Prezentujemy system hodowli erytroblastów wątroby in in vitro u myszy płodowej, który analizuje wczesne i późne stadia końcowej erytropoezy. System ten ułatwia analizę funkcjonalną określonych genów na różnych etapach rozwoju.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
System hodowli wątroby płodu myszy do analizy funkcji genów docelowych we wczesnych i późnych stadiach erytropoezy terminalnej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Erytropoeza obejmuje dynamiczny proces, który rozpoczyna się od zaangażowanych jednostek tworzących erytroidalne pęknięcia (BFU-Es), po których następują szybko dzielące się jednostki tworzące erytroidalne kolonie (CFU-Es). Po CFU-E komórki są morfologicznie rozpoznawalne i ogólnie nazywane końcowymi erytroblastami. Jednym z wyzwań stojących przed badaniami nad nieuleczalną erytropoezą jest brak eksperymentalnych podejść do chronologicznej analizy funkcji genów. W tym protokole opisujemy unikalną strategię określania funkcji genów we wczesnych i późnych stadiach terminalnej erytropoezy. W tym systemie ujemne erytroblasty wątroby płodu myszy TER119 (marker dojrzałych komórek erytroidalnych) zostały oczyszczone i transdukowane egzogenną ekspresją cDNA lub małych RNA spinki do włosów (shRNA) dla genów będących przedmiotem zainteresowania. Komórki były następnie hodowane w pożywce zawierającej czynniki wzrostu inne niż erytropoetyna (Epo), aby utrzymać stan progenitorowy przez 12 godzin, umożliwiając ekspresję egzogennych cDNA lub shRNA. Po 12 godzinach komórki zmieniono na pożywkę Epo w celu wywołania różnicowania i proliferacji komórek, podczas gdy egzogenny materiał genetyczny był już eksprymowany. Protokół ten ułatwia analizę funkcji genów we wczesnym stadium końcowej erytropoezy. Aby zbadać późne stadium końcowej erytropoezy, komórki natychmiast hodowano w pożywce Epo po transdukcji. W ten sposób komórki były już zróżnicowane do późnego stadium końcowej erytropoezy, kiedy transdukowany materiał genetyczny uległ ekspresji. Zalecamy ogólne zastosowanie tej strategii, które pomogłoby zrozumieć szczegółowe funkcje genów w różnych stadiach końcowej erytropoezy.
Wprowadzenie
Erytropoeza to proces różnicowania się multipotencjalnych hematopoetycznych komórek macierzystych do dojrzałych erytrocytów. Ten etapowy proces obejmuje tworzenie zaangażowanych jednostek tworzących pęknięcia erytroidalne (BFU-Es), szybko dzielących się jednostek tworzących kolonie erytroidalne (CFU-Es) i morfologicznie rozpoznawalnych erytroblastów1,2. Końcowa erytropoeza z komórek progenitorowych CFU-E obejmuje sekwencyjne i niezależne stadia zależne od erytropoetyny2,3. We wczesnym stadium końcowej erytropoezy erytropoetyna (Epo) wiąże się ze swoim receptorem na powierzchni komórki i indukuje szereg dalszych szlaków sygnałowych, które zapobiegają apoptozie komórek i sprzyjają szybkim podziałom komórek i ekspresji genów1,4. W późnym stadium końcowej erytropoezy erytroblasty przechodzą końcowe wyjście z cyklu komórkowego, kondensację chromatyny i jądra oraz ekstruzję silnie skondensowanych jąder5.
