Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Szybkie genotypowanie zwierząt, a następnie tworzenie pierwotnych kultur neuronów mózgowych

16.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51879

⸱

29 stycznia 2015

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology & Biophysics, University of Iowa Carver College of Medicine, 2Department of Psychiatry, University of Iowa Carver College of Medicine, 3EZ BioResearch LLC

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy procedury znakowania i genotypowania nowonarodzonych myszy oraz generowania z nich pierwotnych kultur neuronalnych. Genotypowanie jest szybkie, wydajne i niezawodne oraz pozwala na automatyczną ekstrakcję kwasów nukleinowych. Jest to szczególnie przydatne w przypadku myszy ze śmiertelnością noworodków i ich hodowli, które wymagają wcześniejszego zakończenia genotypowania.

Streszczenie

Analiza morfologii i funkcji neuronów ssaków w wysokiej rozdzielczości często wymaga genotypowania poszczególnych zwierząt, a następnie analizy pierwotnych kultur neuronów. Opisujemy zestaw procedur dotyczących: znakowania nowonarodzonych myszy do genotypowania, szybkiego genotypowania i ustanawiania kultur neuronów mózgowych o niskiej gęstości od tych myszy. Poszczególne myszy są znakowane poprzez tatuowanie, co pozwala na długotrwałą identyfikację trwającą do wieku dorosłego. Genotypowanie według opisanego protokołu jest szybkie i wydajne oraz pozwala na automatyczną ekstrakcję kwasu nukleinowego z dobrą niezawodnością. Jest to przydatne w okolicznościach, w których nie ma wystarczającej ilości czasu na konwencjonalne genotypowanie, np. u myszy cierpiących na śmiertelność noworodków. Pierwotne hodowle neuronów są generowane przy niskiej gęstości, co umożliwia eksperymenty obrazowe w wysokiej rozdzielczości przestrzennej. Ta metoda hodowli wymaga przygotowania glejowych warstw zasilających przed posiewem neuronów. Protokół stosuje się w całości do mysiego modelu dystonii zaburzeń ruchowych DYT1 (myszy knock-in ΔE-torsinA), a hodowle neuronów są przygotowywane z hipokampa, kory mózgowej i prążkowia tych myszy. Protokół ten można zastosować do myszy z innymi mutacjami genetycznymi, a także do zwierząt innych gatunków. Co więcej, poszczególne komponenty protokołu mogą być wykorzystywane do izolowanych podprojektów. Tym samym protokół ten będzie miał szerokie zastosowanie, nie tylko w neurobiologii, ale także w innych dziedzinach nauk biologicznych i medycznych.

Wprowadzenie

Modele chorób genetycznych gryzoni okazały się przydatne w ustalaniu fizjologicznych funkcji normalnych białek i kwasów nukleinowych, a także patofizjologicznych konsekwencji ich defektów. Przykłady obejmują myszy z niedoborem białek zaangażowanych w kluczowe funkcje komórkowe, a także mysie modele zaburzeń, takich jak choroba Alzheimera. Jednak niektóre manipulacje genetyczne mogą prowadzić do śmiertelności noworodków wkrótce lub kilka dni po urodzeniu. W takich przypadkach pierwotne hodowle komórkowe są ważnym narzędziem, ponieważ żywe komórki można uzyskać od embrionalnych lub nowonarodzonych szczeniąt przed śmiercią, można je utrzymywać przez co najmniej kilka tygodni in vitro, a w tym czasie wczesny rozwój neuronów można śledzić za eksperymentami biochemicznymi, funkcjonalnymi i morfologicznymi. W przypadku kultur pierwotnych korzystne może być ułożenie neuronów na płytkach o niskiej gęstości; Dzięki temu możliwe jest uwidocznienie poszczególnych somatów, dendrytów, trzonów aksonalnych i zakończeń nerwowych w wysokiej rozdzielczości przestrzennej. Jednak przetrwanie i różnicowanie neuronów przy niskiej gęstości zazwyczaj wymaga, aby były one posiane na warstwie zasilającej glej, współhodowane z komórkami glejowymi przy braku kontaktu fizycznego z nimi lub hodowane w pożywce kondycjonowanej przez glej 1.

Tworzenie kultur neuronalnych o niskiej gęstości na warstwach zasilających glej może być zależne od szybkiego i niezawodnego genotypowania - w ciągu kilku godzin, a nie kilku dni. Szybkość jest szczególnie ważna, gdy genotyp neuronów musi być dopasowany do genotypu przygotowanej wcześniej warstwy zasilającej glej. Jako bardziej praktyczny przykład, może być konieczne podjęcie decyzji, które młode o jakim genotypie wykorzystać w tworzeniu kultur, aby zoptymalizować wydajność eksperymentu.

Tutaj demonstrujemy działający protokół, który został użyty do szybkiego, uproszczonego i niezawodnego genotypowania myszy w poprzednich publikacjach 2-6. Używane są ogonki pod mysz i dostępny w handlu zestaw. Protokół ten obejmuje jednoetapową ekstrakcję kwasów nukleinowych z tkanki i nie wymaga ani etapu oczyszczania kwasów nukleinowych, ani użycia buforu terminacyjnego ("roztwór zatrzymujący"). Wiarygodność tej metody genotypowania ilustruje przedstawienie wyników serii testów, w których wprowadzono różnice w odniesieniu do wyjściowej ilości próbek, wieku zwierząt i długości amplikonów PCR. Ten zestaw oferuje zalety automatycznej ekstrakcji i niezawodności.

Dla kompleksowości, pokazano również użycie tatuowania do długoterminowej identyfikacji zgenotypowanych myszy. Tatuowanie odbywa się poprzez nałożenie tuszu do tatuażu na skórę właściwą (pod naskórkiem) 7. Opisano procedurę tatuowania opuszków łap nowonarodzonych lub 1-dniowych myszy, chociaż tatuaże można wykonywać na innych częściach ciała, takich jak ogony i palce u nóg, oraz na zwierzętach w każdym wieku. Ponadto zademonstrowane zostaną procedury posiewu i hodowli neuronów myszy o niskiej gęstości, oparte na zoptymalizowanym przygotowaniu różnych typów warstw zasilających glej 2,8.

Używamy genetycznego mysiego modelu dziedzicznego zaburzenia neurologicznego dystonii DYT1 - autosomalnie dominującego zaburzenia ruchowego spowodowanego mutacją w genie TOR1A (c.904_906delGAG/c.907_909delGAG; p.Glu302del/p.Glu303del) 9. Kodowane białko, torsinA, należy do rodziny białek "ATPaz związanych z różnorodną aktywnością komórkową" (AAA+), których członkowie na ogół pełnią funkcje podobne do białek, pomagając w: rozwijaniu białek, rozkładaniu kompleksu białkowego, transporcie błonowym i fuzji pęcherzyków 10-13. Mutacja powoduje delecję kodonu kwasu glutaminowego w ramce i może prowadzić do manifestacji "uogólnionej izolowanej dystonii o wczesnym początku" 14,15. Jednak mechanizmy patofizjologiczne odpowiedzialne za to zaburzenie pozostają słabo poznane. W modelu myszy typu knock-in zmutowanym allelem jest Tor1atm2Wtd, wymieniony dalej jako Tor1aΔE. Heterozygotyczne myszy knock-in ΔE-torsinA są żywotne i genetycznie naśladują ludzkich pacjentów z dystonią DYT1, podczas gdy homozygotyczne myszy knock-in umierają po urodzeniu 16,17, przy czym na ulatencję do śmierci pourodzeniowej wpływa podłoże genetyczne 18. Wczesna śmierć homozygotycznych myszy knock-in wymaga, aby zarówno genotypowanie zwierząt, jak i tworzenie kultur neuronalnych zostało szybko zakończone. Jako kolejny przykład genotypowania zostanie wykorzystany Tfap2a (czynnik transkrypcyjny AP-2α, aktywujące białko wiążące wzmacniacz 2α). Białko kodowane przez ten gen jest ważne w regulacji wielu procesów komórkowych, takich jak proliferacja, różnicowanie, przeżycie i apoptoza 19.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Wszystkie procedury na zwierzętach przeprowadzone w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Iowa.

