Artykuł metodologiczny

Porządkowanie pojedynczych komórek i pojedynczych zarodków w zamknięciu 3D: nowe urządzenie do badań przesiewowych o wysokiej zawartości

DOI:

10.3791/51880

⸱

18 września 2016

 ,  ,  , 
1Laboratory of Cell Physics, Institut de Science et d'Ingénierie Supramoléculaires (ISIS), CNRS and Université de Strasbourg, 2Development and Stem Cells Program, Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire (IGBMC), CNRS and Université de Strasbourg

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgłaszamy urządzenie i nową metodę badania komórek i embrionów. Pojedyncze komórki są precyzyjnie uporządkowane w układach mikrownękowych. Ich uwięzienie w 3D jest krokiem w kierunku środowisk 3D spotykanych w warunkach fizjologicznych i umożliwia orientację organelli. Kontrolując kształt komórki, ta konfiguracja minimalizuje zmienność zgłaszaną w standardowych testach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki biologiczne są zazwyczaj obserwowane na płaskich (2D) powierzchniach. Ten stan nie jest fizjologiczny, a fenotypy i kształty są bardzo zmienne. Badania przesiewowe oparte na komórkach w takich środowiskach mają zatem poważne ograniczenia: organelle komórkowe wykazują ekstremalne fenotypy, morfologie i rozmiary komórek są niejednorodne i/lub nie można prawidłowo zobrazować określonych organelli komórkowych. Ponadto komórki in vivo znajdują się w środowisku 3D; W tej sytuacji komórki wykazują różne fenotypy, głównie ze względu na ich interakcję z otaczającą macierzą zewnątrzkomórkową tkanki. W celu standaryzacji i wygenerowania kolejności pojedynczych komórek w fizjologicznie istotnym środowisku 3D dla testów komórkowych, przedstawiamy tutaj mikrofabrykację i zastosowania urządzenia do hodowli komórek 3D in vitro. To urządzenie składa się z matrycy 2D mikrownęk (zwykle 105 wnęk/cm2), z których każda wypełniona jest pojedynczymi komórkami lub zarodkami. Pozycja komórki, kształt, polaryzacja i wewnętrzna organizacja komórki zostają następnie znormalizowane, pokazując architekturę 3D. Użyliśmy formowania replik, aby uformować szereg mikrowgłębień, "miseczek jajowych", na cienkiej warstwie polidimetylosiloksanu (PDMS) przyklejonej na szkiełku nakrywkowym. Ubytki pokryto fibronektyną, aby ułatwić adhezję. Komórki wprowadzano przez odwirowanie. Procent napełnienia został zoptymalizowany dla każdego systemu, co pozwoliło na osiągnięcie do 80%. Potwierdzono żywotność komórek i zarodków. Zastosowaliśmy tę metodologię do wizualizacji organelli komórkowych, takich jak jądro i aparat Golgiego, oraz do badania procesów aktywnych, takich jak zamknięcie pierścienia cytokinetycznego podczas mitozy komórki. Urządzenie to pozwoliło na zidentyfikowanie nowych cech, takich jak okresowe akumulacje i niejednorodności miozyny i aktyny podczas zamykania pierścienia cytokinetycznego oraz zagęszczone fenotypy dla wyrównania Golgiego i jądra. Scharakteryzowaliśmy metodę dla komórek ssaków, drożdży rozszczepialnych, drożdży pączkujących, C. elegans ze specyficzną adaptacją w każdym przypadku. Wreszcie, charakterystyka tego urządzenia sprawia, że jest ono szczególnie interesujące dla testów przesiewowych leków i medycyny spersonalizowanej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecne testy in vitro oparte na komórkach są dwuwymiarowe (2D). Ta konfiguracja nie jest naturalna dla komórek ssaków i dlatego nie jest fizjologicznie istotna 1; Komórki wykazują różnorodność kształtów, rozmiarów i niejednorodnych fenotypów. Stwarzają one dodatkowe poważne ograniczenia w zastosowaniu do zastosowań przesiewowych, takie jak nieuporządkowany rozkład w płaszczyźnie i ekstremalne fenotypy organelli komórkowych (w szczególności włókien stresowych). Jest to szczególnie ważne w badaniach klinicznych dotyczących testowania leków, gdzie każdego roku wydawane są duże budżety. Większość z tych leków zawodzi jednak po zastosowaniu na modelach zwierzęcych z powodu sztucznego stanu hodowli 2D we wczesnych stadiach badań przesiewowych leków. Ponadto, stosując to podejście, nie można prawidłowo uwidocznić określonych organelli komórkowych, takich jak cytokinetyczny pierścień aktomiozyny podczas mitozy komórkowej i ogólnie struktury, które ewoluują w płaszczyźnie prostopadłej do płaszczyzny obserwacji. Zaproponowano kilka nowych testów 2D w celu przezwyciężenia wyżej wymienionych wad i zaobserwowano ważne spostrzeżenia na temat organizacji cytoszkieletu 2,3. Jednak testy te nadal mają jedno poważne ograniczenie: komórki wykazują bardzo rozproszony fenotyp w przeciwieństwie do tego, co obserwuje się in vivo, gdzie komórki prezentują architekturę 3D. Te artefakty związane z metodą hodowli mogą wyzwalać cechy niefizjologiczne, takie jak wzmocnione włókna stresowe 1,4,5.

Trójwymiarowe testy hodowli komórkowych oferują wiele zalet w porównaniu do środowisk 2D 6,7. Są one fizjologicznie bardziej istotne, a zatem wyniki są znaczące. Na przykład komórki osadzone w hydrożelach wykazują struktury podobne do 3D, ale ich morfologia różni się w zależności od komórki 8,9 . Jednak ich morfologia różni się w zależności od komórki, co komplikuje zastosowania badań przesiewowych. Alternatywną strategią jest osadzanie pojedynczych komórek w mikroprefabrykowanych wnękach 10,11. Pozycja komórki, kształt, polaryzacja i wewnętrzna organizacja komórek mogą się wtedy znormalizować. Oprócz zapewnienia komórkom architektury podobnej do 3D, mikrojamy pozwalają również na badania przesiewowe o wysokiej zawartości 10,12-14; Pojedyncze komórki można uporządkować w mikromacierze i organelle komórkowe, a ich ewolucję można obserwować równolegle. Ta regularność zapewnia dobre statystyki z małą liczbą komórek i lepszymi rozdzielczościami czasowymi/przestrzennymi. Przydatne związki są łatwiejsze do niezawodnej identyfikacji.