Nasze zrozumienie erytropoezy terminalnej znacznie się poprawiło w ciągu ostatnich kilku dekad, co jest w dużej mierze zasługą udanego wykorzystania kilku modeli myszy in vitro i in vivo 6-9. Wśród tych modeli, hodowla in vitro erytroblastów wątroby płodu myszy zapewnia wiele korzyści, w tym łatwość oczyszczania komórek, szybką proliferację i różnicowanie oraz bliższe naśladowanie erytropoezy ludzkiej10,11. W tym systemie dużą liczbę erytroidalnych komórek progenitorowych z wątroby płodu myszy można łatwo wyizolować poprzez jednoetapowe oczyszczanie ujemnych erytroblastów TER119 (marker dojrzałych komórek erytroidalnych). Podczas dwudniowej hodowli erytroblastów różnicowanie tych komórek można monitorować za pomocą analizy cytometrii przepływowej opartej na ekspresji powierzchniowej receptora transferyny (CD71) i antygenuTER119 12. Ponadto, wyłuszczenie erytroblastów różnicujących się ostatecznie może być wykryte przez wytwórcę DNA (Hoechst 33342)13. Co więcej, oczyszczone komórki progenitorowe mogą być genetycznie modyfikowane przez egzogenną ekspresję cDNA lub małych RNA spinki do włosów (shRNA) dla genów będących przedmiotem zainteresowania, co ułatwia mechanistyczne badania funkcji ekspresji genów w erytropoezie11,13,14.
Z drugiej strony, szybkie tempo wzrostu komórek może być mieczem obosiecznym, ponieważ trudno jest scharakteryzować funkcje genów w różnych stadiach końcowej erytropoezy. W większości przypadków trudno jest określić, czy określony gen funkcjonuje we wczesnym stadium końcowej erytropoezy, ponieważ do czasu ekspresji cDNA lub shRNA komórki przeszły już wczesny etap. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy unikalny system do analizy wczesnych i późnych stadiów końcowej erytropoezy. We wczesnym stadium końcowej erytropoezy genetycznie zmodyfikowane erytroblasty ujemne TER119 hodowano w pożywce wolnej od Epo, ale zawierającej czynnik komórek macierzystych (SCF), ligand IL-6 i FLT3, aby utrzymać ich status progenitorowy i umożliwić ekspresję transdukowanych cDNA lub shRNA13. Po 12 godzinach komórki zmieniono na pożywkę zawierającą Epo w celu indukowania proliferacji i różnicowania komórek. W ten sposób, gdy komórki zaczęły się różnicować, transdukowane cDNA lub shRNA były już wyrażane. W późnym stadium końcowej erytropoezy erytroblasty ujemne TER119 hodowano w pożywce zawierającej Epo natychmiast po transdukcji. W związku z tym można analizować funkcje interesujących genów w późnym stadium końcowej erytropoezy. Podsumowując, szerokie zastosowanie tego systemu pomogłoby w analizie funkcji genów na różnych etapach końcowej erytropoezy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Eksperymenty opisane w tym protokole zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami określonymi przez Northwestern University Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Przygotowanie pożywki hodowlanej
- Przygotuj roztwór fibronektyny. Dodać 1 ml wody do jednej fiolki ludzkiej fibronektyny (1 mg). Pozostawić roztwór w kapturze do hodowli tkankowej na 30 minut bez mieszania. Przenieść cały płyn do 50 ml PBS, aby uzyskać końcowe stężenie 20 μg/ml i delikatnie wymieszać. Przygotuj świeży roztwór fibronektyny przed pokryciem płytki (patrz poniżej).
- Przygotuj 50 ml pożywki wolnej od Epo (pożywki SCF). Połączyć składniki wymienione w Tabeli 1. Pożywka może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc, jeśli jest świeża.
- Przygotować 50 ml pożywki zawierającej Epo. Połączyć składniki wymienione w Tabeli 2. Pożywka może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc, jeśli jest świeża.
2. Płytka pokryta fibronektyną
- Dodać 1 ml roztworu fibronektyny do każdego dołka płytki 6-dołkowej (lub 0,5 ml do każdego dołka płytki 12-dołkowej). Pozostawić płytkę w kapturze do hodowli tkankowej na 1 godzinę.
- Dwukrotnie przepłukać studzienki sterylną wodą i wysuszyć płytkę na powietrzu.
