicznym i obrzęku mózgu należy podawać deksametazon (2 mg/kg) we wstrzyknięciu podskórnym.
- Nałóż smar do oczu, aby chronić oczy przed wysuszeniem. Ogol głowę myszy i oczyść ogolony obszar. Przetnij skórę za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy wzdłuż linii od karku do czoła. Usuń tkankę łączną przyczepioną do czaszki.
- Powoli i ostrożnie wywierć małą studzienkę w lewej kości czołowej za pomocą szybkoobrotowego wiertła chirurgicznego. Wkręć mini (patrz Materiały) do wywierconej studni. Wykonaj nie więcej niż półtora pełnego obrotu.
UWAGA: Unikaj tych obszarów, które znajdują się bezpośrednio nad powierzchownymi naczyniami korowymi. Przerwanie tych naczyń może prowadzić do masywnego krwawienia. - Aby wykonać kraniotomię, wywierć okrągłe okienko (o średnicy 3-3,5 mm) w prawej kości ciemieniowej. Nałóż kroplę buforu kory mózgowej (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glukozy, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl2 i 2 mMMgSO4 w destylowanymH2Ouzupełnionym penicyliną 100 jednostek/ml i streptomycyną 100 μg/ml) i ostrożnie usuń część kości znajdującą się wewnątrz okrągłego okienka.
UWAGA: Aby uzyskać ekspresję białka fluorescencyjnego w określonej subpopulacji komórek, na tym etapie procedury należy wykonać wstrzyknięcie wewnątrzczaszkowe wektora wirusowego związanego z adenowirusem (AAV) lub innych wektorów wirusowych. - Umieść okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe (kod grubości #1.5) na oknie czaszki. Przymocuj szkiełko nakrywkowe do czaszki za pomocą kleju poliakrylowego. Umieść metalowy uchwyt na szkiełku nakrywkowym i przymocuj go mieszanką cementu dentystycznego i kleju poliakrylowego.
UWAGA: Opisana powyżej procedura jest zoptymalizowana pod kątem okien czaszkowych stosowanych w eksperymentach obrazowania optycznego. Aby przygotować "odwrócone" okno czaszki odpowiednie do eksperymentów elektrofizjologicznych, należy zastosować inną procedurę. Najpierw przyklej metalowy uchwyt do czaszki. Wywierć okrągłe okienko w otworze uchwytu, jak pokazano na filmie. Alternatywnie, wykonaj mniejszą kraniotomię (o średnicy mniejszej niż 0,5 mm) w obszarze zainteresowania, aby zapobiec lub zminimalizować ruchy mózgu32. Odśwież bufor korowy lub umieść kroplę kleju silikonowego na okienku czaszki, a następnie zamknij je okrągłym szklanym szkiełkiem nakrywkowym. - Po zakończeniu operacji umieść zwierzę w ogrzanej klatce z łatwo dostępnym jedzeniem i wodą. Zwierzę należy umieścić w klatce grupowej dopiero po całkowitym wyzdrowieniu ze znieczulenia. Ponownie podaj lek przeciwbólowy po wykryciu jakichkolwiek oznak bólu, w tym niechęci do poruszania się, jedzenia lub picia, utraty wagi, ślinotokowania, piloerekcji lub nieprawidłowych dźwięków oddechowych.
2. Obchodzenie się ze zwierzętami
- Wyjmij mysz z klatki i po prostu przytrzymaj ją przez 5-10 minut. Zachowaj spokój podczas obchodzenia się ze zwierzęciem, unikaj gwałtownych ruchów i dźwięków.
- Po użyciu włóż mysz z powrotem do klatki.
- Powtórz procedurę obsługi 2-3 razy z nierównymi odstępami czasu między epizodami obsługi, aby mysz czuła się komfortowo z eksperymentatorem.
- Weź małą miękką szmatkę i owiń zwierzę 2-3x w nierównych odstępach.
- Zwierzę powinno zachować spokój i przyzwyczaić się do owijania. Jeśli mysz jest podekscytowana i zdenerwowana, powtórz procedury obsługi i owijania.
3. Szkolenie zwierząt
- Szkolenie zwierzęcia w mobilnej klatce domowej należy rozpocząć następnego dnia po zakończeniu przyzwyczajania się do obchodzenia się z nim i owijania.
- Codziennie rejestruj wagę zwierzęcia przed i w trakcie treningu.
UWAGA: Jeśli podczas treningu zwierzę straci więcej niż 10% swojej wagi, powinno zostać wykluczone z doświadczeń. - Dostosuj pionowe położenie ramienia mocującego głowę mobilnego urządzenia do klatki domowej, aby dopasować je do wielkości wyszkolonego zwierzęcia. Podłączyć wlot powietrza urządzenia do standardowego laboratoryjnego wylotu sprężonego powietrza (zazwyczaj jest to zbiornik gazu lub pompa powietrza, która zapewnia wystarczająco wysokie ciśnienie i natężenie przepływu powietrza, tj. około 5 bar i 300 l/min).
- Owiń zwierzę w szmatkę.
- Włóż metalowy uchwyt, który jest przymocowany do głowy zwierzęcia, do ramienia mocującego głowę i mocno go zamocuj, dokręcając. Włącz przepływ powietrza i upewnij się, że przepływ powietrza jest optymalny do swobodnej flotacji podniesionej powietrzem klatki domowej. Wypuść zwierzę do mobilnej klatki domowej, usuwając szmatkę.
- Aby przyzwyczaić zwierzę do hałasu, należy zapewnić mu stałą ekspozycję na dźwięki otoczenia (za pomocą np. radia lub nagranej muzyki i mowy) podczas wszystkich sesji treningowych, a także podczas eksperymentów.
- Podczas pierwszej sesji treningowej utrzymuj włączone światło w pomieszczeniu przez pierwszą godzinę, a następnie wyłącz światło do końca sesji treningowej.
- Po 2 godzinach treningu w mobilnej klatce domowej uwolnij zwierzę z fiksacji głowy i włóż je z powrotem do klatki z zapasem wody i jedzenia. Pozostaw na co najmniej 2 godziny w warunkach spoczynku.
- Po każdym treningu wyczyść mobilną klatkę domową za pomocą 70% roztworu etanolu i spłucz ją wodą z kranu. Namocz wodę jednorazowym ręcznikiem papierowym i osusz mobilną klatkę domową przed następnym użyciem.
- Wykonuj kolejne sesje treningowe przez 2 godziny, przy wyłączonym świetle w pomieszczeniu podczas treningu zwierzęcia.
- Wykonuj sesję treningową dwa razy dziennie.
- Po 8 do 12 sesjach treningowych wykorzystaj zwierzę w sesji eksperymentalnej do 2 godzin za każdym razem.