W tym badaniu pokazujemy produkcję i zastosowanie nowego systemu hodowli pojedynczych komórek podobnego do 3D do zastosowań przesiewowych o wysokiej zawartości 10,12,13. Urządzenie składa się z szeregu mikrowgłębień elastomerowych (105 wgłębień/cm2), zwanych "kubkami na jajka" (EC). Wymiary i całkowita objętość EC w tej pracy są zoptymalizowane do typowej objętości poszczególnych komórek NIH3T3 i HeLa podczas podziału komórkowego. Morfologia wnęk – cylindryczna – jest dobierana tak, aby odpowiednio zorientować kształt komórki w celu wizualizacji procesów aktywnych. Formowanie replik służy do modelowania układu EC na cienkiej warstwie polidimetylosiloksanu (PDMS) przyklejonej do szklanego szkiełka nakrywkowego 15,16. Komórki wprowadza się do EC przez odwirowanie. Przedstawiamy tutaj obserwację i normalizację organelli komórkowych (włókien stresu aktynowego, aparatu Golgiego i jądra) w 3D (EC) w porównaniu z tymi samymi komórkami na powierzchniach 2D (płaskich). Opisujemy również obserwację aktywnych procesów dynamicznych, takich jak zamknięcie cytokinetycznego pierścienia aktomiozyny podczas mitozy komórkowej 17. Na koniec pokazujemy wyniki tej metodologii na innych systemach o sztywnych ścianach, takich jak drożdże pączkujące, drożdże rozszczepienia i zarodki C. elegans, co potwierdza możliwość zastosowania naszej metodologii do szerokiego zakresu systemów modelowych.

Następnie przedstawiamy szczegółowy i wyczerpujący protokół w celu wytworzenia i zastosowania 'jajek' do mikroprodukcji 3D. Nasze podejście jest proste i nie wymaga czystego pomieszczenia. Przewidujemy, że ta nowa metodologia będzie szczególnie interesująca dla testów przesiewowych leków i medycyny spersonalizowanej, zastępując szalki Petriego. Wreszcie, nasze urządzenie będzie przydatne do badania rozkładu reakcji komórek na bodźce zewnętrzne, na przykład w nowotworach 18 lub w badaniach podstawowych 19.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Mikrofabrykacja 'Eggcups'