1. Długoterminowa identyfikacja myszy za pomocą tatuowania opuszków łap

  1. Unieruchom łapę tak, aby opuszka łapy (powierzchnia podeszwowa) była skierowana w stronę eksperymentatora. Przytrzymaj łapę kciukiem i palcem wskazującym. Uważaj, aby nie uszczypnąć łapy.
    UWAGA: Stabilne unieruchomienie jest ważne, aby zapewnić, że pigment tatuażu zostanie umieszczony w skórze właściwej opuszki łapy, a tym samym jest trwały 7.
  2. Przetrzyj poduszkę łapy 70% etanolem na gąbce lub waciku z gazy.
  3. Nałóż olejek do skóry na aplikator z bawełnianą końcówką i delikatnie dociśnij końcówkę do powierzchni opuszki łapy kilka razy. Używaj tylko niewielkiej ilości olejku do skóry; Występujący w dużych ilościach zapobiega przedostawaniu się pigmentu do skóry.
  4. Zanurz końcówki igieł do tatuażu w tuszu do tatuażu tuż przed tatuowaniem. Używaj czystych, aseptycznych i ostrych igieł do tatuowania, aby zmniejszyć ból i możliwość infekcji, a także zwiększyć skuteczność tatuowania.
  5. Podczas gdy powierzchnia opuszki łapy jest pokryta olejem skórnym, dociśnij końcówki igły do tatuażu pionowo i lekko do skóry pośrodku opuszki łapy i wstrzyknij tusz wiele razy. Zobacz Tabelę materiałów/sprzętu, aby uzyskać informacje na temat elektrycznego systemu tatuowania.
  6. Rozpyl 70% etanolu na gąbkę z gazy, delikatnie dociśnij ją do łapy, aby usunąć nadmiar pigmentu tatuażu z powierzchni skóry i sprawdź jakość tatuażu. Sprawdź, czy na środku opuszki łapy znajduje się ciemna, okrągła plamka, która różni się od normalnej pigmentacji skóry. Jeśli tatuaż nie jest wystarczająco ciemny lub duży, aby można go było łatwo oglądać, powtórz poprzednie kroki tatuowania.

2. Genotypowanie nowonarodzonych myszy przy użyciu zestawu do szybkiego genotypowania PCR

  1. Zdezynfekuj dystalny koniec ogona myszy 70% etanolem, odetnij 5 mm lub mniej końcówki ogona i przenieś ją do probówki z 8-probówkowym paskiem typu używanego do PCR. Użyj nieużywanej żyletki dla każdego szczeniaka, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego między próbkami. Alternatywnie użyj nożyczek, ale w tym przypadku ostrożnie i dokładnie usuń pozostałą tkankę na ostrzach za pomocą 70% etanolu. Sprawdź, czy nie ma krwawienia. Jeśli wystąpi krwawienie, należy uciskać odciętą część ogona gąbką z gazy, aż krwawienie ustanie.
  2. Dodać 200 μl roztworu do ekstrakcji DNA do każdej probówki PCR zawierającej próbkę. Zobacz Tabelę materiałów/wyposażenia, aby zapoznać się z jego składem i informacjami o zestawie.
  3. Umieść pasek probówki w termocyklerze PCR i rozpocznij ekstrakcję DNA za pomocą następującego programu: 1 cykl w temperaturze 55 °C przez 10 minut, 1 cykl w temperaturze 95 °C przez 10 minut i trzymanie w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Jest to ten sam termocykler PCR, który jest później używany do PCR.
  4. Po zakończeniu ekstrakcji DNA wyjmij pasek probówki z termocyklera i odwróć 5 razy.
  5. Przenieść 4 μl roztworu (ekstraktu DNA) z każdej próbki do nieużywanej probówki z 8-probówkowym paskiem i wymieszać z: 10 μl 2X PCR Ready Mix II, 2 μl zmieszanych starterów do przodu i do tyłu (zalecane przy 0,5 μM; patrz Tabela materiałów/sprzętu dla sekwencji) i 4 μl H2O wolnego od nukleaz, dla każdej próbki. Wirować krótko (np. 3 sekundy) za pomocą wirówki stołowej. Trzymaj probówki na lodzie przez cały czas, z wyjątkiem obsługi.
  6. Wykonaj cykle termiczne. Zobacz Tabelę materiałów/wyposażenia, aby zapoznać się z programem termicznym.
  7. Wykryj produkty amplifikowanego DNA. Załadować całkowity roztwór reakcyjny z PCR (20 μl) bezpośrednio do studzienki żelu agarozowego. Załaduj markery masy cząsteczkowej do osobnej studzienki. Zastosuj pole elektryczne.
  8. Uzyskaj obrazy fluorescencyjne pasm w świetle ultrafioletowym.

3. Pierwotna hodowla neuronów mózgowych myszy na warstwie glejowej

UWAGA: Procedury preparacji mózgu i dysocjacji komórek (3.1) są wspólne dla wszystkich późniejszych procedur. Procedury dla hodowli gleju myszy (3.2), hodowli gleju szczurów (3.3) i hodowli neuronów myszy (3.4) opisano oddzielnie poniżej.