UWAGA: Podczas długich sesji treningowych, które trwają dłużej niż 1-2 godziny, rozważ dostarczenie myszy wody pitnej, która może być dostarczona ręcznie lub za pomocą uchwytu na pipety przymocowanego do ramy mobilnej klatki domowej. Alternatywnie, woda może być dostarczana do użytku zwierzęcia ad libitum, umieszczając lepkie krople hydrożelu bezpośrednio na ściankach mobilnej klatki domowej.
UWAGA: Pamiętaj, aby codziennie ważyć zwierzęta przed treningiem, aby wykluczyć jakiekolwiek skutki przewlekłego stresu. Wyklucz zwierzę z eksperymentu, jeśli w dowolnym momencie wykazuje reakcje stresowe, takie jak zamrożenie, wokalizacja lub biegunka wywołana stresem.
4. Aplikacje
- Obrazowanie dwufotonowe u obudzonej myszy poruszającej się po mobilnej klatce domowej
- Zmontuj mobilną klatkę domową. Sprawdź położenie mostka i ramienia mocującego głowę.
- Owiń wyszkolone zwierzę w szmatkę. Umieść zwierzę w mobilnej klatce domowej. Zacisnąć metalowy uchwyt w ramieniu mocującym głowicę. Usuń szmatkę.
- Oczyść wszczepione szkło nakrywkowe z kurzu za pomocą 70% roztworu etanolu i pozostaw do wyschnięcia.
- Umieść kroplę płynu immersyjnego na klasie pokrowca. Najlepiej użyć lepkiego roztworu, ponieważ woda szybko wyparuje.
- Umieść mobilną klatkę domową z wyszkolonym zwierzęciem pod mikroskopem (chyba że masz drugie, identyczne urządzenie, które jest nieruchome w zestawie mikroskopowym).
- Wykonaj obrazowanie za pomocą specjalnie wykonanego lub dostępnego na rynku systemu obrazowania z laserowym mikroskopem skaningowym wyposażonym w femtosekundowy impulsowy laser w podczerwieni.
- Znajdź obszar zainteresowania za pomocą trybu szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego. Użyj filtrów długoprzepustowych, aby ocenić unaczynienie mózgu i wybierz odpowiedni obszar docelowy po zbadaniu wzoru naczyń krwionośnych.
- Aby zobrazować układ naczyniowy kory mózgowej, wstrzyknij 1% roztwór dekstranu sprzężonego z czerwienią Texas o mocy 70 000 MW (lub jego analogu) do żyły ogonowej, gdy zwierzę jest unieruchomione w szmatce, lub po oczodołach, gdy zwierzę jest umieszczone w mobilnej klatce domowej. Dostrój laser dwufotonowy do długości fali 860 nm i użyj filtra pasmowoprzepustowego (590-650 nm) do zbierania emitowanego światła. Użyj filtra emisyjnego 515-560 nm, aby ocenić drobne szczegóły morfologii neuronów lub aktywności neuronalnej, wykorzystując na przykład myszy transgeniczne, które wykazują ekspresję YFP lub wrażliwego na Ca2 + białka fluorescencyjnego GCaMP3 w subpopulacji neuronów pod promotorem Thy1.
- Użyj odpowiedniego oprogramowania do pozyskiwania obrazów.
- Po zobrazowaniu uwolnij zwierzę z ramienia mocującego głowę, poluzowując. Umieść zwierzę z powrotem w klatce i pozwól mu odpocząć przez co najmniej 2 godziny przed rozpoczęciem następnej sesji obrazowania.
- Przechowuj współrzędne każdego obszaru zainteresowania (ROI) w celu późniejszego ponownego obrazowania. Wyświetlaj te same zwroty z inwestycji w czasie i za każdym razem dostosowuj współrzędne, aby zmaksymalizować nakładanie się obrazu.
- Analizuj obrazy i dokonuj trójwymiarowych rekonstrukcji za pomocą odpowiedniego oprogramowania (np. ImageJ itp.).
- Wewnętrzne obrazowanie optyczne u myszy Awake Mouse poruszającej się po mobilnej klatce domowej
- Zamontuj mobilną klatkę domową pod kamerą do akwizycji obrazu w wewnętrznym zestawie obrazowania optycznego.
- Owiń wyszkolone zwierzę w szmatkę. Umieść zwierzę w mobilnej klatce domowej. Clamp metalowy uchwyt w ramieniu mocującym głowicę.
- Oczyść wszczepione szkło nakrywkowe z kurzu za pomocą 70% roztworu etanolu i pozostaw do wyschnięcia.
- Umieść kroplę glicerolu na wszczepionym szkle i przykryj je okrągłym szkiełkiem nakrywkowym o średnicy 8 mm.
- Umieść manipulator z rurką nadmuchu powietrza naprzeciwko przeciwległej wibrysury.
- Dostosuj pozycję szybkiej kamery i ustaw ją na układzie naczyniowym kory mózgowej.
- Użyj zielonego światła (filtr 546BP30) bez filtra kamery, aby uzyskać mapę statków.
- Skoncentruj się głębiej w korze mózgowej, około 400 mikrometrów pod powierzchnią kory .
- Aby zobrazować sygnał optyczny zależny od poziomu natlenienia krwi (BOLD), umieść filtr 590LP przed kamerą i oświetl korę czerwonym światłem (filtr 630BP30).
- Dostosuj oświetlenie powierzchni kory mózgowej tak, aby było równomiernie rozprowadzone w obszarze zainteresowania, unikając nadmiernej ekspozycji. Dostosuj intensywność oświetlenia tak, aby obszar zainteresowania mieścił się w segmencie 70–90% zakresu dynamicznego kamery.
- Użyj oprogramowania do akwizycji obrazów LongDaq, aby zebrać obrazy z aparatu.
- Do eksperymentów ze stymulacją niskiej częstotliwości (0,05 Hz) należy używać częstotliwości akwizycji obrazu od 1 do 10 Hz (tj. od 1 do 10 klatek na sekundę).
- Wyłącz światło w pomieszczeniu, aby zapobiec zakłóceniom wewnętrznego sygnału optycznego.
- Odczekaj co najmniej 30 minut, aby mysz przystosowała się do mobilnej klatki domowej.
- Wyobraź sobie wyjściową aktywność podczas 6-minutowego epizodu bez stymulacji.
- Aby zarejestrować wywołaną aktywność korową, stymuluj wibrysę w trybie 10 sekund ON/10 s OFF (stymulacja 0,05 Hz) za pomocą ciągu podmuchów powietrza o wysokiej częstotliwości (25 Hz) przez łączny okres 6 minut.
- Po uzyskaniu obrazu zwolnij mysz z ramienia mocującego głowę i włóż ją z powrotem do klatki.