  1. Wytwarzanie wzorca: Matryca mikrownęk
    1. Podgrzej 3-calową płytkę krzemową do 200 °C, aby odparować wilgoć.
    2. Pokryj cienką warstwę fotorezystu SU-8. Dostosuj objętość żywicy i prędkość wirowania w zależności od żądanej grubości i rodzaju fotorezystu. Ta grubość będzie dyktować głębokość "miseczek na jajka" (EC). Dla warstwy o grubości 30 μm i SU-8 2025 należy wirować z prędkością 2 800 obr./min.
    3. Wstępnie piecz wafel w temperaturze 65 °C przez 1 minutę (krok 1 z 2), aby uzyskać warstwę SU-8 2025 o grubości 30 μm. Dostosuj czas w zależności od rodzaju fotorezystu i pożądanej grubości. Szczegółowe informacje można znaleźć w karcie katalogowej producenta.
    4. Wstępnie piecz wafel w temperaturze 95 °C przez 3 minuty (krok 2 z 2), aby uzyskać warstwę SU-8 2025 o grubości 30 μm. Dostosuj czas w zależności od rodzaju fotorezystu i pożądanej grubości. Szczegółowe informacje można znaleźć w karcie katalogowej producenta.
    5. Załaduj wafel na nakładkę maski w celu naświetlania promieniami UV. Umieść na nim maskę fotolitograficzną. Maska przedstawia wzór okrągłych elementów (dysków) o średnicy 20 μm. Zapewnij doskonały kontakt między sobą.
      UWAGA: Różni producenci oferują maski fotolitograficzne. O ostatecznym koszcie będzie decydowała rozdzielczość przestrzenna. Maski octanowe zapewniają akceptowalną rozdzielczość (≈10 μm) przy niskich kosztach. Maski chromowe zapewniają lepszą rozdzielczość, ale są droższe. Dostosuj średnice dysków (od maski fotolitograficznej) do objętości komórek. Wymiary dysków na masce określą średnicę wnęk w urządzeniu. Małe średnice doprowadzą do niskiego wypełnienia; Zbyt duża średnica nie ograniczy komórek. W przypadku ogniw HeLa i NIH3T3 sugerowane są średnice od 20 μm do 25 μm.
    6. Sprawdź moc lampy UV przed ekspozycją i odpowiednio zoptymalizuj czas naświetlania. Naświetlanie (długość fali = 365 nm) przez 41,5 sekundy (lub zoptymalizowany czas ekspozycji) przy 250 mJ/cm2,
      UWAGA: SU-8 2025 jest fotorezystem ujemnym, co oznacza, że obszary naświetlone promieniowaniem UV zostaną utwardzone. W tym przypadku okrągłe elementy były czarne, a reszta przezroczysta. Dodatni fotorezystor działa w odwrotny sposób: nienaświetlone obszary są utwardzane. Wybierz odpowiednio fotorezyst, w zależności od projektu i fotomaski.
      UWAGA: Chronić oczy przed promieniowaniem UV za pomocą odpowiednich okularów ochronnych.
    7. Delikatnie usuń maskę z warstwy fotorezystu.
    8. Upiecz wafel w temperaturze 65 °C przez 1 minutę (krok 1 z 2), aby uzyskać warstwę SU-8 2025 o grubości 30 μm. Upiecz wafel w temperaturze 95 °C przez 3 minuty (krok 2 z 2), aby uzyskać warstwę SU-8 2025 o grubości 30 μm. Dostosuj czas w zależności od rodzaju fotorezystu i pożądanej grubości. Szczegółowe informacje można znaleźć w karcie katalogowej producenta. Po upieczeniu wafelek schładzamy na ławce do temperatury pokojowej przez około 1 minutę.
    9. Umieść wafel w wirówce i upuść kilka mm wywoływacza SU-8, aby pokryć cały obszar płytki. Wywoływać przez 2 minuty, a następnie wirować z prędkością 1 000 obr./min przez 30 sekund. Powtórz procedurę trzy razy.
    10. Spłukać 2-propanolem, aby zapewnić całkowite usunięcie nierozwiniętego SU-8. Pojawienie się białych obszarów wskazuje na niepełny rozwój. Jeśli tak, powtórz krok tworzenia jeszcze jeden raz.
    11. Wafel należy wypalić na twardo w temperaturze 200 °C, aby zapewnić wytrzymałość wytworzonych mikrostruktur. Ten krok jest opcjonalny.
    12. Przechowuj 3-calową płytkę waflową z mikrostrukturami w polistyrenowej szalce Petriego o wymiarach 94 mm x 15 mm.
      UWAGA: Nie ma potrzeby obróbki powierzchni, w szczególności silanizacji, dla kolejnych kroków.
  2. Wytwarzanie repliki polidimetylosiloksanu (PDMS): Pillars Array
    1. Dokładnie wymieszać w stosunku 1:10 (w/w) środek sieciujący i prepolimer w sumie 30 g w probówce o pojemności 50 ml.
      UWAGA: Użycie proporcji 1:10 (v/v) również działa.
    2. Odwirować probówkę o stężeniu 1 800 x g przez 5 minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza.
    3. Delikatnie upuść PDMS na mikrostruktury.
      UWAGA: Jeśli na tym etapie pojawią się pęcherzyki powietrza, odgazuj próbkę za pomocą pompy próżniowej przez 15-20 minut.
    4. Umieścić próbkę w piecu w temperaturze 65 °C przez 4 godz.
      UWAGA: Czas utwardzania różni się w zależności od użytkownika i wraz z proporcją usieciowania: prepolimer. Ten czas będzie dyktował sztywność PDMS. Zaleca się utwardzanie dłuższe niż 2 godziny i trzymanie się ustalonego czasu utwardzania.
    5. Za pomocą skalpela delikatnie wyciąć obszar zainteresowania (stempel) o długości około 1cm2, który zawiera około 105 mikrowgłębień lub "kubków na jajka".
      UWAGA: Najpierw odetnij PDMS, a następnie delikatnie go oderwij. Sprawdź jakość repliki PDMS za pomocą mikroskopu optycznego.
  3. Wytwarzanie "kubków na jajka" poprzez formowanie replik. Poniżej opisano dwie alternatywne strategie wytwarzania "kubków na jajka". Oba protokoły są podobne i zapewniają identyczne wyniki:
    1. Strategia 1
      1. Aktywuj wytworzony stempel PDMS przez obróbkę plazmą tlenową przez 30 sekund. Aktywowane stemple należy tymczasowo przechowywać na zamkniętej szalce Petriego, aby zapobiec osadzaniu się pyłu.
        UWAGA: Dostosuj czas naświetlania, jeśli używane są inne gazy do plazmy.
      2. Umieść aktywowany stempel PDMS do góry nogami (strona ze strukturami) na szalce Petriego obok nakrętki z probówką o pojemności 15 ml. Napełnij korek 200 μl trimetylochlorosilanu (TMCS). Zamknąć szalkę Petriego i pozwolić stempelowi na silanizowanie przez 7 min.
        UWAGA: Można zaobserwować pewne tymczasowe odkształcenia na stemplu i/lub zmianę koloru (biały). Stempel w krótkim czasie odzyska swój pierwotny kształt i nie zostanie to naruszone na struktury.
        UWAGA: TMCS powoduje ostrą inhalację i toksyczność skórną oraz jest wysoce łatwopalny (z cofnięciem się zapłonu na znaczne odległości). W związku z tym należy go używać w dygestorium z dala od źródeł zapłonu.
      3. Umieść stempel PDMS na powlekarce spinowej strukturami do góry nogami. Umieść niewielką kroplę kilku mikrolitrów (około 20 μl) płynnego PDMS (1:10 w/w cross-linker: pre-polimer) na wierzch struktur. Wirowanie z prędkością 1 500 obr./min przez 30 sekund, aby nałożyć cienką warstwę PDMS na wierzch konstrukcji.
        UWAGA: Jeśli stempel nie pasuje do uchwytu do powlekarki, umieść stempel na pokrywie szalki Petriego z małym otworem pośrodku.
      4. Umieść stempel w piecu w temperaturze 65 °C na 4 godziny, aby utwardzić nałożoną warstwę PDMS pokrytą wirowo.
      5. Aktywuj cienką warstwę PDMS, umieszczając stempel PDMS do góry nogami wraz ze szklanym szkiełkiem nakrywkowym #0 o średnicy 25 mm, używając tlenowego środka do czyszczenia plazmowego przez 30 sekund. Przejdź szybko do następnego kroku.
        UWAGA: Można również stosować szkiełka nakrywkowe o innych grubościach, kształtach i wymiarach. Jednak niektóre struktury komórkowe mogą być trudne do uwidocznienia w zależności od wybranej grubości szkiełka nakrywkowego i powiększenia obiektywu i/lub NA i/lub odległości roboczej. Zapoznaj się z obiektywnym arkuszem danych.
      6. Umieścić stempel w kontakcie (strona z cienką warstwą pokrytą spinem) ze szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Delikatnie dociśnij pęsetą całą powierzchnię stempla, aby wykonać "klejenie". Na koniec utrzymuj stały nacisk na górę stempla przez około 10 sekund.
      7. Po 30 minutach delikatnie "oderwij" stempel od szkiełka nakrywkowego, aby "uwolnić" "kubki na jajka" (patrz rysunek 1). Dokładnie spłucz etanolem i wysusz. Jeśli "kubki na jajka" PDMS nie są dobrze przyklejone do szklanego szkiełka nakrywkowego (tj. odklejają się na etapie "odklejania"), rozważ dostosowanie ustawień myjki plazmowej i uruchom ponownie w kroku 1.3.1.5.
        UWAGA: Ten krok jest delikatny. Należy zwrócić uwagę, aby uniknąć pęknięcia szkiełka nakrywkowego i/lub oderwania cienkiej warstwy PDMS.
      8. Przyklej mały kawałek (uchwyt) utwardzonego PDMS o objętości 1 mm x 1 mm x 3 mm na krawędzi szkiełka nakrywkowego niewielką kroplą płynnego PDMS i utwardź PDMS jak poprzednio. Ułatwi to późniejszą manipulację próbką (zob. rysunek 1). Ten krok jest opcjonalny.
    2. Strategia 2
      1. Hydrofilizuj wytworzone stemple PDMS przez obróbkę plazmą tlenową przez 30 sekund. Aktywowane stemple należy tymczasowo przechowywać na zamkniętej szalce Petriego, aby zapobiec osadzaniu się pyłu.
        UWAGA: Dostosuj czas naświetlania, jeśli używane są inne gazy do plazmy.
      2. Hydrofilizować szklane szkiełka nakrywkowe o średnicy 25 mm #0 plazmą tlenową przy 15 W przez 30 sekund. Przejdź szybko do następnego kroku.
        UWAGA: Można również stosować szkiełka nakrywkowe o innych grubościach, kształtach i wymiarach. Jednak struktury komórkowe będą trudne do wizualizacji w zależności od wybranej grubości szkiełka nakrywkowego i obiektywnych cech (patrz uwaga powyżej).
      3. Na szklane szkiełka nakrywkowe nałóż niewielką kroplę PDMS (1:10 w/w środek sieciujący: prepolimer) o grubości kilku mikrolitrów. Wirowanie z prędkością 1 500 obr./min przez 30 sekund w celu uzyskania końcowej grubości około 50 μm.
      4. Przyklej mały kawałek (uchwyt) utwardzonego PDMS o objętości 1 mm x 1 mm x 3 mm na krawędzi szkiełka nakrywkowego niewielką kroplą płynnego PDMS i utwardź PDMS jak poprzednio. Ułatwi to późniejszą manipulację próbką (zob. rysunek 1). Ten krok jest opcjonalny.
      5. Przechowywać tymczasowo szkiełka nakrywkowe pokryte PDMS na czystej chusteczce wewnątrz szalki Petriego w celu ochrony przed osadzaniem się kurzu.
      6. Umieść kroplę odczynnika silanizującego na wierzchu każdego stempla i pozwól mu odparować przez 1-2 minuty. Następnie wysusz je pod strumieniem N2,
        UWAGA: Na tym etapie można zaobserwować chwilowe odkształcenie stempla podczas parowania. Stempel odzyska swój pierwotny kształt po wysuszeniuN2 bez trwałego odkształcenia mikrostruktur.
      7. Bardzo delikatnie upuść silanizowany stempel na szklane szkiełko nakrywkowe pokryte wirowaniem PDMS przechowywane na szalce Petriego. Upewnij się, że obie strony są całkowicie równoległe podczas kontaktu. Unikaj naciskania lub przesuwania stempla po umieszczeniu go na szkiełku nakrywkowym pokrytym PDMS.
      8. Umieść szalkę Petriego z próbkami w próżni na 1-2 godziny w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.
        UWAGA: Upewnij się, że próbki są całkowicie poziome, aby uniknąć przemieszczenia stempla. Należy również unikać wibracji potencjalnie powodowanych przez pompę próżniową.
      9. Umieścić próbki w piecu w temperaturze 65 °C na 4 godziny.
      10. Delikatnie odklej stempel, aby odsłonić "kubki na jajka". Dokładnie spłucz etanolem i wysusz.
        UWAGA: W tym momencie potrzebna jest praktyka. Zwróć uwagę, aby nie dopuścić do pęknięcia szkiełka nakrywkowego i/lub oderwania cienkiej warstwy PDMS.