  1. Rozwarstwienie mózgu i dysocjacja komórkowa
    1. Złożyć w ofierze jedno młode myszy lub szczura przez ścięcie, szybko usunąć mózg i umieścić go w roztworze Hanksa (patrz Tabela 1 dla składu) + 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w naczyniu o średnicy 35 mm (trzymanym na lodzie).
    2. Przetnij mózg przez linię środkową na dwie półkule. Usuń obszar zainteresowania (np. korę mózgową, prążkowie i hipokamp) z każdej półkuli mózgu. Usuń opony mózgowe i główne naczynia krwionośne z powierzchni. Pokrój obszar mózgu na 4-10 cienkich plasterków za pomocą ostrza chirurgicznego.
    3. Wypłucz plastry mózgu w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml, raz roztworem Hanksa + 20% FBS, a następnie 3 razy roztworem Hanksa (tj. bez surowicy) (wszystko w temperaturze 4 °C). Aby spłukać, dodaj 5-10 ml roztworu, pozwól plasterkom mózgu osiąść na dnie probówki, odessaj roztwór od góry i dodaj świeży roztwór. Zakończ procedurę płukania, odsysając roztwór.
    4. Przefiltrować 2 ml roztworu wytrawiającego zawierającego trypsynę (patrz tabela 1 dla składu) za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml i filtra strzykawkowego 0,2 μm i dodać filtrat bezpośrednio do probówki zawierającej wycinki mózgu. Pozwól trypsynizacji postępować przez 13 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Zneutralizować roztwór trypsyny najpierw przez zasysanie jego większości, a następnie przez dodanie 7-10 ml roztworu Hanksa + 20% FBS (4 °C).
    6. Wycinki mózgu opłukać dwukrotnie roztworem Hanksa + 20% FBS, a następnie trzy razy roztworem Hanksa (tj. bez surowicy) (wszystko w temperaturze 4 °C). Zakończ procedurę płukania, odsysając roztwór.
    7. Przefiltrować 2 ml roztworu dysocjacyjnego (patrz tabela 1 dla składu) za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml i filtra strzykawkowego 0,2 μm i dodać filtrat bezpośrednio do probówki z plastrami mózgu.
    8. Mechanicznie dysocjuj komórki, delikatnie rozcierając 10-20 razy, aż znikną widoczne kawałki tkanki. Użyj bawełnianej, wypolerowanej pipety Pasteura i unikaj tworzenia pęcherzyków podczas rozcierania.
    9. Odczekaj 3 minuty, aż małe kawałki się usiądą.
    10. Przenieść większość roztworu (~1,5 ml, pozostawiając trochę roztworu na dnie) do 15 ml probówki wirówkowej, która zawiera 3 ml roztworu Hanksa + 20% roztworu FBS (4 °C), używając bawełnianej, polerowanej ogniowo pipety Pasteura. Nie przenoś całego roztworu, ponieważ włączenie jakiegokolwiek osadu na dnie zwykle powoduje pogorszenie jakości kultury.
    11. Wirować przez 13 minut przy ~185 g (~1 100 obr./min) w temperaturze 4 °C.
    12. Delikatnie odessać supernatant, dodać 1 ml wstępnie podgrzanego podłoża galwanicznego (37 °C) do osadu i ponownie zawiesić, delikatnie pipetując kilkakrotnie za pomocą bawełnianej, polerowanej ogniowo pipety Pasteura.
      UWAGA: Do różnych celów hodowlanych stosuje się trzy różne rodzaje pożywek galwanicznych: pożywkę posiewającą-1 dla komórek glejowych myszy, pożywkę posiewającą-2 dla neuronów myszy oraz pożywkę posiewającą-3 dla neuronów szczurów i komórek glejowych (patrz tabela 1 dla kompozycji).
    13. Pobrać 10 μl zawiesiny komórek, wymieszać ją z 10 μl 0,4% roztworu błękitu trypanowego i zmierzyć gęstość żywych komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
  2. Hodowle gleju myszy
    1. Umyj szkiełka nakrywkowe, aby pomóc w ustaleniu zdrowych kultur komórek myszy.
      1. Zanurz szklane szkiełka nakrywkowe (okrągłe, o średnicy 12 mm) w 70% kwasie azotowym w szklanej szalce Petriego. Chronić przed światłem za pomocą folii aluminiowej i umieścić ją na wytrząsarce orbitalnej O/N.
      2. Opłucz szklane szkiełka nakrywkowe na szalce Petriego co najmniej trzy razy wodą destylowaną. Zanurz je w wodzie destylowanej. Umieść naczynie na wytrząsarce orbitalnej O/N.
      3. Wysuszyć szkiełka nakrywkowe na bibule filtracyjnej Whatman 150 mm w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
      4. Szkiełka nakrywkowe należy sterylizować w autoklawie.
      5. Umieść szkiełka nakrywkowe w 24-dołkowym naczyniu hodowlanym.
    2. Oznacz i genotyp nowonarodzonych myszy zgodnie z krokami 1 i 2.
    3. Uzyskaj komórki mózgowe od szczeniąt myszy, zgodnie z krokiem 3.1.
      UWAGA: Użycie kory mózgowej jest typowe dla przygotowania warstwy zasilającej glej myszy. Jednak inne obszary mózgu, takie jak hipokamp i prążkowie, będą działać po odpowiednim dostosowaniu gęstości komórek ze względu na różną liczbę i wydajność komórek z różnych regionów.
    4. Dodać ~4 ml wstępnie podgrzanego podłoża galwanicznego-1 do końcowej zawiesiny komórek (~1 ml). W celu wstępnego podgrzania pożywki hodowlanej należy umieścić roztwór w inkubatorze hodowli (5% CO2-95% O2, 37 °C) O/N, aby umożliwić ustabilizowanie się wartości temperatury i pH.
    5. Przenieść zawiesinę komórek do niepowlekanej kolby hodowlanej T25 za pomocą bawełnianej, polerowanej ogniowo pipety Pasteura. Umieścić kolbę w inkubatorze do hodowli.
    6. Po 1 dniu in vitro (DIV) przepłukać wyhodowane komórki w kolbie T25 dwukrotnie pożywką galwaniczną o temperaturze 1 (4 °C). Umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze. Płukanie przeprowadzić poprzez całkowite zassanie pożywki do wnętrza kolby za pomocą pipety Pasteura, dodanie ~5 ml świeżej pożywki i delikatne przechylenie kolby kilka razy w ruchu wirowym.
    7. W 6-9 DIV (tj. na jeden dzień przed trypsynizacją i posiewem na szkiełkach nakrywkowych, w krokach 3.2.8-3.2.13), umieścić 100 μl materiału powlekającego z białkami macierzy zewnątrzkomórkowej (uwagi dotyczące materiału powlekającego znajdują się w Tabeli materiałów/urządzeń) na szklanych szkiełkach nakrywkowych w naczyniu do hodowli i umieścić szalkę do hodowli w inkubatorze do hodowli.
    8. Przy 7-10 DIV, gdy komórki są w 20-40% zlewające się (przestrzennie ciągłe), trypsynizuj je.
      1. Przepłukać kolbę jeden raz, zasysając cały roztwór z kolby i dodając ~13 ml roztworu Hanksa (4 °C), delikatnie przechylić kolbę kilka razy ruchem wirowym i całkowicie zassać roztwór.
      2. Dodać 40 μl roztworu DNazy (stężenie końcowe, 750 jednostek/ml) do 4 ml roztworu trypsyny-EDTA, przepuścić roztwór przez filtr strzykawkowy 0,2 μm i dodać filtrat bezpośrednio do komórek w kolbie.
      3. Pozostawić trypsynizację do dezynfekcji na 13 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze.
      4. Zneutralizować roztwór trypsyny, dodając do kolby 2 ml 100% FBS (4 °C).
      5. Przenieść trypsynizowane komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml za pomocą pipety o pojemności od 5 do 10 ml, dodać ~4 ml roztworu Hanksa + 20% FBS (4 °C), odwirować przy ~185 g i 4 °C przez 13 minut i odessać supernatant.
    9. Zawiesić osad w 1 ml wstępnie podgrzanego podłoża galwanicznego-1.
    10. Zmierzyć gęstość komórek zgodnie z krokiem 3.1.13.
    11. Całkowicie odessać materiał powlekający ze szklanych szkiełek nakrywkowych i umieścić ~50 μl zawieszonych komórek glejowych na szkiełkach nakrywkowych.
      UWAGA: Komórki te utworzą warstwę zasilającą glej.
    12. Umieścić naczynie hodowlane ze szkiełkami nakrywkowymi w inkubatorze.