- Zawiń talerz i przechowuj w chłodni w temperaturze 4 °C.
3. Oczyszczanie erytroblastów wątroby płodu
UWAGA: Użyj wątroby płodowej od E13 do E15 ciężarnych myszy (C57BL/6). Wątroby E13.5 są preferowane w celu maksymalizacji wydajności komórek progenitorowych CFU-E. Aby uzyskać ciężarne myszy w czasie, 6 do 8 tygodni samce i samice myszy umieszczono w jednej klatce (zwykle jeden samiec z jedną lub dwiema samicami). Żeńskie zatyczki dopochwowe zostały sprawdzone następnego ranka, aby ustalić, czy krycie zakończyło się sukcesem. Pierwszy dzień ciąży przypadał na dzień po znalezieniu zatyczki.
- Przygotowanie całkowitej liczby komórek wątroby płodu
- Poświęć mysz przez wdychanie CO2 i zwichnięcie szyjki macicy. Spryskaj brzuch 70% etanolem w celu dezynfekcji. Otwórz brzuch nożyczkami preparacyjnymi, aby usunąć macicę. Umyj macicę w 1x PBS.
- Wypreparuj płody w sterylnych warunkach za pomocą kaptura do hodowli tkanek i autoklawowanych narzędzi i umyj w 1x PBS.
- Wypreparuj wątrobę płodu od płodów. Przytrzymaj ciało płodu jednym kleszczem, delikatnie odciągnij wątrobę płodu (koloru różowego) od ciała za pomocą innych kleszczy. Oczyść wątrobę płodu kleszczami, aby usunąć powiązane tkanki zwłóknieniowe. Umieść wszystkie wątroby płodowe w świeżym 1x PBS zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej.
- Mechanicznie zakłócaj pracę wątroby płodu poprzez pipetowanie w górę iw dół.
- Przefiltrować zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 40 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Granulować komórki w temperaturze 800 x g przez 5 minut.
- Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml PBS z 10% FBS (około 8 E13,5 wątroby płodu na ml).
- Oczyszczanie erytroblastów ujemnych TER119
- Zablokuj komórki szczurzymi IgG (0,2 mg/ml) na lodzie przez 15 minut.
- Bez mycia lub odwirowywania dodać biotynylowane przeciwciało anty-TER119 do zawiesiny komórkowej (1 μg/ml). Inkubować przez 15 minut na lodzie.
- Przemyć 1x PBS z 10% FBS (1:10) i odwirować przy 800 x g przez 5 min. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml PBS z 10% FBS.
- Dodać 75 μl streptawidyny sprzężonej z cząstkami magnetycznymi i inkubować przez 10 minut na lodzie.
- Dodać objętość do 2,5 ml z PBS zawierającym 10% FBS. Przenieść zawiesinę komórek do probówki z okrągłym dnem o pojemności 5 ml z polipropylenu.
- Włóż probówkę do magnetycznego aparatu do sortowania komórek i inkubuj przez 10 minut. Dodatnie komórki TER119 przyczepią się do boku probówki. Nieprzyłączone erytroblasty ujemne TER119 pozostaną w zawiesinie.
- Wlać zawiesinę komórkową do nowej probówki z okrągłym dnem o pojemności 5 ml z polipropylenu.
- Powtórzyć kroki 3.2.6 i 3.2.7, aby usunąć pozostałe komórki dodatnie TER119.
- Osadzać komórki w masie 800 x g przez 5 minut. Odessać supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml PBS zawierającym 10% FBS i policzyć żywe komórki za pomocą błękitu trypanowego.
4. Transdukcja za pomocą wirusów kodujących cDNA lub shRNA
- Umieść oczyszczone ujemne komórki wątroby płodu TER119 w dołku 3-5 x10 5 / dołek na 12-dołkowej płytce pokrytej fibronektyną (dostosuj liczbę komórek, jeśli używasz innej płytki).