2. Wprowadzanie komórek do 'Eggcups'

Aby wprowadzić komórki ssaków do 'jajowców', powierzchnia PDMS musi być funkcjonalizowana białkami adhezyjnymi macierzy zewnątrzkomórkowej. W tym przykładzie wykorzystano fibronektynę, ale można użyć innych interesujących białek, takich jak kolagen.

  1. Hydrofilizuj "kubki na jajka" w tlenowym urządzeniu do czyszczenia plazmą przez 30 sek.
    UWAGA: W razie potrzeby zoptymalizuj parametry.
  2. Przygotować roztwór w PBS 1x 20 μg ml-1 fibronektyny ze źródeł bydlęcych.
  3. Sterylizuj "bańki" promieniami UV przez 5 minut. Umieść niewielką kroplę (około 20-50 μl) roztworu fibronektyny, aby pokryć całą powierzchnię "kubeczków jajowych" i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Chroń próbkę przed wysuszeniem.
  4. Delikatnie opłucz "kubki na jajka" za pomocą PBS 1x. Powtórz 3 razy.
    UWAGA: Próbka jest gotowa do natychmiastowego użycia lub przechowywana w temperaturze 4 °C w ciemności przez kilka tygodni.
  5. Wprowadzić cylindryczny, wykonany na zamówienie kawałek tworzywa sztucznego o wysokości 63 mm, promieniu zewnętrznym 26 mm i promieniu wewnętrznym 7 mm do probówki o pojemności 50 ml (patrz rysunek 2) 20
    UWAGA: Używaj rzeczy wysterylizowanych promieniami UV lub wysterylizuj je przed użyciem.
    UWAGA: Ten element można łatwo wyprodukować w laboratorium. lub w dowolnym dostępnym warsztacie mechanicznym.
  6. Umieścić 13 ml pożywki do hodowli komórkowych w probówce (patrz Tabela 1). Pożywka powinna znajdować się co najmniej 2 cm powyżej cylindrycznego elementu, aby zapewnić całkowite zanurzenie próbki.
    UWAGA: Szczegółowe informacje na temat określonych typów komórek i innych układów modelowych, takich jak drożdże lub zarodki C. elegans, oraz odpowiadającej im użytej pożywki, znajdują się w sekcji 5 i tabeli 1. Opisany protokół został zoptymalizowany pod kątem komórek HeLa, NIH3T3 i innych linii komórkowych (patrz Tabela 1).
  7. Wprowadź bardzo delikatnie "kubki na jajka" do wnętrza tuby i równolegle do górnej części plastikowego elementu. Użyj ostrej pęsety, aby przytrzymać próbkę za pomocą uchwytu PDMS. Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe, aż znajdzie się na górnej stronie plastikowego elementu, aż zostanie całkowicie zanurzone (patrz rysunek 2).
    UWAGA: Zaleca się używanie ostrej i prostej pęsety. W przypadku zakrzywionej pęsety manipulacja próbką jest trudna i może spowodować pęknięcie.
  8. Hoduj komórki do 80-100% zbiegu na szalce Petriego P60 i zbieraj je przez trypsynizację.
    UWAGA: Komórki mogą być typu dzikiego, transfekowane lub leczone dowolnym lekiem, który ich interesuje.
    UWAGA: Należy unikać tworzenia się agregatów komórkowych, które uniemożliwią przedostawanie się pojedynczych komórek do "kubków jajowych". Aby zoptymalizować ten krok, po próbie próbowania należy dokładnie pipetować w górę i w dół.
  9. Ponownie zawiesić komórki w pożywce hodowlanej o pojemności 5 ml. Odpipetować 200 μl komórek na wierzchu "kubków na jajka".
    UWAGA: Upuść komórki tak wyśrodkowane, jak to możliwe, na wierzch "kubków na jajka", unikając kontaktu fizycznego. Zapobiegnie to pęknięciu i/lub uszkodzeniu próbki.
  10. Wirować przy 1 800 x g przez 2 min.
    UWAGA: Po pierwszym odwirowaniu sprawdzić pod mikroskopem procent napełnienia "kubków na jajka".
  11. Ponownie odpipetować 200 μl komórek na wierzchu "kubków na jajka" i odwirować przy 1 800 x g przez 2 minuty. Powtórzyć w sumie trzy razy, aby zoptymalizować procent napełnienia.
    UWAGA: Po ostatnim odwirowaniu sprawdzić pod mikroskopem procent napełnienia "kubków na jajka". W razie potrzeby powtórz kroki napełniania + wirowania, aż do osiągnięcia pożądanego procentu napełnienia.
  12. Wyjmij próbkę z probówki za pomocą ostrej pęsety trzymającej uchwyt PDMS. Należy zachować ostrożność, aby nie "przeszkadzać" komórkom, które są trzymane w "kubkach na jajka" (patrz rysunek 2).
  13. Umieścić próbkę na szalce Petriego z pożywką. Wypłukać w celu usunięcia nadmiaru komórek, które nie znajdują się w "miseczkach na jajka", delikatnie pipetując trzy razy w górę i w dół obok każdej strony (łącznie 4 strony) układu mikrostrukturalnego.
    UWAGA: Zbyt mocne pipetowanie może spowodować uwolnienie niektórych komórek z "kubków na jajka".
  14. Zastąp pożywkę świeżą pożywką, aby usunąć nieprzyłączone komórki.
    UWAGA: Na tym etapie można dodać interesujący Cię lek.
  15. Napraw komórki lub przygotuj je do obrazowania poklatkowego. Patrz krok 4.1.