    13. 20-60 minut później dodaj 1 ml wstępnie podgrzanego podłoża galwanicznego-1 do każdej studzienki i umieść naczynie z powrotem w inkubatorze. Uwaga: Podczas dodawania podłoża galwanicznego pomocne będzie użycie innej pipety w celu dociśnięcia obwodu szkiełka nakrywkowego (w miejscu, w którym nie ma platerowanych komórek), tak aby szkiełko nakrywkowe nie unosiło się w podłożu.
    14. W 1 DIV warstwy zasilającej glejowej (tj. na szklanym szkiełku nakrywkowym) zastąpić pożywkę 1 ml wstępnie podgrzanego podłoża galwanicznego-1, zasysając cały roztwór do studzienki, a następnie napełniając go świeżą pożywką.
    15. Przy 2-3 DIV warstwy zasilającej glej, gdy komórki są w 80-100% zlewane, dodać inhibitor mitotyczny (10 μl mieszaniny 5-fluoro-2'-deoksyurydyny + urydyny; końcowe stężenia odpowiednio 81,2 i 204,8 μM) do każdej studzienki, aby zahamować replikację DNA, a tym samym zahamować proliferację komórek glejowych.
    16. Przy 7-9 DIV, gdy komórki są w 90-100% zlewające się (1-2 godziny przed posiewem neuronów na glejowej warstwie zasilającej), zastąp pożywkę hodowlaną wstępnie podgrzanym podłożem galwanicznym-2 (37 °C).
      UWAGA: Neurony zostaną posiane tego samego dnia, przy użyciu kroku 3.4.
  3. Kultury glejowe szczurów
    1. Pokryj kolbę hodowlaną T25 tym samym materiałem powłokowym.
      UWAGA: Jest to konieczne do późniejszego usunięcia nieprzylegających komórek w kroku 3.3.5.
      1. Dodać 2,0 ml materiału powlekającego do kolby i umieścić kolbę w inkubatorze do hodowli.
      2. Po 2-3 godzinach całkowicie zassać materiał powlekający, tak aby dno kolby wyschło.
    2. Pobrać komórki od młodych szczurów, zgodnie z krokiem 3.1.
      UWAGA: Region CA3-CA1 hipokampa służy do przygotowania warstwy zasilającej glej szczurów. Jednak inne obszary mózgu, takie jak kora mózgowa i prążkowie, będą działać po dostosowaniu do różnic w gęstości komórek spowodowanych różną liczbą i wydajnością komórek z różnych regionów.
    3. Dodać ~4 ml wstępnie podgrzanego podłoża galwanicznego-3 do końcowej zawiesiny komórek (~1 ml).
    4. Przenieść zawiesinę komórek do powlekanej kolby hodowlanej T25 za pomocą wypolerowanej ogniowo pipety Pasteura z bawełnianą zatyczką. Umieścić kolbę w inkubatorze do hodowli (5% CO2-95% O2, 37°C).
    5. Przy 2-3 DIV, gdy komórki zlewają się w 20-40%, usunąć nieprzylegające lub słabo przylegające komórki, szczelnie zamykając pokrywkę, energicznie potrząsając kolbą ~10 razy, zasysając roztwór i dodając 4-5 ml podłoża galwanicznego-3 (w temperaturze 4 °C). Powtórz tę procedurę raz. Zbadaj hodowane komórki na całym dnie kolby (np. za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym), aby potwierdzić, że te, które wydają się neuronalne (tj. te, dla których zewnętrzna krawędź ciała komórki wydaje się jasna fazowo) są całkowicie usunięte. Powtarzaj procedurę tak często, jak to konieczne, aby usunąć te komórki, a następnie umieść kolbę z powrotem w inkubatorze.
      UWAGA: Moc i całkowita wymagana liczba "wstrząsów" może się różnić w zależności od poszczególnych eksperymentatorów. Ważne jest, aby nie utrzymywać całkowitej liczby wstrząsów do ustalonej liczby, ale potwierdzić, że komórki podobne do neuronów są eliminowane.
    6. Przy 6-8 DIV, gdy komórki są w 90-100% zlewne, przejdź przez komórki glejowe, trypsynizując je, jak w kroku 3.2.8.
    7. Po odwirowaniu ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki galwanicznej-3 (4 °C), dodać 10 ml pożywki galwanicznej-3 (4 °C), przenieść trypsynizowane komórki do niepowlekanej kolby T75 i wyhodować je w inkubatorze.
      UWAGA: Komórki glejowe szczurów zostaną pasażowane dwukrotnie; W przeciwieństwie do tego, komórki glejowe myszy są pasażowane tylko raz, ponieważ stają się niezdrowe po wielu przejściach. Komórki glejowe szczurów zostaną przepuszczone w kolbach T75, które nie są pokryte żadnym materiałem powlekającym. Powłoka pozwala komórkom glejowym szczura rosnąć zbyt szybko i wytwarzać wiele komórek rzęskowych (przypuszczalnych komórek wyściółki), które później pogorszą stan hodowli neuronów.
    8. W temperaturze 17-19 działek hodowli glejowej w kolbie (tj. 11 dni po pasażowaniu i jeden dzień przed trypsynizacją i posiewem na szkiełkach nakrywkowych w krokach 3.3.9-3.3.14) umieścić 100 μl materiału powlekającego na niemytych szklanych szkiełkach nakrywkowych (okrągłych, o średnicy 12 mm) w naczyniu hodowlanym i umieścić szalkę hodowlaną w inkubatorze do hodowli.
      UWAGA: W przypadku kultur glejowych szczurów nie zauważono różnicy w wynikach hodowli z myciem szkiełek nakrywkowych lub bez niego.
    9. Przy 18-20 DIV hodowli glejowej w kolbie (tj. 12 dni po pasażowaniu) należy przygotować warstwę zasilającą glej, trypsynizując hodowane komórki, zgodnie z krokiem 3.2.8.
    10. Podczas wirowania należy całkowicie odessać materiał powlekający ze szklanych szkiełek nakrywkowych.
    11. Po odwirowaniu zawiesić osad w 1 ml pożywki galwanicznej-3 (4 °C) i zmierzyć gęstość komórek, zgodnie z krokiem 3.1.13.
    12. Dostosuj gęstość glejową do 104 żywych komórek/ml i umieść 100 μl zawiesiny komórek glejowych na szkiełkach nakrywkowych z powlekanego szkła.
      UWAGA: Komórki te utworzą warstwę zasilającą glej.
    13. Umieść naczynie hodowlane ze szkiełkami nakrywkowymi w inkubatorze na 20-60 minut.
    14. Dodać 1 ml podłoża galwanicznego o temperaturze 3 (4 °C) do każdej studzienki i umieścić naczynie z powrotem w inkubatorze.
    15. Przy 3-4 DIV warstwy zasilającej glej, gdy komórki na szkiełku nakrywkowym są w 40-80% zlewne, dodać 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej (patrz Tabela 1 dla składu), która zawiera cytozynę β-D-arabinofuranozyd (AraC, końcowe stężenie 4 μM), aby zatrzymać proliferację komórek glejowych. Umieść neurony w 7-9 DIV warstwy zasilającej glej, gdy komórki są w 60-80% zlewne, wykonując krok 3.4.
  4. Hodowle neuronów myszy
    1. Oznacz i genotyp nowonarodzonych myszy zgodnie z krokami 1 i 2.
    2. Użyj szczeniąt myszy w kroku 3.1.
    3. Dostosuj gęstość zawiesiny żywych komórek do ~2,0 x 105 komórek/ml za pomocą wstępnie podgrzanego pożywki posiewającej-2 do posiewu na komórkach glejowych myszy lub przy użyciu pożywki pożywki-3 do posiewu komórek glejowych szczurów.
    4. Umieść komórki na warstwie zasilającej glej, delikatnie dodając zawiesinę komórkową do pożywki hodowlanej w każdym dołku. Uwaga: Objętość zawiesiny komórek, która ma zostać dodana, zostanie określona na podstawie docelowej liczby komórek w basenie hodowlanym. Na przykład płytka ~ 60 μl zawiesiny komórek, aby osiągnąć 12 000 komórek / studnię.
    5. Należy pamiętać, że po pokryciu neuronów nie są konieczne żadne zmiany roztworu. Należy uważać, aby uniknąć odparowania roztworu ze studzienek w trakcie hodowli, nawilżając wnętrze inkubatora kultur.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jako przykład zastosowania tego protokołu, pokazane są reprezentatywne wyniki dla znakowania myszy za pomocą tatuowania, niezawodnego genotypowania w różnych warunkach eksperymentalnych i zakładania pierwotnych kultur neuronalnych na warstwach zasilających glej.