- Nie należy stosować dodatkowego filtrowania danych pod kątem częstotliwości, ponieważ amplitudy reakcji na stymulację są zwykle stosunkowo wysokie u przebudzonych zwierząt, co skutkuje doskonałym stosunkiem sygnału do szumu.
- Uzyskane zestawy obrazów należy przekonwertować na pliki stosu *.tif i przeanalizować je dalej za pomocą np. oprogramowania open source FIJI (ImageJ). Odejmij wyjściową spontaniczną aktywność od ramek uzyskanych podczas stymulacji wibrysy za pomocą narzędzia Kalkulator obrazów. Alternatywnie można filtrować dane w dziedzinie częstotliwości za pomocą odpowiedniego oprogramowania.
- Nagrania patch-clamp w Awake Mouse poruszającej się po mobilnej klatce domowej
- Zmontuj mobilną klatkę domową.
- Owiń wyszkolone zwierzę w szmatkę. Podawać trimetoprime (5 mg/kg) i sulfadoksynę (25 mg/kg) w celu zapobiegania zakażeniu bakteryjnemu. Umieść zwierzę w mobilnej klatce domowej. Clamp metalowy uchwyt w ramieniu mocującym głowicę.
- Oczyść i wysterylizuj wszczepioną "nakrętkę" z cementu dentystycznego i szkło nakrywkowe za pomocą 70% roztworu etanolu lub 0,5% diglukonianu chlorheksydyny i pozostaw do wyschnięcia.
- Powoli i ostrożnie wyjmij szklankę nakrywkową z metalowego uchwytu.
- Odśwież bufor korowy uzupełniony penicyliną, streptomycyną i oczyść okno czaszki z zanieczyszczeń sterylnym tamponem hemostatycznym.
- Umieść elektrodę masową w buforze korowym.
- Umieść stopień głowy elektrofizjologii w mikromanipulatorze.
- Pipety należy wytwarzać ze szkła borokrzemianowego, dążąc do uzyskania rezystancji końcówki w zakresie od 6,5 do 8,5 MΩ. Napełnij pipetę z plastrem roztworem wewnątrzkomórkowym. Skład roztworu pipety z plastrem jest następujący (w mM): 8 KCl, 111 K-glukonian, 0,5 CaCl2, 2 NaOH, 10 glukozy, 10 HEPES, 2 Mg-ATP i 5 BAPTA, pH dostosowano do 7,2 za pomocą KOH. Wartości potencjału membrany należy skorygować dla obliczonego potencjału złącza cieczy wynoszącego -12 mV 33.
- Skieruj się w obszar zainteresowania za pomocą współrzędnych stereotaktycznych i szybko przenieś elektrodę do mózgu, utrzymując silny dodatni nacisk na końcówkę pipety. Po penetracji opony twardej i ustawieniu pipety zmierz rezystancję końcówki i wyrzuć elektrody, które wykazują wzrost rezystancji o więcej niż 10-15%, aby poprawić wskaźnik powodzenia kolejnych kroków.
- Zmniejsz dodatnie ciśnienie o połowę, aby uniknąć obrzęku otaczającej tkanki mózgowej. Dalsze kroki są podobne do standardowego protokołu "ślepej łatki". Aby znaleźć neuron, z którego można nagrywać, opuść końcówkę do mózgu w sposób stopniowy, aż neuron zostanie wykryty w bliskiej odległości od końcówki pipety, na co wskazuje charakterystyczna sekwencja czasowa zmian impedancji elektrody. Kluczowym wskaźnikiem obecności neuronu jest monotoniczny wzrost oporu elektrody w kilku kolejnych krokach pipety do przodu (zazwyczaj jest to 20% wzrost oporu pipety w trzech krokach 2 μm).
- Aby utworzyć gigaseal contact z docelowym neuronem, należy zastosować podciśnienie i hiperpolaryzację pipety.
- Zastosuj krótki impuls o większym podciśnieniu do ogniwa, aby ustalić konfigurację całego ogniwa. Cofnij elektrodę o 2-3 μm, aby zachować dobre uszczelnienie.
- Rejestruj spontaniczną lub wywołaną aktywność w żądanym okresie czasu, do 20-40 minut.
- Po nagraniu wyjmij pipetę z mózgu.
- Odśwież bufor korowy lub umieść kroplę kleju silikonowego na okienku czaszki, a następnie przyklej okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe na metalowym uchwycie.
- Uwolnij zwierzę z ramienia mocującego głowę, poluzowując. Zwierzę należy umieścić z powrotem w klatce na co najmniej jeden dzień przed kolejnym nagraniem.
- Analizuj dane np. za pomocą oprogramowania FitMaster.
- Test węchowy habituacji-dezhabituacji u obudzonej myszy poruszającej się po mobilnej klatce domowej
- Przymocuj czysty bawełniany kawałek (2 x 2 cm) zanurzony w wodzie z kranu do wewnętrznej strony ściany mobilnej klatki domowej za pomocą taśmy dwustronnej. Podziel ścianę mobilnej klatki domowej na cztery strefy, umieszczając kolorowe znaczniki po zewnętrznej stronie ściany tak, aby kawałek bawełny znajdował się pośrodku "strefy docelowej". Zamocuj zwierzę w ramieniu uchwytu na głowę przodem do segmentu ściany przeciwnego do strefy "docelowej" i pozwól mu przystosować się do mobilnej klatki domowej przez 30 minut.
- Weź kolejny kawałek czystej bawełny i zwilż go kilkoma kroplami 1% ekstraktu waniliowego. Zastąp czystą bawełnę na ścianie mobilnej klatki domowej na tę, która ma zapach wanilii. Prezentuj zapach przez 5 minut. Śledź ruchy mobilnej klatki domowej w okresie prezentacji zapachu. Oszacuj poziom zainteresowania zapachem, mierząc łączny czas, jaki zwierzę spędza zwrócone w stronę strefy "docelowej" w stosunku do całkowitego czasu poruszania się w mobilnej klatce domowej.
- Powtórz 5-minutową sesję aplikacji trzy razy, używając zapachu wanilii, z 5-minutową interwencją między sesjami. Używaj świeżego kawałka bawełny "waniliowej" podczas każdej sesji.
- Przedstaw zwierzęciu społecznie istotny zapach podczas ostatniej, piątej sesji. Zwilż czysty kawałek bawełny kilkoma kroplami moczu (uzyskanego poprzedniego dnia od zwierzęcia płci przeciwnej) i umieść go na środku strefy docelowej na 5 minut.