3. Obserwacja aktywnej dynamiki komórkowej w 'jajach': Cytokinetyczne zamknięcie pierścienia

UWAGA: Ten przykład wykorzystuje komórki HeLa, które są transfekowane MYH10-GFP i Lifeact-mcherry odpowiednio dla miozyny i aktyny, kluczowych aktywnych cząsteczek biorących udział w zamykaniu pierścienia cytokinetycznego podczas mitozy komórki. Urządzenie jest przygotowane z mikrownękami o średnicy 25 μm. Do ich obserwacji użyto odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego, wyposażonego w obiektyw olejowy 60X (1,40 NA, DIC, Plan Apo) oraz filtry GFP (miozyna) i TxRed (aktyna). Alternatywnie użyto pionowego mikroskopu konfokalnego, wyposażonego w obiektyw wodny 25X lub 63X IR APO L (0,95 NA). W tym przykładzie zdecydowanie zaleca się synchronizację komórek przy użyciu metody podwójnego bloku tymidynowego, bloku mitotycznego lub metody mitotycznego wytrząsania 21-24.
UWAGA: Grubość PDMS zastosowanych w "miseczkach na jajka" pozwala na stosowanie różnych obiektywów zarówno w mikroskopach odwróconych, jak i ustawionych pionowo.

  1. Umieścić "kubki na jajka" w uchwycie mikroskopu i napełnić go 1 ml 10 % pożywki obserwacyjnej FCS L-15. Aby uniknąć parowania, umieść szklaną pokrywkę na wierzchu uchwytu lub nałóż cienką warstwę oleju mineralnego na podłoże. Wybierz obiektyw olejowy 60X.
    UWAGA: Pożywka L-15 jest odpowiednia dla atmosfer innych niż CO2 . Należy również pamiętać, że niektóre związki DMEM są autofluorescencyjne. Podczas korzystania z tego podłoża zaleca się fotowybielanie związków fluorescencyjnych poprzez oświetlanie go lampą o dużej intensywności przez 1-2 godz.
    UWAGA: Unikaj używania plastikowych pokrywek podczas pracy z obrazowaniem DIC.
  2. Umieścić uchwyt z kubkami na jajka i pożywką obserwacyjną w mikroskopie. Ustaw ostrość ostrożnie w świetle jasnego pola, aż "bańki jajowe" i komórki znajdą się w tej samej płaszczyźnie obserwacji.
  3. Otwórz oprogramowanie i dostosuj parametry. Wybierz filtry TxRed i GFP dla aktyny i miozyny; Dostosuj czas ekspozycji dla każdego kanału. Typowa szybkość akwizycji wynosi 5 sekund dla obu kanałów.
    UWAGA: Czas ekspozycji może wymagać dostosowania w zależności od zastosowanej konfiguracji, barwnika lub innych interesujących organelli komórkowych.
  4. Wybierz obszar zainteresowania i poszukaj pierścienia cytokinetycznego za pomocą kanału GFP lub TxRed. Dokładne ustawianie ostrości.
    UWAGA: Pierścień jest ostrzejszy w miozynie i łatwiejszy do rozpoznania.
  5. Uruchom automatyczną akwizycję w obu kanałach, aż pierścień zostanie całkowicie zamknięty.
    UWAGA: Można zaobserwować pewne fotowybielanie. Dostosuj parametry mikroskopu, aby go zmniejszyć.

4. Obserwacja stałych organelli komórkowych w 'miseczkach'

Ten krok można wykonać przed lub po kroku #3. Komórki mogą być bezpośrednio utrwalane po etapie wirowania i barwione w celu uzyskania interesujących organelli lub po obserwacji pod mikroskopem. Ten przykład pokazuje barwienie aparatu Golgiego, jądra i włókien aktynowych na fibroblastach NIH3T3 w "bańkach jajowych".

  1. Utrwalanie komórek w "bańkach jajowych"
    1. Przygotować 3% paraformaldehydu (PFA) i ogrzać w temperaturze 37 °C. Wyjąć próbkę "jajek" z probówki o pojemności 50 ml (lub uchwytu mikroskopu) i umieścić ją na szalce Petriego z P35. Spłukać raz za pomocą PBS 1x.
      UWAGA: Protokoły przygotowania 3 % paraformaldehydu są powszechnie dostępne w innych miejscach.
      UWAGA: Podczas przygotowywania PFA należy używać rękawic nitrylowych i ochrony oczu.
    2. Całkowicie usunąć PBS i wrzucić 1 ml 3% PFA i inkubować przez 17 minut. Usunąć PFA i dwukrotnie przepłukać 1 ml PBS 1X. Przepuszczalność komórek za pomocą 1 ml 0,5% Triton przez 3 minuty i płukać dwukrotnie PBS 1x przez 5 min.
  2. Barwienie komórek w "kubkach jajowych"
    1. Inkubować komórki do barwienia aparatem Golgiego pierwszorzędowym przeciwciałem poliklonalnym króliczym anty-olbrzyminem w rozcieńczeniu 1:500 w PBS. Umieść 100 μl kropli roztworu przeciwciał na plastikowym arkuszu folii i inkubuj komórki wewnątrz "jajek" do góry nogami przez 45 minut
      UWAGA: Chroń próbkę pokrywą, aby zapobiec wyschnięciu.
    2. Ostrożnie zwolnij "kubki na jajka" i umieść je na szalce Petriego P35. Spłucz 3 razy po 5 minut za pomocą PBS 1x.
    3. Przygotuj koktajl w PBS z przeciwciałem drugorzędowym Cy3 kozioł anty-królik (1:1,000) i z Phalloidin Alexa Fluor 488 (1:200) do barwienia włókien stresu aktynowego.
    4. Inkubować komórki z kroplą 100 μl roztworu przeciwciał na plastikowym arkuszu folii i inkubować komórki wewnątrz "bańek jajowych" do góry nogami przez 45 minut.
    5. Ostrożnie wyjmij "kubki na jajka" i umieść je na szalce Petriego P35. Spłucz 3 razy po 5 minut za pomocą PBS 1x.
    6. Inkubować komórki do barwienia jądra, umieszczając 100 μl kropli 1 μg ml-1 DAPI w PBS na plastikowym arkuszu folii i inkubować komórki wewnątrz "jajek" do góry nogami przez 45 minut. Ten krok można wykonać za pomocą kroku 4.2.3.
    7. Ostrożnie wyjmij "kubki na jajka" i umieść je na szalce Petriego P35. Spłucz 3 razy po 5 minut za pomocą PBS 1x.
    8. Zamontuj komórki za pomocą 15 μl Glycerol:PBS (1:1 v/v) na standardowym szkiełku mikroskopowym i uszczelnij próbkę lakierem do paznokci, aby uniknąć wysuszenia.
      UWAGA: W zależności od grubości "miseczek na jajka" montaż może być trudny. Zaleca się przechowywanie próbki na szalce Petriego z P35 w PBS, w zabezpieczeniu przed wysuszeniem.
  3. Obserwacja mikroskopowa
    UWAGA: W tym przykładzie używany jest pionowy mikroskop konfokalny, wyposażony w detektory PMT i hybrydowe. Wybrano obiektyw wodny 25X lub 63X IR APO L (0,95 NA), aby zapewnić szerokie pole próbki i pokazać możliwość zastosowania urządzenia do zastosowań przesiewowych o wysokiej zawartości.
    1. Wybierz obiektyw wodny 25X lub 63X.
      UWAGA: W zależności od zastosowania i sygnału można używać różnych obiektywów. Zaleca się jednak stosowanie obiektywów o dużej aperturze numerycznej.
    2. Umieścić nieruchomą próbkę z "bańkami jajowymi" i ostrożnie ustawić ostrość przy użyciu światła jasnego pola (kontrast fazowy lub DIC), aż "bańki" i komórki znajdą się w płaszczyźnie obserwacji.
    3. Otwórz oprogramowanie i dostosuj parametry. Wybierz filtry GFP, Cy3 i DAPI odpowiednio dla obserwacji aktyny, Golgiego i jądra; Dostosuj czas ekspozycji dla wszystkich kanałów.
      UWAGA: Czas ekspozycji może wymagać dostosowania w zależności od konfiguracji.
    4. Wybierz i ustaw ostrość na obszarze zainteresowania; rozpocznij przechwytywanie obrazu (patrz Rysunek 3).