Tatuowanie

Nowonarodzone szczenięta zostały oznaczone na opuszkach łap za pomocą systemu do tatuowania ("Noworodek" na rysunku 1). Etykiety były wyraźnie widoczne w wieku 3 ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół obejmuje procedury tatuowania w celu znakowania/identyfikacji myszy, genotypowania myszy na podstawie końcówek ogonów oraz hodowli neuronów mózgowych myszy o niskiej gęstości. W jednej rundzie eksperymentów z udziałem 6-8 szczeniąt, procedury te zwykle wymagają odpowiednio ~0,5 godziny, ~4 godziny i ~2 godziny, w sumie 6-7 godzin. To sprawia, że praktyczne jest, aby pojedynczy eksperymentator wykonał wszystkie procedury niezbędne od momentu narodzin szczeniąt do posiewu kultur neuronalnych – ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autor (Zhengmin Huang) jest prezesem firmy EZ BioResearch LLC, która produkuje odczynniki opisane w tym artykule.

Podziękowania

Autorzy dziękują naukowcom z University of Iowa, doktorom Luisowi Tecedorowi, Ines Martins i Beverly Davidson za instrukcje i pomocne komentarze dotyczące kultur prążkowia, a także doktorom Karze Gordon, Nicole Bode i Pedro Gonzalez-Alegre za pomoc w genotypowaniu i dyskusje. Dziękujemy również dr Ericowi Weyandowi (Animal Identification and Marking Systems) za pomocne komentarze dotyczące tatuowania oraz dr Shutaro Katsurabayashi (Fukuoka University) za pomocne komentarze dotyczące hodowli myszy. Praca ta była wspierana przez granty z American Heart Association, Departamentu Obrony (nagroda Peer Reviewed Medical Research Program W81XWH-14-1-0301), Dystonia Medical Research Foundation, Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation, National Science Foundation i Whitehall Foundation (N.C.H.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ODCZYNNIKI - Maszyna do tatuażu
CleanserSystemy identyfikacji i znakowania zwierząt, Inc.NMCR3Służy do czyszczenia igieł i uchwytu po tatuowaniu.
Suszarka maszynowaSystemy identyfikacji i znakowania zwierząt, Inc.NDAR4Służy do suszenia igieł i uchwytu po czyszczeniu.
Neonate Tattoo Black PigmentSystemy identyfikacji i znakowania zwierząt, Inc.NBP01
Aplikator do przygotowania skórySystemy identyfikacji i znakowania zwierząt, Inc.Końcówka QNSPA1
Rozwiązanie do przygotowania skórySystemy identyfikacji i znakowania zwierząt, Inc.NSP01Ten odczynnik dostarcza cienką warstwę oleju, która zwiększa efektywność tatuowania i zapobiega blaknięciu tatuażu, poprzez: (informacje od dostawcy): 1) zapobiegając tymczasowemu zabrudzeniu skóry niewytatuowanej, umożliwiając w ten sposób łatwą ocenę jakości tatuażu na opuszkach łap, zanim szczeniak wróci do swojej domowej klatki – Poplamioną powierzchnię skóry można pomylić ze skórą wytatuowaną, 2) zmniejszenie uszkodzeń skóry podczas tatuowania – Zmiękczenie skóry i nasmarowanie igły pomoże igle wniknąć w skórę bez powodowania uszkodzenia skóry oraz 3) zapobiegnie przedostawaniu się tlenu cząsteczkowego do skóry, zmniejszając w ten sposób reakcje zapalne na reaktywne formy tlenu, które mogą być generowane.
ODCZYNNIKI - genotypowanie
EZ Zestaw do genotypowania Fast Tissue/Tail PCR (format probówki paskowej)EZ BioResearch LLCG2001-100
2X PCR Ready Mix IIEZ BioResearch LLCG2001-100Czerwony, ładujący barwnik do elektroforezy jest zawarty w roztworze 2X PCR Ready Mix.
Roztwór do lizy tkanek AEZ BioResearch LLCG2001-100Przygotuj roztwór do ekstrakcji DNA, mieszając 20 i mikro; l roztworu do lizy tkanek A i 180 &mikro; l roztworu do lizy tkanek B na próbkę.
Roztwór do lizy tkanek BEZ BioResearch LLCG2001-100Przygotuj roztwór do ekstrakcji DNA, mieszając 20 i mikro; l roztworu do lizy tkanek A i 180 &mikro; l roztworu do lizy tkanek B na próbkę.
Kwas octowy, lodowatyVWRBDH 3092
Gatunek zoptymalizowany pod kątem agarozy, klasa do biologii molekularnejrpiA20090-500 Stosujemy 2% żele agarozowe w buforze TAE zawierające barwnik żelowy SYBR Safe DNA (rozcieńczony 10 000-krotnie) lub bromek etydyny (0,5 &mikro; g/ml objętości żelu).
Bromek etydynySigma-AldrichE7637-1G
Kwas etylenodiaminotetraoctowy, sól disodowa dwuwodna (EDTA)FisherBP120-500
Filtrowane końcówki do pipet, bez aerozolu, 0,1-10 i mikro; lDot Scientific IncUG104-96RS Używaj sterylnych końcówek do pipet, które są wolne od DNA, RNazy i DNazy. Na wszystkich etapach związanych z DNA należy używać końcówek pipet z filtrem, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
Końcówki do pipet z filtrem, końcówki filtrujące Premium Fit, 0,5-20 i mikro; lDot Scientific IncUG2020-RSUżywaj końcówek do pipet, które są sterylne i wolne od DNA, RNazy i DNazy. Na wszystkich etapach związanych z DNA należy używać końcówek pipet z filtrem, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
Końcówki do pipet z filtrem, końcówki filtrujące Premium Fit, 1-200 i mikro; lDot Scientific IncUG2812-RSUżywaj sterylnych końcówek do pipet, które są wolne od DNA, RNazy i DNazy. Na wszystkich etapach związanych z DNA należy używać końcówek pipet z filtrem, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