- Nowe rozpoznawanie zapachów u obudzonej myszy poruszającej się po mobilnej klatce domowej
- Podziel ścianę na cztery strefy, umieszczając kolorowe znaczniki po zewnętrznej stronie ściany mobilnej klatki domowej. Przymocuj dwa czyste kawałki bawełny (2 x 2 cm) zanurzone w wodzie z kranu do wewnętrznej strony ściany pośrodku stref naprzeciwko siebie (oznaczonych jako strefa docelowa 1 i strefa docelowa 2). Zamocuj zwierzę w ramieniu uchwytu głowy przodem do segmentu ściany poza strefami docelowymi i pozwól mu przystosować się do mobilnej klatki domowej przez 30 minut.
- Zastąp oba kawałki bawełny świeżymi: umieść kawałek bawełny zmoczony 1% ekstraktem waniliowym w strefie docelowej 1, a drugi zmoczony wodą z kranu w strefie docelowej 2. Nagraj film z ruchami mobilnej klatki domowej przez 10 minut podczas sesji prezentacji zapachu. Oblicz towarzyszący zapach jako procent czasu, jaki zwierzę spędza w kierunku strefy docelowej 1 w stosunku do skumulowanego czasu spędzonego w strefie 1 i 2.
- Po 10-minutowej przerwie umieść kolejną parę aplikatorów na ścianie klatki domowej na kolejne 10 minut. Umieść bawełnę "waniliową" w strefie docelowej 1, a bawełniany aplikator zwilżony 1% ekstraktem z banana w strefie docelowej 2. Zrób nagranie wideo ruchów mobilnej klatki domowej. Oblicz preferencję dla nowego zapachu jako procent czasu, w którym zwierzę spędza zwrócone twarzą do segmentu ściany o nowym zapachu (strefa docelowa 2) w stosunku do skumulowanego czasu spędzonego w strefie 1 i 2.
Wyniki
Metoda przedstawiona w niniejszym opracowaniu jest przeznaczona do obrazowania mikroskopowego lub jednokomórkowych pomiarów elektrofizjologicznych u myszy budzących się, z unieruchomioną głową, lecz w pozostałym zakresie swobodnie poruszających się i wykazujących naturalne zachowania. Zwierzę może poruszać się w dwóch wymiarach w rzeczywistym (w przeciwieństwie do wirtualnego), namacalnym i znanym mu środowisku, podczas gdy czaszka zwierzęcia jest mocno przymocowana do ramienia stabilizującego głowę. Przyzwyczajanie myszy do podwieszonej w powietrzu mobilnej klatki domowej polega na 4-6 dniach treningu, obejmującego dwie 2-godzinne sesje dziennie (Rycina 1). Przeszkolone zwierzęta mogą być następnie niezwłocznie wykorzystane w eksperymentach. Typowe badanie obejmuje szereg sesji obrazowania lub sesji rejestracji metodą patch-clamp, które są oddzielone odstępami czasu wynoszącymi od kilku godzin do kilku dni lub tygodni. Co ważne, zarówno rejestracje optyczne, jak i elektrofizjologiczne mogą być przeprowadzane jednocześnie ze stymulacją poznawczą lub behawioralną oraz odczytami odpowiedzi w ramach jednego eksperymentu.
Aby ocenić stabilność mechaniczną fiksacji głowy myszy w mobilnej klatce domowej, zebrano sekwencje obrazów naczyń korowych znakowanych dekstranem sprzężonym z fluorescencją oraz dendrytów korowych wykazujących ekspresję YFP podczas poruszania się zwierząt doświadczalnych w mobilnej klatce domowej (Rysunek 2). Maksymalne przesunięcia mózgu podczas lokomocji zwierząt zazwyczaj nie przekraczały 1-1,5 µm. Przesunięcia te występowały w kierunkach poziomych i bardzo rzadko prowadziły do wykrywalnego przesunięcia płaszczyzny obrazowania, co czyniło zbędną jakąkolwiek korekcję artefaktów ruchowych. Stabilna fiksacja głowy w mobilnej klatce domowej umożliwia kwantyfikację poszczególnych kolców dendrytycznych u zwierząt w stanie czuwania z taką samą niezawodnością, jak u myszy zanarkizowanych. Gęstość, morfologia i wymiana kolców dendrytycznych mogą być monitorowane w badaniach podłużnych z wielokrotnymi sesjami obrazowania przeprowadzanymi w odstępach od kilku godzin do kilku dni lub tygodni.
Użyteczność mobilnej klatki domowej do funkcjonalnego obrazowania optycznego przetestowano w korze somatosensorycznej czuwających myszy, stosując dwa podejścia: i) mikroskopię dwufotonową u myszy transgenicznych Thy1-GCaMP3 oraz ii) obrazowanie wewnętrznych sygnałów optycznych u myszy typu dzikiego. Obrazowanie Ca2+ przeprowadzono w warstwie 2/3, która zawiera ciała wielu fluorescencyjnie znakowanych neuronów, a także ich dendryty i aksony (Rysunek 3). Wykresy fluorescencji w czasie z wybranych obszarów zainteresowania (ROI) przedstawiono na Rysunku 3, co demonstruje spontaniczną aktywność neuronalną (mierzoną jako przejściowe wzrosty fluorescencji GCaMP3) podczas aktywnej nawigacji myszy w mobilnej klatce domowej. Obrazowanie optyczne oparte na sygnałach wewnętrznych pozwala na mapowanie przestrzennego rozkładu domen funkcjonalnych. Rysunek 4 ilustruje falowe zmiany poziomu natlenowania krwi (odzwierciedlające regionalną aktywację neuronów), które rozprzestrzeniały się wzdłuż kory somatosensorycznej w odpowiedzi na stymulację wibrissami z częstotliwością 0,05 Hz.
Aby przetestować wykonalność rejestracji metodą patch-clamp z wykorzystaniem mobilnej klatki domowej, użyto myszy C57Bl/6J w wieku 2-3 miesięcy. Rejestrację neuronów warstwy 2/3 w korze somatosensorycznej przeprowadzono w konfiguracji whole-cell w trybie current clamp. Rejestracja patch-clamp w mózgu budzących się myszy z utrwaloną głową w mobilnej klatce domowej była w zasadzie analogiczna do ślepego patch-clampingu w skrawkach mózgu. Około 50% prób zakończyło się pomyślnym utworzeniem gigaseala, z czego ponad 70% pozwoliło na stabilną rejestrację w konfiguracji whole-cell. Nie zaobserwowano przypadków utraty kontaktu gigaseala w wyniku mechanicznego przemieszczenia komórek. Rysunek 5 przedstawia 60-sekundowy fragment reprezentatywnej, 10-minutowej rejestracji current-clamp skorelowanej z epizodami aktywnych (bieganie) i pasywnych (odpoczynek) stanów myszy.