5. Adaptacja do obserwacji komórek drożdży i zarodka C. elegans

  1. Rozszczepienie i pączkowanie komórek drożdży
    UWAGA: W tym przykładzie wykorzystano komórki drożdży rozszczepieniowych, które są oznaczone RLC1-mcherry i CHD-GFP odpowiednio dla miozyny i aktyny. Pączkujące komórki drożdży nie są tutaj znakowane fluorescencyjnie. Do obserwacji rozszczepienia drożdży użyto mikroskopu konfokalnego z odwróconym dyskiem wirującym. DO WSZYSTKICH AKWIZYCJI WYKORZYSTANO OBIEKTYW OLEJOWY 100X HCX PL APO CS (1,4 NA). Alternatywnie, komórki obserwowano również za pomocą mikroskopu z odwróconym kontrastem fazowym wyposażonego w obiektyw powietrzny z 20-krotnym kontrastem fazowym LCPlanFl (0,4 NA). W tym przykładzie protokół jest identyczny dla obu typów komórek.
    1. Przygotować powierzchnię "kubków na jajka" zgodnie z powyższym opisem. W przypadku rozszczepienia i pączkowania komórek drożdży należy przygotować wgłębienia o średnicy 5 μm (zob. tabela 1). W takim przypadku powierzchnia nie musi być funkcjonalizowana białkami adhezyjnymi.
      UWAGA: Nadzienie można zoptymalizować za pomocą stożkowych "kubków na jajka". Taki kształt wychwytuje i utrzymuje komórki, unikając uwolnienia podczas etapu płukania po odwirowaniu. Procent wypełnienia jest optymalny i wynosi około 80%. Te stożkowe "kubki na jajka" można wytwarzać za pomocą głębokiego reaktywnego trawienia jonowego 13.
    2. Hodować komórki drożdży w odpowiednich pożywkach hodowlanych (patrz tabela 1) aż do osiągnięcia gęstości optycznej (OD) w zakresie 0,2 i 0,8. Sonizacja hodowli komórek drożdży w celu usunięcia agregatów.
    3. Umieścić komórki drożdży w "kubkach na jajka" przez odwirowanie. W celu odwirowania do probówki z "kubkami na jajka" dodaje się 4 ml hodowanych komórek w odpowiednim OD. Po pierwszym odwirowaniu delikatnie wstrząsnąć probówką, aby ponownie zawiesić komórki, które nie znajdują się w "kubkach jajowych", podczas gdy komórki w "kubkach jajowych" nie zostaną naruszone. Nie otwierając probówki, odwiruj ponownie i powtórz ten krok dwukrotnie. Zapewnia to osadzanie się komórek z hodowli w pustych mikrojamach i zwiększa procent wypełnienia.
      UWAGA: Podczas pracy z drożdżami zaleca się wstępne podgrzanie wirówki do temperatury roboczej podczas eksperymentów
      UWAGA: Protokół można wstrzymać w tym miejscu i kontynuować do 12 godzin później. W takim przypadku należy przechowywać próbkę w temperaturze roboczej i przykryć ją, aby zapobiec parowaniu.
    4. Umieścić "kubki na jajka" w uchwycie mikroskopu i napełnić go wysterylizowanym pożywką filtracyjną do obrazowania. Teraz przepłucz komórki tym samym podłożem, aż pływające komórki drożdży zostaną skutecznie usunięte. Uważaj, aby nie naruszyć komórek w "kubeczkach na jajka" podczas procesu płukania.
    5. Wybierz obiektyw olejowy 100X i uważnie ustaw ostrość. Otwórz oprogramowanie i dostosuj parametry. W przypadku drożdży rozszczepialnych wybierz filtry GFP i TxRed dla aktyny i miozyny i dostosuj czas ekspozycji dla obu kanałów. Typowa szybkość akwizycji wynosi 3 sek.
      UWAGA: W zależności od fluoroforu, rodzaju znakowania i konfiguracji, czas ekspozycji różni się w przypadku innych systemów.
  2. C. elegans Zarodek
    UWAGA: W tym przykładzie użyto zarodków C. elegans o szerokości 25-30 μm i długości 50-55 μm. Zarodki hodowano zgodnie ze wskazaniami w 25. Prosty wizualny protokół manipulowania C. elegans można znaleźć w 26. Obserwację przeprowadzono przy użyciu mikroskopu z odwróconym kontrastem fazowym wyposażonego w obiektyw powietrzny 40X 0,55 NA.
    1. Przygotować powierzchnię "kubków na jajka" zgodnie z powyższym opisem i o średnicy 25 μm (zob. tabela 1). W takim przypadku powierzchnia nie musi być funkcjonalizowana białkami adhezyjnymi.
    2. Hodowla zarodków C. elegans w odpowiednich pożywkach hodowlanych (patrz Tabela 1).
    3. Umieścić zarodki w "kubeczkach na jajka" przez odwirowanie, jak opisano powyżej (patrz sekcja 2.6-2.12), używając ultraczystej wody jako pożywki hodowlanej.
      UWAGA: Embriony "zachowywały się" normalnie w ultraczystej wodzie przez cały czas trwania eksperymentu. Alternatywnie użyj fizjologicznego bufora M9 do długotrwałych eksperymentów.
    4. Przepłukać próbkę w sposób opisany powyżej (patrz sekcja 2.14). Umieść "kubki na jajka" w uchwycie mikroskopu. Wybierz obiektyw pneumatyczny 40X i ostrożnie ustaw ostrość. Otwórz oprogramowanie i dostosuj parametry. Wybierz szybkość akwizycji wynoszącą 3 sekundy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