Marker masy cząsteczkowej, EZ DNA Even Ladders 100 bpEZ BioResearch LLCL1001Używamy jednego z tych trzech markerów masy cząsteczkowej.
Marker masy cząsteczkowej, EZ DNA Even Ladders 1000 bpEZ BioResearch LLCL1010
Marker masy cząsteczkowej, TrackIt, 100 bp DNA LadderGIBCO-Invitrogen10488-058
Probówki do PCR, 8-probówkowe paski z indywidualnie mocowanymi górnymi nakrętkami kopułkowymi, naturalne, 0,2 ml USA Scientific1402-2900Używaj probówek, które są sterylne i wolne od DNA, RNazy i DNazy. Pasek z 8 probówkami jest łatwiejszy w obsłudze i grupowaniu próbek niż pojedyncze probówki.
Probówki PCR, Ultraflux Individual rpi145660Używaj probówek, które są sterylne i wolne od DNA, RNazy i DNazy.
Probówka do mikrowirówek Seal-Rite 0,5 ml, naturalnaUSA Scientific1605-0000Używaj probówek, które są sterylne i wolne od DNA, RNazy i DNazy.
SYBR Bezpieczne barwienie żelowe DNA * 10 000x stężenie w DMSOGIBCO-InvitrogenS33102
Tris baserpiT60040-1000
Startery do amplifikacji genu Tor1a w Δ Myszy knock-in E-torsinA:5'-AGT, CTG, TGG, CTG, GCT, CCC, CC-3' (do przodu) i 5'-CCT, CAG, GCT, GCT, AC, AAC, CAC-3' (do tyłu) (odniesienie 18). Startery te zastosowano w końcowym stężeniu 1,0 ng/&mikro; l (~0,16 &mikro; M) (odniesienie 2).
Startery do amplifikacji genu Tfap2a u myszy5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (do przodu), 5'-CGT GTG GCT GTT GTT GTT GCT GAG GTA-3' (do tyłu) dla amplikonu 498-bp, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (do przodu), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GGA GAT CAT TC-3' (do tyłu) dla amplikonu 983-bp, oraz 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (do przodu), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (do tyłu) dla amplikonu z 1990 r. Te podkłady są używane w temperaturze 0,5 &mikro;M.
ODCZYNNIKI - hodowla
5-Fluoro-2′-deoksyurydynaSigma-AldrichF0503-100MGZobacz sekcję komentarzy urydyny, aby uzyskać więcej informacji.
B-27 suplementGIBCO-Invitrogen17504-044
Szalki do hodowli komórkowych 35 x 10 mm, kolby353001poddane
tkankowych, T25, poddane działaniu kultur tkankowych, z nasadką z zatyczką, 25 cm2 Obszar wzrostu, 70 mlBD falcon353082
Kolby do hodowli komórkowych, T75, poddane działaniu kultur tkankowych, z przechyloną szyjką, wentylowana nasadka, 75 cm2 Obszar wzrostu, 250 mlBD falcon
polipropylen, 15 mlBD falcon
Countess (licznik numerów komórek)GIBCO-InvitrogenC10312
Cytozyna β-D-Arabinofuranozyd chlorowodorek (chlorowodorek Ara-C)Sigma-AldrichC6645-100mg
D-(+)-glukoza (dekstroza) bezwodna, SigmaUltra, 99.5% (GC)Sigma-AldrichG7528-250G
Naczynie, szkło Petriego 100 x 15 mmPyrex3160-101
Woda destylowanaGIBCO-Invitrogen15230-147
DNaza Typ IISigma-AldrichD4527-200KURoztwór podstawowy przygotowuje się w stężeniu 1 500 jednostek/20 μ l = 75 000 jednostek/ml w wodzie destylowanej.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), wysoka glukoza, GlutaMAX, pirogronianGIBCO-Invitrogen10569-010, 500 ml
Fast PES Filter Unit, 250 ml, membrana o średnicy 50 mm, 0,2 µ m Wielkość porówNalgene568-0020
Szybka jednostka filtrująca PES, 500 ml, membrana o średnicy 90 mm, 0,2 i mikro; m Wielkość porówNalgene569-0020
Płodowa surowica bydlęca (FBS)GIBCO-Invitrogen26140-079
Szkiełko nakrywkowe, 12 mm Okrągłe, grubość 0,09– 0,12 mm, nr 0Carolina633017
GlutaMAX-IGIBCO-Invitrogen35050-061
Sole zrównoważone HanksaSigma-AldrichH2387-10X
HEPES, ≥ 99,5% (miareczkowanie)Sigma-AldrichH3375-250G
Kwas solny, 37%, odczynnik A.C.S. Sigma-Aldrich258148-100 ML
InsulinaSigma-AldrichI5500-250 mg
Siarczan magnezu siedmiowodny, MgSO4•( 7H2O), BioUltra, ≥ 99,5% (Fluka)Sigma-Aldrich63138-250G
Matrigel Roztwór do membrany podstawnej, Phenol Red-FreeBD Biosciences356237Jest to materiał powłokowy do szkiełek nakrywkowych i kolb. 1) Aby go przygotować, rozmrozić roztwór Matrigel Basement Membrane Matrix na lodzie, co zwykle zajmuje ~1 dzień. Za pomocą wstępnie schłodzonej pipety rozprowadzić rozmrożony roztwór do wstępnie schłodzonych kolb T25 na lodzie i przechowywać kolby w temperaturze -20 °C. Aby przygotować roboczy roztwór Matrigel, należy rozmrozić podzielony Matrigel w kolbie na lodzie, rozcieńczyć 50-krotnie, dodając wstępnie schłodzony roztwór MEM i utrzymywać rozcieńczony roztwór w temperaturze 4 °C. Ważne jest, aby wstępnie schłodzić wszystkie kultury i podłoża, które mają kontakt z Matrigel, z wyjątkiem okresu powlekania szkiełek nakrywkowych i po ich powlekaniu, aby zapobiec przedwczesnemu tworzeniu się żelu. 2) Aby pokryć szklane szkiełka nakrywkowe lub kolby hodowlane preparatem Matrigel, należy nałożyć roztwór Matrigel na powierzchnię. Przed poszyciem komórek ważne jest, aby całkowicie wysuszyć powierzchnię. W tym celu pomocne może być zasysanie Matrigelu podczas wirowania komórkowego bezpośrednio przed posiewem komórek i pozostawienie wystarczającej ilości czasu na wyschnięcie.
Minimum Essential Medium (MEM)GIBCO-Invitrogen51200-038
MITO+ Przedłużacz surowicy, 5 mlBD Biosciences355006