Rycina 1. Metoda fiksacji głowy u budzących się myszy w mobilnej klatce domowej. A) Przegląd konstrukcji mobilnej klatki domowej z systemem podnoszenia pneumatycznego oraz ilustracje ogólnej koncepcji. B) Schemat typowego harmonogramu eksperymentu. Badanie rozpoczyna się od implantacji okna czaszkowego na dwa tygodnie przed przyzwyczajeniem myszy do manipulacji i owijania, po czym następują osiem sesji treningowych odbywających się dwa razy dziennie. Typowe badanie obejmuje szereg sesji obrazowania lub sesji rejestracji patch-clamp, rozmieszczonych w odstępach od kilku godzin do kilku dni lub tygodni. Zarówno pomiary optyczne, jak i elektrofizjologiczne mogą być przeprowadzane równolegle ze stymulacją poznawczą lub behawioralną i odczytami wyników w ramach jednego eksperymentu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej ryciny.
Rycina 2. Przykład obrazowania mikroskopowego dwufotonowego u czuwających myszy poruszających się w mobilnej klatce domowej. A,B) Naczynia korowe, znakowane dekstranem 70 kDa sprzężonym z Texas Red. Średnicę poszczególnych segmentów naczyń mierzy się poprzez wykreślanie w czasie profilu linii prowadzonych w poprzek światła naczynia w okresach spoczynku i biegu myszy (A). Szybkość przepływu krwi w tętnicach i żyłach mierzy się za pomocą skanowania liniowego wzdłuż linii prowadzonych równolegle do ściany naczynia (B). C,D) Szczegóły morfologii neuronów zwizualizowane w mózgu myszy transgenicznych wykazujących ekspresję YFP w subpopulacji neuronów pod promotorem Thy1. Rekonstrukcja trójwymiarowa neuronów piramidowych w korze somatosensorycznej myszy (C). Obrazy gałęzi dendrytycznej uzyskane u czuwającej, aktywnej myszy są wystarczająco stabilne do kwantyfikacji morfologii poszczególnych kolców dendrytycznych (D). E) Kwantyfikacja ruchów mózgu spowodowanych ruchami myszy. Przesunięcia o większej amplitudzie korelują z okresami biegu myszy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 3. Przykład aktywności populacji neuronalnej w budzącej się myszy Thy1-GCaMP3 poruszającej się w mobilnej klatce domowej. A) Obraz dwufotonowy neuronów warstwy II/III kory mózgowej. ROI, np. ciała komórek neuronalnych, dendryty i aksony, zaznaczono na żółto. B) Ślady ΔF/F fluorescencji GCaMP3 z ROI pokazanych na A (serie czasowe rejestrowane z częstotliwością 1,5 s/klatkę). C) Powiększony obszar obrazowany z częstotliwością 65 ms/klatkę. D) Fluorescencja z żółtych ROI na C wykreślona w funkcji czasu, wykazująca przejściowe wzrosty (kolor czerwony) fluorescencji GCaMP3, które odpowiadają epizodom napływu Ca2+ indukowanego potencjałami czynnościowymi. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 4. Przykład mapowania przestrzennego rozkładu odpowiedzi funkcjonalnych w korze mózgowej budzonej myszy za pomocą obrazowania wewnętrznych sygnałów optycznych. A) Widok w polu jasnym powierzchownych naczyń krwionośnych przez okno czaszkowe. B) Mapa amplitudy aktywności bazowej w klatce domowej podczas 6-minutowego epizodu. C) Mapa amplitudy aktywności neuronalnej rozprzestrzeniającej się wzdłuż kory somatosensorycznej w odpowiedzi na stymulację wibrys o częstotliwości 0,05 Hz. Aby wyświetlić większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
Rycina 5. Przykład rejestracji metodą patch-clamp w konfiguracji whole-cell w korze mózgowej czuwającej myszy poruszającej się w mobilnej klatce domowej. A) Rejestracja w trybie current-clamp z neuronu w warstwie 2/3 kory mysiej. Wstrzyknięcie prądu o natężeniu 100 pA przez 0,5 s (oznaczone pod śladem) powoduje wystąpienie serii potencjałów czynnościowych. Komórka wykazała adaptację częstotliwości impulsów charakterystyczną dla neuronów piramidalnych. B) Ciągła rejestracja w trybie current-clamp z tego samego neuronu skorelowana z aktywnością lokomocyjną myszy (pokazana na różowo nad śladem). Reprezentatywna aktywność spontaniczna neuronu warstwy 2/3 podczas okresów spoczynku myszy (C) i biegu (D). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 6. Ubytek masy ciała i aktywność lokomotoryczna myszy z unieruchomioną i nieunieruchomioną głową podczas sesji treningowych w mobilnej klatce domowej. A) Masa ciała zwierząt (średnia+SD,%) przed sesjami treningowymi. Należy zauważyć, że utrata masy ciała jest całkowicie odwrócona do 7-8th sesji treningowej. B) Trajektoria poziomego poruszania się myszy względem mobilnej klatki domowej, wyekstrapolowana z monitorowanego ruchu mobilnej klatki domowej podczas 8th sesji treningowej. C) Monitorowane ruchy myszy z nieunieruchomioną głową eksplorującej okrągłą klatkę podczas 8th sesji treningowej. D) Czas trwania ruchu myszy z unieruchomioną głową (koło) i nieunieruchomioną głową (trójkąt) podczas 1-4th dnia treningu (średnia+SD,%). Należy zauważyć, że w dniu 4. myszy z unieruchomioną głową nie wykazują ani zamierania (jak w dniu 1.), ani nadmiernej aktywności lokomotorycznej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Dyskusja
Aby lepiej zrozumieć fizjologię i patologię mózgu, należy przeprowadzić badania na różnych poziomach złożoności przygotowania, wykorzystując najbardziej odpowiednie techniki dla każdego preparatu. Obecnie szeroki zakres metodologii neuronauki (od fMRI całego ciała po mikroskopię STED suborganelli) jest łatwo stosowany do znieczulonych zwierząt, podczas gdy eksperymenty na przytomnych i zachowujących się zwierzętach stanowią poważne wyzwanie metodologiczne.
Opisano tu nowatorskie podejście, w którym zwierzę laboratoryjne, mimo że jest mocno unieruchomione głową, może poruszać się po podnoszonej powietrzem mobilnej klatce domowej i badać swoje namacalne otoczenie w warunkach bezstresowych. Prezentowany tutaj preparat dla zwierząt zachowujących się z głową ma szereg istotnych zalet. Po pierwsze, dane elektrofizjologiczne lub obrazowe uzyskane tą metodą nie są zagrożone ani przez znieczulenie, ani przez stres wywołany ograniczeniami. Umieszczenie myszy w mobilnej klatce domowej jest szybkie i nie wymaga znieczulenia zwierzęcia nawet przejściowo. Po drugie, podniesiona powietrzem klatka domowa zapewnia stabilność mechaniczną, która jest potrzebna do ilościowego określenia zmian w morfologii neuronów i rejestrowania aktywności elektrofizjologicznej pojedynczych komórek u obudzonych zwierząt. Wreszcie, konstrukcja mobilnej klatki domowej jest bardziej kompaktowa w porównaniu z bieżnią sferyczną, co pozwala na umieszczenie mobilnej klatki domowej pod standardowym mikroskopem pionowym w celu obrazowania dwufotonowego lub zapisu patch-clamp w mózgu obudzonej myszy.