- Dodać polibren do końcowego stężenia 10 μg/ml, aby ułatwić transdukcję wirusa. Spin infekuje komórki lentiwirusami lub retrowirusami, kodującymi cDNA lub shRNA, w temperaturze 800 x g przez 1-1,5 godziny w temperaturze 37 °C.
5. Hodowla transdukowanych TER119 ujemnych erytroblastów wątroby płodu myszy
- Badanie funkcji genów we wczesnym stadium końcowej erytropoezy (ryc. 1 linie przerywane).
- Hoduj transdukowane komórki w pożywce wolnej od Epo (pożywce SCF) przez 12 godzin, aby umożliwić ekspresję transdukowanych genów i utrzymanie stanu progenitorowego.
- Odwirować komórki przy sile 800 x g przez 5 minut. Odessać supernatant. Zawiesić komórki w 1 ml pożywki zawierającej Epo w każdym dołku 12-dołkowej płytki.
- Po hodowli przez 24 lub 48 godzin należy pobrać komórki do dalszych testów.
- Testowe funkcje genów w późnym stadium końcowej erytropoezy (ryc. 1 linie ciągłe).
- Wyhodować transdukowane komórki natychmiast w pożywce zawierającej Epo.
- Po hodowli przez 24 lub 48 godzin należy pobrać komórki do dalszych testów.
6. Barwienie hodowanych komórek wątroby płodu do analizy cytometrycznej przepływowej
- Umyj i ponownie zawieś ogniwa w 1x PBS. Zbierz 2 x 105 hodowanych komórek do analizy cytometrii przepływowej.
- Inkubować komórki z przeciwciałami sprzężonymi z fluoroforem przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Aby przetestować różnicowanie, użyj sprzężonego APC anty-CD71 i sprzężonego PE anty-TER119. Aby przetestować enukleację, użyj barwnika Hoechst 33342 oprócz innych przeciwciał.
- Umyj komórki 1x PBS. Zawiesić komórki w 0,5 ml PBS zawierającym 1% FBS i jodku propydyny (PI) (1 μg/ml) w celu wybarwienia martwych komórek i wykluczenia ich z analizy.
- Przeprowadź analizę cytrometrii przepływowej. Najpierw przeanalizuj jednokolorowe i niebarwione komórki kontrolne w celu regulacji i kompensacji cytometru przepływowego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rysunek 1 przedstawia strategie eksperymentalne. Protokół obejmuje dwa niezależne warianty ukierunkowane na badanie funkcji cząsteczek sygnałowych we wczesnych i późnych etapach terminalnej erytropoezy. Eroblasty wątroby płodowej negatywne pod kątem TER119 zostały oczyszczone z płodu myszy w stadium E13.5. Analiza cytometryczna komórek erytroidalnych wątroby płodowej przed i po oczyszczaniu wykazała wysoką wydajność procesu oczyszczania (Rysunki 2A i 2B). W przypadku wcz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Tutaj przedstawiamy unikalny system do chronologicznej analizy erytropoezy terminalnej wątroby u płodu myszy. Dzięki zastosowaniu różnych warunków hodowli udało nam się wypreparować końcową erytropoezę we wczesnych i późnych stadiach. Jest to szczególnie ważne dla określenia mechanizmów genów o wielorakich funkcjach. Na przykład GTPazy Rac odgrywają ważną rolę w różnych etapach końcowej erytropoezy. Hamowanie GTPaz Rac we wczesnym stadium końcowej erytropoezy wpływa na różnicowanie i proliferację komórek. Z drugiej stron...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez NIH R00HL102154, a P Ji otrzymał nagrodę naukową Amerykańskiego Towarzystwa Hematologicznego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zmodyfikowane medium Dulbecco firmy IscoIMDM (IMDM) | Gibco | 12440-053 | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | GEMINI Bio-produkt | 700-102P | |
| Roztwór penicyliny-streptomycyny | Hyclon | SV30010 | 100x |
| Hyklon L-glutaminy | SH30034.01 | 200 mM | |
| Mysi ligand FIT3 (Flt-3L) | BD Biosciences | 14-8001-80 | |
| Mysia rekombinowana interleukina-6 (IL-6) | GEMINI Bio-produkt | 300-327P | |
| Fibronektyna | BD Biosciences | ||
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | STEMCELL TECH | 9300 | 10% zapasu w IMDM |
| Erytropoetyna(Epo) | PROCRIT | NOC 59676-303-00 | Zapas 3,000 U/ml Cząstki |
| Streptawidyny Plus | BD Pharmingen | 557812 | |
| Magnes EasySep | STEMCELL TECH | 18000 | |
| Probówka okrągłodenna z polipropylenu, 5 ml | FALCON |
Bibliografia
- Hattangadi, S. M., Wong, P., Zhang, L., Flygare, J., Lodish, H. F. From stem cell to red cell: regulation of erythropoiesis at multiple levels by multiple proteins, RNAs, and chromatin modifications. Blood. 118 (24), 6258-6268 (2011).