Płytki wielodołkowe, 24-dołkowe płytki BD Falcon 353047
tkankowej, płytki 6-dołkowe poddane kulturze tkankowejBD falcon353046
Neurobasal-A Medium (1X), płynGIBCO-Invitrogen10888-022
Kwas azotowyVWRbdh 3044
NS (suplement neuronalny) 21 przygotowane w laboratoriumŹródło: odniesienie 69
Pipety Pasteura, 5 i frac34; ”  Fisher13-678-6AUżyj tego bawełnianego wkładu 5 i frac34; ” Pipeta Pasteura do rozcierania komórkowego. Wcześniej wypoleruj końcówkę na gorąco, aby wygładzić powierzchnię cięcia i zmniejszyć średnicę wewnętrzną do 50-80% oryginału. Zbyt mała końcówka zakłóci pracę komórek i zmniejszy ich żywotność, ale zbyt duża końcówka zmniejszy skuteczność rozcierania.
Pipety Pasteura, 9"  Fisher13-678-6B
Chlorek potasu (KCl), SigmaUltra, ≥ 99.0%Sigma-AldrichP9333-500G
Pipeta serologiczna, 2 mlBD falcon357507
Pipeta serologiczna, 5 ml Pipeta serologiczna 357543
10 mlPipeta sokol357551
Pipeta serologiczna, 25 mlPipeta sokoła 357525
BD, 50 ml BD falcon357550
Wodorowęglan sodu (NaHCO3, wodorowęglan sodu), SigmaUltra, ≥ 99,5%Sigma-AldrichS6297-250G
Chlorek sodu (NaCl), SigmaUltra, ≥ 99,5%Sigma-AldrichS7653-250G
Wodorotlenek sodu (NaOH), granulki, 99,998% metali śladowych na bazieSigma-Aldrich480878-250G
Fosforan sodu dwuzasadowy siedmiowodny (Na2HPO4•( 7H2O)), ≥ 99,99%, AldrichSigma-Aldrich431478-250G
Sacharoza, SigmaUltra, ≥ 99,5% (GC)Sigma-AldrichS7903-250G
Filtr strzykawkowy, sterylny, 0,2 i mikro; m431219Corning
, 3 mlBD falcon309585
Transferyna, Holo, osocze bydlęceCalbiochem616420
Barwienie błękitem trypanowym, 0,4%GIBCO-InvitrogenT10282Służy do liczenia żywych/martwych komórek. Wymień stary roztwór błękitu trypanowego, jeśli jest ponownie używany wiele razy (np. kilka razy w tygodniu przez kilka tygodni), ponieważ spowoduje on wytrącenie się osadów i spowoduje błędne odczyty gęstości komórkowej.
Trypsyna, typ XISigma-AldrichT1005-5G
Roztwór trypsyny-EDTA, 0,25% GIBCO-Invitrogen25200-056
UridineSigma-AldrichU3003-5GRoztwór podstawowy przygotowuje się w 50 mg 5-fluoro-2'-deoksyurydyny i 125 mg urydyny w 25 ml DMEM (odpowiednio 8,12 i 20,48 mM).
ODCZYNNIKI - immunocytochemia
Przeciwciało, królicze poliklonalne przeciwciało anty-MAP2Merck MilliporeAB5622
, mysi monoklonalny koktajl anty-GFAPMerck MilliporeNE1015
SPRZĘT - tatuaż
AIMSAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NEO– 9Ten system tatuażu noworodków gryzoni to system elektryczny, który działa poprzez szybkie przesuwanie 1- lub 3-punktowych igieł do tatuażu pionowo w głąb skóry. Aktywuj maszynkę do tatuażu raz na około 0,5 sekundy, podczas gdy końcówki igieł do tatuażu są trzymane prostopadle do powierzchni skóry. Preferujemy tatuowanie trzyigłowe, aby zmaksymalizować wytatuowany obszar, ale tatuowanie jednoigłowe jest skuteczne na węższych obszarach, np. palcach u nóg lub jeśli konieczna jest precyzyjna kontrola mechaniczna, np. gdy tatuowane są liczby. Dwie rundy tatuowania z najmniejszą prędkością (ustawienie "1" z 3 kroków) są zazwyczaj wystarczające, aby uzyskać widoczny i długotrwały tatuaż opuszków łap.
WYPOSAŻENIE - system do genotypowania
Elektroforeza, poziomy, Wide Mini– Komórka podrzędna GTBIO– RAD170– 4405Typowe parametry elektroforezy to natężenie pola elektrycznego o natężeniu 6 V/cm i czas trwania 25 minut dla żelu o długości 10 cm.
FluorChem 8800ProteinSimpleFluorChem 8800
PCR, MJ Mini Thermal CyclerBIO-RADPTC-1148EDUNasze reakcje PCR dla genu Tor1a w Δ Myszy knock-in E-torsinA są następujące: 1 cykl denaturacji w 94 ° C przez 3 minuty, 35 cykli denaturacji w 94 ° C przez 30 sekund, wyżarzanie w temperaturze 58 ° C przez 30 sekund, przedłużenie na 72 i #176; C przez 2 min. Po tym następuje ostateczne rozszerzenie na 72 i #176; C przez 10 minut i trzymając w temperaturze 4 °C.
Zasilacz, PowerPac BasicBIO-RAD164-5050
SPRZĘT - hodowle
Automatyczny licznik komórek, CountessGIBCO-InvitrogenC10310Ten automatyczny licznik komórek oddzielnie mierzy gęstość żywych i martwych komórek (odpowiednio niebarwionych i barwionych błękitem trypanowym). Ważne jest, aby znać optymalny zakres pomiarów gęstości: licznik, którego używamy, ma najwyższą dokładność w zakresie od 1 x 105 do 4 x 106 komórek/ml. Jeśli zmierzone wartości gęstości komórek wykraczają poza zalecany zakres, należy odpowiednio wyregulować objętość ponownego zawieszenia.
Szafa bezpieczeństwa biologicznego, klasa II, typ A2NUAIRENU-425-400Ten kaptur jest używany do wszystkich procedur hodowli komórkowych, z wyjątkiem sekcji mózgu.
Inkubator CO2, AutoFlow, kontrola wilgotności Płaszcz wodnyNUAIRENU-4850
Pozioma czysta ławkaNUAIRENU-201-330Ta czysta ławka służy do sekcji mózgu (kroki 3.1.1 i 3.1.2 "Rozwarstwienie mózgu i dysocjacja komórkowa)".
Wytrząsarka wolnoobrotowa Orbit LSLabnetS2030-LS-B
SORVALL RC-6 Plus Superspeed WirówkaFisher46910 (wirówka)/46922 (wirnik)
. typu dzikiego komórkowa do hodowli komórkowych BD działaniu kultur Probówka stożkowa 353136 , Szkiełka komorowe 352095 poddane kulturzesokolak BD, Strzykawka do komórkowe