Mocne zamocowanie głowy w mobilnej klatce domowej wymaga wszczepienia specjalnie zaprojektowanego czteroskrzydłowego metalowego uchwytu, z okrągłym otworem pośrodku umożliwiającym optyczny lub elektryczny dostęp do leżącego poniżej obszaru mózgu. Te metalowe uchwyty są przymocowane do czaszki za pomocą kombinacji kleju, cementu dentystycznego i małej wkręconej w kość czaszki. Ta procedura chirurgiczna została opracowana w oparciu o dużą liczbę wcześniej opublikowanych procedur i stwierdzono, że skutkuje stabilnym i powtarzalnym przygotowaniem okna czaszkowego. Do eksperymentów elektrofizjologicznych in vivo wykorzystano okno w kształcie księżyca34, kraniotomię o niewielkich rozmiarach (mniej niż 0,5 mm)32 oraz preparat pokryty szkłem35 . W tym przypadku "odwróconemu" okienku czaszki wszczepiono dużą (3,5 mm średnicy) lub małą (mniej niż 0,5 mm średnicy) kraniotomię. Minimalizacja ruchów mózgu ma kluczowe znaczenie dla stabilnych zapisów pojedynczych komórek, dlatego zaleca się wykonywanie kraniotomii o małych rozmiarach do eksperymentów elektrofizjologicznych. Po wszczepieniu okienka czaszkowego do eksperymentów z obrazowaniem optycznym, zwierzętom pozwala się na regenerację przez co najmniej 2 lub 3 tygodnie, podczas których okno najpierw przejściowo traci swoją przezroczystość, a następnie ją odzyskuje (z wydajnością 50-70%, w zależności od tła genetycznego szczepu myszy). Przezroczystość okienka czaszki i stabilność cementowej "czapeczki" z cementu dentystycznego przymocowanej do czaszki można sprawdzić za pomocą zwykłego mikroskopu dwuokularowego i kontroli fizycznej podczas pracy ze zwierzętami. Pod koniec 2-3 tygodniowego okresu rekonwalescencji zwierzęta, które wykazują jakiekolwiek oznaki resztkowego pooperacyjnego stanu zapalnego lub uszkodzeń mechanicznych cementu dentystycznego, powinny zostać wykluczone z doświadczeń i zakończone.
Optymalny wiek do rozpoczęcia treningu myszy to 2-4 miesiące (co odpowiada masie ciała 20-40 g). U młodszych zwierząt zakotwiczenie "czapeczki" z cementu dentystycznego do czaszki może być zawodne, co może zmniejszyć jej odporność na naprężenia mechaniczne powodowane przez poruszanie się myszy z głową w mobilnej klatce domowej. Chociaż samce i samice myszy wydają się równie chętne do poruszania się w mobilnej klatce domowej, istnieje tendencja do osiągania lepszego odsetka okien czaszkowych odzyskujących przezroczystość u samic myszy (dane nie pokazane). W związku z tym, aby zapewnić zrównoważoną mieszankę płci w kohorcie zwierząt wybranych do obrazowania, zaleca się wszczepienie okien czaszkowych około 30% więcej samców myszy. Wiadomo, że interakcje społeczne poprawiają samopoczucie zwierząt i zmniejszają stres, dlatego zaleca się, aby rodzeństwo z miotu było obsługiwane i szkolone równolegle i trzymane razem w klatkach grupowych.
W przeciwieństwie do procedur opublikowanych dla przygotowania bieżni sferycznej13, metoda wykorzystująca mobilną klatkę domową nie wymaga znieczulenia myszy w momencie unieruchomienia głowy. Różnica ta jest ważna, ponieważ pozwala wykluczyć jakiekolwiek szczątkowe skutki, jakie nawet krótki i "lekki" epizod znieczulenia może mieć na pomiary fizjologiczne uzyskane wkrótce potem. Rzeczywiście, nawet jeśli w badaniach, w których unieruchomienie głowy wykonano w znieczuleniu, a rzeczywiste eksperymenty rozpoczęto po krótkim okresie oczekiwania13, nie można wykluczyć możliwych długotrwałych skutków krótkiego epizodu znieczulenia na dane eksperymentalne. Inne badania opierały się na niedoborze wody w celu systematycznego przyzwyczajania zwierząt do fiksacji głowy i wykorzystywały nagrodę w postaci wody jako sposób motywowania zwierzęcia do pozostawania wbezruchu. Jednak metoda fiksacji głowy oparta na nagrodzie ogranicza wybór odpowiednich testów behawioralnych i, co ważne, zajmuje jedno z dobrze ugruntowanych skojarzeń bodziec – nagroda. W przeciwieństwie do tego, metoda przyzwyczajania myszy do fiksacji głowy w mobilnej klatce domowej nie wymaga pozbawienia wody i późniejszej nagrody.
Uzupełnienie mobilnej klatki domowej o system dostarczania wody jest zalecane w przypadku długotrwałych eksperymentów. Przedstawione tutaj sesje treningowe i eksperymenty ze zwierzętami zostały przeprowadzone w ciągu dnia (między 8 rano a 18 wieczorem), co odpowiada fizjologicznie pasywnemu okresowi dla tych myszy, które są trzymane zgodnie ze standardowym 12-godzinnym harmonogramem światła (światła włączają się o 6 rano i wyłączają o 18). Ponieważ spożycie wody jest bezpośrednio związane z aktywnością myszy, w okresie pasywnym myszy nie wymagają dostarczania wody, jeśli czas trwania sesji treningowej/obrazowania/nagrywania nie przekracza 2 godzin. Oprócz czasu i czasu trwania sesji treningowych, należy zająć się kwestią optymalnej liczby sesji wymaganych do przyzwyczajenia zwierząt do mobilnej klatki domowej. W tym celu zastosowano dwa kryteria oceny stresu wywołanego procedurami stabilizacji głowy: i) utrata masy ciała oraz ii) poziom aktywności lokomotorycznej. Jak pokazano na rysunku 6, utrata masy ciała osiąga średni poziom 6% w drugim dniu treningu i jest całkowicie odwrócona w dniu treningu 4 (rysunek 6A). Zgodnie z dynamiką ważenia, poziom aktywności lokomotorycznej zwierząt z unieruchomioną głową jest tłumiony w pierwszym dniu treningu, ale stabilizuje się w 4 dniu treningu (ryc. 6D). Na podstawie tych pomiarów sugerujemy, że minimalny czas trwania okresu szkolenia myszy w mobilnej klatce domowej wynosi 4 dni, zgodnie z opisem w niniejszym protokole.