'Jagokubki' (EC) to nowatorska metodologia badań przesiewowych o wysokiej zawartości, która pozwala na wizualizację zorientowanych komórek i zarodków w środowisku 3D. Dodatkowo, niektóre procesy komórkowe, które są trudne do zaobserwowania w standardowych (płaskich) hodowlach, można zaobserwować tą nową metodą. Rysunek 1a przedstawia podsumowanie procedury mikrowytwarzania WE (patrz również sekcja 1 w wyżej opisanym protokole). Metoda jest prosta, szybka, wydajna i nie wymaga specjalnego sprzętu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Do wytworzenia "kubków na jajka" użyto odlewania replik. Proces produkcji nie wymaga czystego pomieszczenia; Jest to łatwe i proste, chociaż może być wymagana pewna praktyka. W szczególności uwolnienie stempla PDMS jest najważniejszym krokiem w celu wyprodukowania dużej powierzchni wysokiej jakości "kubków na jajka". Z tego powodu należy zachować szczególną ostrożność na tym etapie. Jeśli ten krok wielokrotnie kończy się niepowodzeniem, należy rozważyć optymalizację parametrów czyszczenia plazmowego przed silanizacją i w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy L. Brino (IGBMC High Content Screening facility, Illkirch, Francja) za dostarczenie nam przeciwciała anty-Giantin, M. Labouesse Lab. Lab. dla C. elegans (IGBMC) i B. Séraphin Lab. dla pączkujących drożdży (IGBMC), E. Paluch i A. Hyman za fluorescencyjne komórki HeLa (MPI-CBG, Drezno), J. Moseley (Dartmouth Medical School) i J.Q. Wu (Ohio State University) za rozszczepienie komórek drożdży; A. Hoël i F. Evenou za pomoc eksperymentalną, C. Rick (IBMC, Strasburg, Francja) za pomoc techniczną oraz J.C. Jeannot (Femto-st, Francja) za pomoc w mikrowytwarzaniu. Prace te były wspierane przez fundusze CNRS, Uniwersytetu w Strasburgu, Conectus, La Fondation pour la Recherche Médicale oraz CI-FRC w Strasburgu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

2

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ddH20 (ultraczysty)Millipore-Używajzawsze świeżej wody.
Parafilm (folia z tworzywa sztucznego)BemisPM-999Przyklej Parafilm do stołu laboratoryjnego za pomocą kropelek wody i zapewnij idealną płaskość powierzchni.
Maska fotograficznaSelba-http://www.selba.ch
Wafel krzemowySiltronix-http://www.siltronix.com/
SU-8 fotorezystorMicroChem2000 serieshttp://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm 
praca w dygestorii jest wymagana; więcej informacji można znaleźć w karcie katalogowej producenta.
Programista SU-8MicroChem-http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm 
praca w oparach jest wymagana; więcej informacji
2-propanolSigma-Aldrich19030http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en& region=CA
Dostępne w wielu firmach.
Sigmacote (odczynnik silikonowy)Sigma-AldrichSL2-25MLa href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr& region=FR">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr& region=FR  szkodliwe
, wymagana jest praca w oparach; więcej informacji można znaleźć w karcie katalogowej producenta. 
Chlorotrimetylosilan (TMCS)Sigma-Aldrich386529-100MLhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr®ion=FR  
TMCS powoduje ostre wdychanie i toksyczność skórną, jest wysoce łatwopalny (z możliwością cofnięcia się zapłonu na znaczne odległości), dlatego powinien być używany w dygestorium z dala od źródeł zapłonu
Rękawice nitryloweKleenguard57372http://www.kcprofessional. com/products/PPE/rękawice-ręczne/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-niebieskie-rękawice-nitrylowe-m
Dostępne w wielu firmach.
Szkiełka nakrywkowe szklane #0Szkło KnittelKN00010022593http://www.knittelglass.com/index_e.htm
Bardzo kruche. Manipuluj delikatnie.
Pęseta prosta SharpSPI0WSSS-XDhttp://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7
tubka 50 mlBD Falcon352070http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp
Dostępne w wielu firmach.
PDMSDow CorningSylgard 184 zestawhttp://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx? R=131EN 
Opakowanie zawiera zarówno bazę PDMS, jak i utwardzacz. Podobne elastomery są dostępne w wielu firmach.
Szkiełka mikroskopoweDutscher100001http://www.dutscher.com/frontoffice/search
Dostępne w wielu firmach.
DMEM o wysokiej zawartości glukozyFisher Scientific41965-039http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search? LBCID=12301479& keyWord=41965-039& store=Naukowy& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD
Surowica cielęca bydlęcaSigma-AldrichC8056-500MLa href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en& region=CA">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en& region=CA
0.25% Trypsyna-EDTAFisher Scientific25200-072http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072& store=Naukowy& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD
PBS 1xFisher Scientific14200-067http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067& store=Naukowy& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD
PBS jest na poziomie 10x i powinien być rozcieńczony do 1x za pomocą ddH2O
L-15 mediumFisher Scientific21083-027http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027& store=Naukowy& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD
Medium dla atmosfer bez kontroli
Fibronektyna Sigma-AldrichF1141-5MGa href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& termin=F1141-5MG& lang=en& region=CA& focus=produkt& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=dopasowanie%20partialmax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& termin=F1141-5MG& lang=en& region=CA& focus=produkt& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax
Penicylina & StreptomycinFisher Scientific15140-122http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122& store=Naukowy& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=CHEM
szalka Petriego P35Greiner627102http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/
Petri szalka P60Greiner628163http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/
szalka Petriego P94Greiner633179http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/
Paraformaldehyd 3 %Sigma-AldrichP6148-500Ghttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr& region=FR 
Działa szkodliwie zwłaszcza na oczy, wymagana jest praca w oparach; więcej informacji można znaleźć w karcie katalogowej producenta.
Triton 0.5 %Sigma-Aldrich93443-100MLa href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& termin = 93443-100ML & lang=en& region=CA& focus=produkt& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=dopasowanie%20partialmax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& termin = 93443-100ML & lang=en& region=CA& focus=produkt& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax
Phallodin-Green Fluorescencyjny Alexa Fluor 488InVitrogenA12379http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379? CID=szukaj-a12379 
rozpuścić proszek w 1,5 ml metanolu
Alexa Fluor 647InVitrogenA21245rozcieńczenie 1:200 w PBS 1x
królik poliklonalny anty-GiantinAbcamab245861:500 rozcieńczenie w PBS
1xhttp://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html 
królik antyanilinaDzięki uprzejmości M. Glotzera, opublikowane w Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillina jest białkiem rusztowania, które łączy RhoA, aktynę i miozynę podczas cytokinezy. Aktualna biologia 18, 30– 6 (2008).Rozcieńczenie 1:500 w PBS 1x
Laboratorium transdukcjiantyfosfotyrozyny610000http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000
Cy3 kozia anty-królicza Jackson Immunoresearch111-166-047http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp 
1:1,000 rozcieńczenie w PBS 1x
DAPISigma-AldrichD8417 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr& region=FR 
1 mg/ml przez 1 min
GlycerolSigma-AldrichG2025http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& term=G2025& lang=en& region=CA& focus=produkt& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax
Olej mineralnySigma-AldrichM8410-500MLa href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& termin = M8410-500ML & lang=en& region=CA& focus=produkt& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=dopasowanie%20partialmax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& termin = M8410-500ML & lang=en& region=CA& focus=produkt& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax
Komórki HeLa- Komórki ssaków są dostępne w wielu firmach. Zobacz także Tabela 1
Komórki NIH3T3ATCC-Mammaliansą dostępne w wielu firmach. Zobacz również Tabela 1
Drożdże rozszczepienia --Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat szczepów, skontaktuj się z autorem korespondencyjnym.  Zobacz także Tabela 1
C. elegans robaki--Abyuzyskać szczegółowe informacje, skontaktuj się z autorem korespondencyjnym.  Zobacz także Tabela 1
YES (Agar) + 5 Suplementy w zestawieMP Biomedicals4101-732http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732& s=Szukaj 
Przygotowanie: postępuj zgodnie z instrukcjami podanymi na pudełku
TAK (Media) + 5 Suplementy w zestawieMP Biomedicals4101-522http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522& s=Szukaj 
Przygotowanie: postępuj zgodnie z instrukcjami podanymi na pudełku
EMM (Media)MP Biomedicals4110-012http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012& s=Szukaj 
Do przygotowania: postępuj zgodnie z instrukcjami podanymi na pudełku
Filtr sterylizowany EMM (Media) - Tylko do obrazowaniaMP Biomedicals4110-012Przygotowanie: postępuj zgodnie z instrukcjami podanymi na pudełku. Filtruj sterylizację mediów za pomocą 0,22 &mikro; m zamiast autoklawowania. Daje to przezroczystość mediów i zmniejsza autofluorescencję.
Suplementy (dla EMM)MP Biomedicals4104-012http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012& s=Szukaj
 ( Dodać 225 mg/L do pożywki EMM przed autoklawowaniem lub filtrowaniem)
Stericup i Steritop Sterylne filtry sterowane próżniąMillipore-http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare& tab1=2& tab2=1#tab2=1:tab1=2
można znaleźć w karcie katalogowej producenta<<CO<<<