Bibliografia

  1. Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G. Ch. 13. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 339-370 (1998).
  2. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Ho, K. W., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Synaptic vesicle recycling is enhanced by torsinA that harbors the DYT1 dystonia mutation. Synapse. 66, 453-464 (2012).
  3. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Miniature release events of glutamate from hippocampal neurons are influenced by the dystonia-associated protein torsinA. Synapse. 66, 807-822 (2012).
  4. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. Y., Harata, N. C. Abnormal cytoplasmic calcium dynamics in central neurons of a dystonia mouse model. Neurosci. Lett. 548, 61-66 (2013).
  5. Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Harata, N. C. Dystonia-associated protein torsinA is not detectable at the nerve terminals of central neurons. Neuroscience. 253C, 316-329 (2013).
  6. Iwabuchi, S., Koh, J. Y., Wang, K., Ho, K. W., Harata, N. C. Minimal change in the cytoplasmic calcium dynamics in striatal GABAergic neurons of a DYT1 dystonia knock-in mouse model. PLoS One. 8, e80793(2013).
  7. Dahlborn, K., Bugnon, P., Nevalainen, T., Raspa, M., Verbost, P., Spangenberg, E. Report of the Federation of European Laboratory Animal Science Associations Working Group on animal identification. Lab. Anim. 47, 2-11 (2013).
  8. Kawano, H., et al. Long-term culture of astrocytes attenuates the readily releasable pool of synaptic vesicles. PLoS One. 7, e48034(2012).
  9. Ozelius, L. J., et al. The early-onset torsion dystonia gene (DYT1) encodes an ATP-binding protein. Nat. Genet. 17, 40-48 (1997).
  10. Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 519-529 (2005).
  11. White, S. R., Lauring, B. AAA+ ATPases: achieving diversity of function with conserved machinery. Traffic. 8, 1657-1667 (2007).
  12. Burdette, A. J., Churchill, P. F., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. The early-onset torsion dystonia-associated protein, torsinA, displays molecular chaperone activity in vitro. Cell Stress Chaperones. 15, 605-617 (2010).
  13. Zhao, C., Brown, R. S., Chase, A. R., Eisele, M. R., Schlieker, C. Regulation of Torsin ATPases by LAP1 and LULL1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, E1545-1554 (2013).
  14. Ozelius, L. J., Lubarr, N., Bressman, S. B. Milestones in dystonia. Mov. Disord. 26, 1106-1126 (2011).
  15. Albanese, A., et al. Phenomenology and classification of dystonia: a consensus update. Mov. Disord. 28, 863-873 (2013).
  16. Goodchild, R. E., Kim, C. E., Dauer, W. T. Loss of the dystonia-associated protein torsinA selectively disrupts the neuronal nuclear envelope. Neuron. 48, 923-932 (2005).
  17. Dang, M. T., et al. Generation and characterization of Dyt1 ΔGAG knock-in mouse as a model for early-onset dystonia. Exp. Neurol. 196, 452-463 (2005).
  18. Tanabe, L. M., Martin, C., Dauer, W. T. Genetic background modulates the phenotype of a mouse model of DYT1 dystonia. PLoS One. 7, e32245(2012).
  19. Huang, Z., Xu, H., Sandell, L. Negative regulation of chondrocyte differentiation by transcription factor AP-2α. J. Bone Miner. Res. 19, 245-255 (2004).
  20. Hall, R. D., Lindholm, E. P. Organization of motor and somatosensory neocortex in the albino rat. Brain Res. 66, 23-38 (1974).
  21. Kavalali, E. T., Klingauf, J., Tsien, R. W. Activity-dependent regulation of synaptic clustering in a hippocampal culture system. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 12893-12900 (1999).
  22. Iwaki, S., Matsuo, A., Kast, A. Identification of newborn rats by tattooing. Lab. Anim. 23, 361-364 (1989).
  23. Wang, L. A primer on rodent identification methods. Lab. Anim. 34, 64-67 (2005).
  24. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments). Nat. Protoc. 1, 936-946 (2006).
  25. Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab. Anim. 44, 88-103 (2010).
  26. Schaefer, D. C., Asner, I. N., Seifert, B., Burki, K., Cinelli, P. Analysis of physiological and behavioural parameters in mice after toe clipping as newborns. Lab. Anim. 44, 7-13 (2010).
  27. Doan, L., Monuki, E. S. Rapid genotyping of mouse tissue using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR. Kit. J. Vis. Exp. , e626(2008).
  28. Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification. J. Vis. Exp. , e3844(2012).
  29. Demeestere, I., et al. Follicle-stimulating hormone accelerates mouse oocyte development in vivo. Biol. Reprod. 87 (3), 1-11 (2012).
  30. Warner, D. R., Wells, J. P., Greene, R. M., Pisano, M. M. Gene expression changes in the secondary palate and mandible of Prdm16-/- mice. Cell Tissue Res. 351, 445-452 (2013).
  31. Higgins, D., Banker, G. Ch. 3. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 37-78 (1998).
  32. Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0.5) C57Bl/6J mice. J. Neurosci. Methods. 149, 110-120 (2005).
  33. Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. J. Vis. Exp. e895. (19), e895(2008).
  34. Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. J. Vis. Exp. , e2373(2011).
  35. Leach, M. K., et al. The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds. J. Vis. Exp. , e2389(2011).
  36. Beaudoin, G. M. 3rd, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7, 1741-1754 (2012).
  37. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J. Vis. Exp. , e3634(2012).
  38. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. , e3965(2012).
  39. Tischbirek, C. H., et al. Use-dependent inhibition of synaptic transmission by the secretion of intravesicularly accumulated antipsychotic drugs. Neuron. 74, 830-844 (2012).
  40. Nakanishi, K., Nakanishi, M., Kukita, F. Dual intracellular recording of neocortical neurons in a neuron-glia co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 105-114 (1999).
  41. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  42. Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture. Cold Spring Harb. Protoc. 2012 (3), 312-318 (2012).
  43. Song, H., Stevens, C. F., Gage, F. H. Astroglia induce neurogenesis from adult neural stem cells. Nature. 417, 39-44 (2002).
  44. Tang, X., et al. Astroglial cells regulate the developmental timeline of human neurons differentiated from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 11, 743-757 (2013).
  45. Ivkovic, S., Ehrlich, M. E. Expression of the striatal DARPP-32/ARPP-21 phenotype in GABAergic neurons requires neurotrophins in vivo and in vitro. J. Neurosci. 19, 5409-5419 (1999).
  46. Kaneko, A., Sankai, Y. Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix. PLoS One. 9, e102703(2014).
  47. Wang, X. F., Cynader, M. S. Effects of astrocytes on neuronal attachment and survival shown in a serum-free co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 209-216 (1999).
  48. Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., Gotz, J., Ittner, L. M. Primary support cultures of hippocampal and substantia nigra neurons. Nat. Protoc. 4, 78-85 (2009).
  49. Shimizu, S., Abt, A., Meucci, O. Bilaminar co-culture of primary rat cortical neurons and glia. J. Vis. Exp. , e3257(2011).
  50. Mennerick, S., Que, J., Benz, A., Zorumski, C. F. Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures. J. Neurophysiol. 73, 320-332 (1995).
  51. Chen, G., Harata, N. C., Tsien, R. W. Paired-pulse depression of unitary quantal amplitude at single hippocampal synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 1063-1068 (2004).
  52. Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. Dissection, plating, and maintenance of dorsal horn neuron cultures. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  53. Xu, H. P., Gou, L., Dong, H. W. Study glial cell heterogeneity influence on axon growth using a new coculture method. J. Vis. Exp. , e2111(2010).
  54. Daniel, J. A., Galbraith, S., Iacovitti, L., Abdipranoto, A., Vissel, B. Functional heterogeneity at dopamine release sites. J. Neurosci. 29, 14670-14680 (2009).
  55. Calakos, N., Schoch, S., Sudhof, T. C., Malenka, R. C. Multiple roles for the active zone protein RIM1α in late stages of neurotransmitter release. Neuron. 42, 889-896 (2004).
  56. Garcia-Junco-Clemente, P., et al. Cysteine string protein-α prevents activity-dependent degeneration in GABAergic synapses. J. Neurosci. 30, 7377-7391 (2010).
  57. Hogins, J., Crawford, D. C., Zorumski, C. F., Mennerick, S. Excitotoxicity triggered by Neurobasal culture medium. PLoS One. 6, e25633(2011).
  58. Panatier, A., Vallee, J., Haber, M., Murai, K. K., Lacaille, J. C., Robitaille, R. Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses. Cell. 146, 785-798 (2011).
  59. Noble, M., Mayer-Proschel, M. Ch. 18. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 499-543 (1998).
  60. Ahlemeyer, B., Kehr, K., Richter, E., Hirz, M., Baumgart-Vogt, E., Herden, C. Phenotype, differentiation, and function differ in rat and mouse neocortical astrocytes cultured under the same conditions. J. Neurosci. Methods. 212, 156-164 (2013).
  61. Malgaroli, A., Tsien, R. W. Glutamate-induced long-term potentiation of the frequency of miniature synaptic currents in cultured hippocampal neurons. Nature. 357, 134-139 (1992).
  62. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11, 713-724 (1993).
  63. Harata, N. C., Choi, S., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Frequency-dependent kinetics and prevalence of kiss-and-run and reuse at hippocampal synapses studied with novel quenching methods. Neuron. 49, 243-256 (2006).
  64. Yamamoto, M., Steinbusch, H. W., Jessell, T. M. Differentiated properties of identified serotonin neurons in dissociated cultures of embryonic rat brain stem. J. Cell Biol. 91, 142-152 (1981).
  65. Nakajima, Y., Masuko, S. A technique for culturing brain nuclei from postnatal rats. Neurosci. Res. 26, 195-203 (1996).
  66. Arttamangkul, S., Torrecilla, M., Kobayashi, K., Okano, H., Williams, J. T. Separation of μ-opioid receptor desensitization and internalization: endogenous receptors in primary neuronal cultures. J. Neurosci. 26, 4118-4125 (2006).
  67. O'Farrell, C. A., Martin, K. L., Hutton, M., Delatycki, M. B., Cookson, M. R., Lockhart, P. J. Mutant torsinA interacts with tyrosine hydroxylase in cultured cells. Neuroscience. 164, 1127-1137 (2009).
  68. Jiang, M., Deng, L., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency enables single neuron gene analysis. Gene Ther. 11, 1303-1311 (2004).
  69. Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. J. Neurosci. Methods. 171, 239-247 (2008).
  70. Robert, F., Hevor, T. K. Abnormal organelles in cultured astrocytes are largely enhanced by streptomycin and intensively by gentamicin. Neuroscience. 144, 191-197 (2007).
  71. Robert, F., Cloix, J. F., Hevor, T. Ultrastructural characterization of rat neurons in primary culture. Neuroscience. 200, 248-260 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Podstawowe kultury neuronalnewarstwa pokarmowa glejowaekstrakcja DNAamplifikacja PCRelektroforeza żelowasekcja mózgutrawienie tkankidysocjacja komórekwysiew neuronów
Szybkie genotypowanie zwierząt, a następnie tworzenie pierwotnych kultur neuronów mózgowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.