Korzystanie z podnoszonej powietrzem, mobilnej klatki domowej z płaską podłogą pozwala na dodanie złożonych zadań (sensomotorycznych, percepcyjnych i poznawczych) do paradygmatów treningowych dla myszy z głową. W niniejszej pracy przedstawiono dwa protokoły testów behawioralnych. Oba protokoły wykorzystują sygnały zapachowe i mogą być łączone z obrazowaniem/zapisami podłużnymi w korze myszy. Chociaż mobilna klatka domowa jest wykonana z materiałów nienasiąkliwych, nadal należy wziąć pod uwagę możliwe zakłócenia między zapachem urządzenia a zapachem testowym. Innym czynnikiem, który może zakłócać wizualne/dotykowe wskazówki eksperymentu behawioralnego, jest połączenie między ścianą a wkładką, które nie jest bezszwowe i dlatego może być postrzegane przez zwierzę jako punkt orientacyjny. Warto w tym miejscu zauważyć, że w celu zminimalizowania stresu zwierzęcia podczas takich interwencji, jak umieszczanie bawełny wydzielającej zapach na ścianie mobilnej klatki domowej, eksperymentator powinien ćwiczyć wykonywanie takich interwencji tak szybko, jak to możliwe i unikać długotrwałego obchodzenia się z klatką węglową. Można sobie wyobrazić alternatywne strategie prezentacji nowego zapachu/obiektu, np. umieszczanie kropli roztworu hydrożelowego lub przedmiotów (takich jak chipsy spożywcze) na małych półkach przymocowanych do wewnętrznej powierzchni ściany klatki węglowej na wysokości zgodnej z ułożeniem głowy zwierzęcia.
Mobilna klatka domowa umożliwia zwierzętom z mocowaną głową wykonywanie szerokiego zakresu dwuwymiarowych ruchów, w tym lokomocji poziomej, przysiadów, pielęgnacji, ubijania, lizania, szturchania nosa, wykwalifikowanych ruchów przedniej łapy i dotykania ściany kończynami przednimi, jak pokazano w niniejszym badaniu. Korzystając z mobilnej klatki domowej i przedstawionych tutaj protokołów, naukowcy mogą badać sensomotoryczny układ neuronalny z wysokim poziomem kontroli zarówno nad warunkami stymulacji, jak i odczytami behawioralnymi. Co więcej, badania zdolności poznawczych u obudzonych myszy mogą być przeprowadzane podczas zadań związanych z kondycjonowaniem, nawigacją przestrzenną i podejmowaniem decyzji.
Istnieje kilka praktycznych ograniczeń tej metody. Po pierwsze, potrzebna jest znaczna ilość sprężonego powietrza, aby osiągnąć siłę podnoszenia klatki domowej i przeprowadzić długotrwałe eksperymenty. Po drugie, mobilna klatka domowa w swojej obecnej realizacji ma zaledwie 18 cm średnicy, a zatem zapewnia stosunkowo małą i prostą przestrzeń w porównaniu z wirtualną rzeczywistością, gdzie można zaprojektować złożone środowisko eksperymentalne bez żadnych ograniczeń przestrzennych. Po trzecie, podczas prezentowanych tu eksperymentów ze stymulacją wąsów i nagrodą wykorzystano urządzenie, które ogranicza możliwość kontaktu myszy ze ścianą. Dodanie zewnętrznego kanału stymulacji wzrokowej lub sensorycznej (takiego jak projektor światła skierowanego do oka) wymagałoby zaprojektowania bardziej ergonomicznego i kompaktowego urządzenia w porównaniu z rozwiązaniami wieloekranowymi lub kopułkowymi, które zostały wykorzystane w eksperymentach z bieżnią sferyczną.
Podsumowując, wykorzystanie myszy z głową poruszających się w mobilnej klatce domowej podnoszonej powietrzem znacznie ułatwia badania, które łączą komórkowe, molekularne i behawioralne poziomy obserwacji i manipulacji w jednym eksperymencie. Konkretne zastosowania zilustrowane tutaj obejmują obrazowanie mikroskopowe dwufotonowe, wewnętrzne obrazowanie sygnału optycznego i zapisy patch-clamp u nieznieczulonych myszy zachowujących się. Oczekuje się, że takie podejście otworzy nowe horyzonty w eksperymentach na obudzonych, zachowujących się myszach i posłuży jako użyteczne narzędzie zarówno do opracowywania leków, jak i podstawowych badań nad funkcjonowaniem mózgu.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują prof. Eero Castrenowi za jego cenne uwagi na temat manuskryptu. Prace są wspierane przez granty z Akademii Fińskiej, Fińskiego Centrum Mobilności Międzynarodowej oraz Fińskiej Wyższej Szkoły Neuronauki (Brain and Mind Doctoral Program).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pęseta, stal nierdzewna, 115 mm | XYtronic | XY-2A-SA | |
| Trymer do zwierząt, maszynka do golenia | Aesculap Isis | GT420 | |
| Mikroskop lornetkowy | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Biologiczny regulator temperatury z poduszką grzewczą ze stali nierdzewnej | Supertech | TMP-5b | |
| ostrze mikrochirurgiczne | BD | REF | |
| Rurka borokrzemianowa z żarnikiem | Sutter Instruments | BF120-69-10 | Do produkcji pipet punktowych |
| Kamera | Foscam | FI8903W | Widoczność w nocy |
| Carprofen | Pfizer | Rimadyl vet | |
| Cement dentystyczny | DrguDent, Dentsply | REF 640 200 271 | |
| Deksametazon | FaunaPharma | Rapidexon weterynarz | |
| Wiertła jednorazowe | Meisinger | HP 310104001001008 | |
| Dulbeco' s PBS 10x | Sigma | D1408 | |
| Dumont #5 kleszcze, 110 mm | FST | 91150-20 | |
| Smar do oczu | Novartis | Viscotears | Do ochrony oczu podczas pracy i jako roztwór wiskozy do zanurzenia |
| Sterowanie wiertłem Foredom | FM3545 | ||
| Rękojeść z mikrosilnikiem | Foredom | MH-145 | |
| Czteroskrzydłowy metalowy uchwyt | neurotar | ||
| dla myszy | Narishige | SG-4N | Zmontowany na instrumencie stereotaktycznym |
| Gąbka kolagenowa do hemostazy | Avitene, Ultrafoam BARD | Ref 1050050 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamina | Intervet | Ketaminol weterynarz | |
| Kwik-Sil | WPI | ||
| Mai Tai DeepSee laser | Spectra-Physics | ||
| Kleszcze do mikroobciągania, 105 mm | Aesculap | BD302R | |
| Ściągacz do mikroelektrod | Narishige | PC-10H | Ściągacz pionowy do produkcji pipet szklanych |
| Mikromanipulator | Sensapex | ||
| Śruba mini | Centrostyle | Ref. 00343 s/steel M1.0x4.5 | |
| Mobilny klatka domowa | Neurotar | ||
| Wielofotonowy laserowy mikroskop skaningowy | Olympus | FV1000MPE | |
| Waciki włókninowe, 5 x 5 | Molnlycke Health Care | Mesoft | Tampony chirurgiczne |
| Klej poliakrylowy | Henkel | Loctite 401 | |
| Szkiełko nakrywkowe okrągłe | Mikroskopia elektronowa Sciences | 1.5 grubość | |
| Instrument stereotaktyczny dla małych zwierząt | David Kopf Instruments | 900 | |
| Nożyczki studenckie do irysów, proste 11,5 cm | FST | 91460-11 | |
| Xylazine | Bayer Health Care | Rompun weterynarz |
Bibliografia
- Li, N., et al. mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists. Science. 329, 959-964 (2010).