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
  2. Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Thery, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab Chip. 9, 1640-1642 (2009).
  3. Mandal, K., Balland, M., Bureau, L. Thermoresponsive Micropatterned Substrates for Single Cell Studies. PLoS ONE. 7, e37548(2012).
  4. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
  5. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. , (2012).
  6. Ghibaudo, M., Di Meglio, J. M., Hersen, P., Ladoux, B. Mechanics of cell spreading within 3D-micropatterned environments. Lab Chip. 11, 805-812 (2010).
  7. Greiner, A. M., Richter, B., Bastmeyer, M. Micro-Engineered 3D Scaffolds for Cell Culture Studies. Macromol Biosci. 12, 1301-1314 (2012).
  8. Khetan, S., et al. Degradation-mediated cellular traction directs stem cell fate in covalently crosslinked three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 12, 458-465 (2013).
  9. Legant, W. R., et al. Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices. Nat Meth. 7, 969-971 (2010).
  10. Devices and methods for observing the cell division. , WO/2010/092116 (2010).
  11. Ochsner, M., et al. Micro-well arrays for 3D shape control and high resolution analysis of single cells. Lab Chip. 7, 1074-1077 (2007).
  12. Devices and methods for observing cells with cell wall or invertebrate embryos with oblong eggshell . , WO2013144302 (2012).
  13. Devices and methods for observing eukaryotic cells without cell wall. , WO2013135809 (2012).
  14. Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotech. 28, 237-245 (2010).
  15. Wolfe, D., Qin, D., Whitesides, G. Microengineering in Biotechnology, Ch 3. Methods in Molecular Biology. Hughes, M. P., Hoettges, K. F. 583, Humana Press. 81-107 (2010).
  16. Mehling, M., Tay, S. Microfluidic cell culture. Curr Op Biotech. 25, 95-102 (2014).
  17. Wollrab, V., Thiagarajan, R., Wald, A., Kruse, K., Riveline, D. Still and rotating myosin clusters determine cytokinetic ring constriction. Nat Commun. 7, 11860-11869 (2016).
  18. Yao, X., et al. Functional analysis of single cells identifies a rare subset of circulating tumor cells with malignant traits. Integr Biol. 6, 388-398 (2014).
  19. Eberwine, J., Sul, J. Y., Bartfai, T., Kim, J. The promise of single-cell sequencing. Nat Meth. 11, 25-27 (2014).
  20. Allen, T. D., et al. Generation of cell-free extracts of Xenopus eggs and demembranated sperm chromatin for the assembly and isolation of in vitro-formed nuclei for Western blotting and scanning electron microscopy (SEM). Nat. Protocols. 2, 1173-1179 (2007).
  21. Robbins, E., Marcus, P. I. Mitotically Synchronized Mammalian Cells: a Simple Method for Obtaining Large Populations. Science. 144, (1964).
  22. Whitfield, M. L., et al. Stem-loop binding protein, the protein that binds the 3" end of histone mRNA, is cell cycle regulated by both translational and posttranslational mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 20, (2000).
  23. Straight, A. F., et al. Dissecting Temporal and Spatial Control of Cytokinesis with a Myosin II Inhibitor. Science. 299, 1743-1747 (2003).
  24. Tang, J., Erikson, R. L., Liu, X. Checkpoint kinase 1 (Chk1) is required for mitotic progression through negative regulation of polo-like kinase 1 (Plk1). Proc Natl Acad Sci. 103, 11964-11969 (2006).
  25. Zahreddine, H., Zhang, H., Diogon, M., Nagamatsu, Y., Labouesse, M. CRT-1/Calreticulin and the E3 Ligase EEL-1/HUWE1 Control Hemidesmosome Maturation in C. elegans Development. Curr Biol. 20, 322-327 (2010).
  26. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. JoVE. , e4019(2012).
  27. Saha, S., Pollard, T. D. Anillin-related protein Mid1p coordinates the assembly of the cytokinetic contractile ring in fission yeast. Mol Biol Cell. 23, 3982-3992 (2012).
  28. Prestwich, G. D. Evaluating Drug Efficacy and Toxicology in Three Dimensions: Using Synthetic Extracellular Matrices in Drug Discovery. Acc Chem Res. 41, 139-148 (2007).
  29. Futamura, Y., et al. Morphobase, an Encyclopedic Cell Morphology Database, and Its Use for Drug Target Identification. Chem Biol. 19, 1620-1630 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tr jwymiarowa hodowla kom rekmacierz mikrown kodlewanie z replikPDMS owe uchwyty w kszta cie jajekpozycjonowanie kom rekwizualizacja organellizamykanie pier cienia cytokinetycznegodro d e rozszczepiaj ce simedycyna personalizowana

Powiązane artykuły