- Sitdikova, G., et al. Isoflurane suppresses early cortical activity. Annals of Clinical and Translational Neurology. 1 (1), 15-26 (2013).
- Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A miniature head-mounted two-photon microscope. high-resolution brain imaging in freely moving animals. Neuron. 31, 903-912 (2001).
- Piyawattanametha, W., et al. In vivo brain imaging using a portable 2.9 g two-photon microscope based on a microelectromechanical systems scanning mirror. Optics letters. 34, 2309-2311 (2009).
- Sawinski, J., Wallace, D. J., Greenberg, D. S., Grossmann, S., Denk, W., Kerr, J. N. D. Visually evoked activity in cortical cells imaged in freely moving animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19557-19562 (2009).
- Fee, M. S. Active stabilization of electrodes for intracellular recording in awake behaving animals. Neuron. 27, 461-468 (2000).
- Greenberg, D., Houweling, A., Kerr, J. Population imaging of ongoing neuronal activity in the visual cortex of awake rats. Nat Neurosci. 11 (7), 749-751 (2008).
- Fujiwara-Tsukamoto, Y., et al. Reinforcing operandum: rapid and reliable learning of skilled forelimb movements by head-fixed rodents. Journal of Neurophysiology. 108, 1781-1792 (2012).
- Scott, B. B., Brody, C. D., Tank, D. W. Cellular Resolution Functional Imaging in Behaving Rats Using Voluntary Head Restraint. Neuron. 80, 371-384 (2013).
- Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nat Neurosci. 13, 1433-1440 (2010).
- Parry, T. J., McElligott, J. G. A method for restraining awake rats using head immobilization. Physiolog & behavior. 53 (5), 1011-1015 (1993).
- Brecht, M., Schneider, M., Sakmann, B., Margrie, T. W. Whisker movements evoked by stimulation of single pyramidal cells in rat motor cortex. Nature. 427 (6976), 704-710 (2004).
- Van Looij, M. A. J., Liem, S. -S., van der Burg, H., van der Wees, J., De Zeeuw, C. I., van Zanten, B. G. A. Impact of conventional anesthesia on auditory brainstem responses in mice. Hearing research. 193, 75-82 (2004).
- Hentschke, H., Schwarz, C., Antkowiak, B. Neocortex is the major target of sedative concentrations of volatile anaesthetics: strong depression of firing rates and increase of GABAA receptor-mediated inhibition. The European journal of neuroscience. 21, 93-102 (2005).
- Margrie, T. W., Brecht, M., Sakmann, B. In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain. Pflugers Archiv: European journal of physiology. 444, 491-498 (2002).
- Crochet, S., Petersen, C. C. H. Correlating whisker behavior with membrane potential in barrel cortex of awake mice. Nat Neurosci. 9, 608-610 (2006).
- Houweling, A. R., Brecht, M. Behavioural report of single neuron stimulation in somatosensory cortex. Nature. 451, 65-68 (2008).
- Poulet, J. F. A., Petersen, C. C. H. Internal brain state regulates membrane potential synchrony in barrel cortex of behaving mice. Nature. 454, 881-885 (2008).
- Bryant, J. L., Roy, S., Heck, D. H. A technique for stereotaxic recordings of neuronal activity in awake, head-restrained mice. Journal of neuroscience methods. 178, 75-79 (2009).
- De Kock, C. P. J., Sakmann, B. Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16446-16450 (2009).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56, 43-57 (2007).
- Hentschke, H., Haiss, F., Schwarz, C. Central signals rapidly switch tactile processing in rat barrel cortex during whisker movements. Cerebral cortex. 16, 1142-1156 (2006).
- Stüttgen, M. C., Rüter, J., Schwarz, C. Two psychophysical channels of whisker deflection in rats align with two neuronal classes of primary afferents. J. neuroscience. 26, 7933-7941 (2006).
- Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67, 1048-1061 (2010).
- Drew, P. J., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Fluctuating and sensory-induced vasodynamics in rodent cortex extend arteriole capacity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (20), 8473-8478 (2011).
- Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation. Nature. 461, 941-946 (2009).
- Chen, G., King, J. A., Burgess, N., O’Keefe, J. How vision and movement combine in the hippocampal place code. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 378-383 (2013).
- Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task. Nature. 484 (7392), 62-68 (2012).
- Holtmaat, A., et al. Long-term , high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 19-22 (2009).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J. Vis. Exp. (12), (2008).
- Portera-Cailliau, C., Trachtenberg, J. T., de Paola, V., Svoboda, K., Wilbrecht, L., Holtmaat, A. Imaging Neocortical Neurons through a Chronic Cranial Window. Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (2012).
- Garaschuk, O., Milos, R. -I., Konnerth, A. Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo. Nat Protoc. 1 (1), 380-386 (2006).
- Barry, P. H. JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements. Journal of neuroscience methods. 51 (1), 107-116 (1994).
- Golshani, P., Gonçalves, J. T., Khoshkhoo, S., Mostany, R., Smirnakis, S., Portera-Cailliau, C. Internally mediated developmental desynchronization of neocortical network activity. The Journal of neuroscience. 29 (35), 10890-10899 (2009).
- Polack, P. -O., Friedman, J., Golshani, P. Cellular mechanisms of brain state-dependent gain modulation in visual cortex. Nat Neurosci. 16 (9), 1331-1339 (2013).
- Schwarz, C., et al. The head-fixed behaving rat--procedures and pitfalls. Somatosensor., & motor research. 27, 131-148 (2010).
Przedruki i uprawnienia