- Richmond, T. D., Chohan, M., Barber, D. L. Turning cells red: signal transduction mediated by erythropoietin. Trends in cell biology. 15 (3), 146-155 (2005).
- Eshghi, S., Vogelezang, M. G., Hynes, R. O., Griffith, L. G., Lodish, H. F. Alpha4beta1 integrin and erythropoietin mediate temporally distinct steps in erythropoiesis: integrins in red cell development. The Journal of cell biology. 177 (5), 871-880 (2007).
- Koury, M. J., Bondurant, M. C. Maintenance by erythropoietin of viability and maturation of murine erythroid precursor cells. Journal of cellular physiology. 137 (1), 65-74 (1988).
- Ji, P., Yeh, V., Ramirez, T., Murata-Hori, M., Lodish, H. F. Histone deacetylase 2 is required for chromatin condensation and subsequent enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts. Haematologica. 95 (12), 2013-2021 (2010).
- Dumitriu, B., et al. Sox6 cell-autonomously stimulates erythroid cell survival, proliferation, and terminal maturation and is thereby an important enhancer of definitive erythropoiesis during mouse development. Blood. 108 (4), 1198-1207 (2006).
- Rector, K., Liu, Y., Van Zant, G. Comprehensive hematopoietic stem cell isolation methods. Methods in molecular biology. 976, 1-15 (2013).
- Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell characterization and isolation. Methods in molecular biology. 750, 47-59 (2011).
- Choi, H. S., Lee, E. M., Kim, H. O., Park, M. I., Baek, E. J. Autonomous control of terminal erythropoiesis via physical interactions among erythroid cells. Stem cell research. 10 (3), 442-453 (2013).
- Bhatia, H., et al. Short-chain fatty acid-mediated effects on erythropoiesis in primary definitive erythroid cells. Blood. 113 (25), 6440-6448 (2009).
- Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system. Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).
- Socolovsky, M., et al. Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts. Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).
- Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2. Nature cell biology. 10 (3), 314-321 (2008).
- Chida, D., Miura, O., Yoshimura, A., Miyajima, A. Role of cytokine signaling molecules in erythroid differentiation of mouse fetal liver hematopoietic cells: functional analysis of signaling molecules by retrovirus-mediated expression. Blood. 93 (5), 1567-1578 (1999).
- Patel, V. P., Lodish, H. F. A fibronectin matrix is required for differentiation of murine erythroleukemia cells into reticulocytes. The Journal of cell biology. 105 (6 Pt 2), 3105-3118 (1987).
- Udupa, K. B., Lipschitz, D. A. Endotoxin-induced suppression of erythropoiesis: the role of erythropoietin and a heme synthesis stimulating factor. Blood. 59 (6), 1267-1271 (1982).
- Koury, M. J., Sawyer, S. T., Brandt, S. J. New insights into erythropoiesis. Current opinion in hematology. 9 (2), 93-100 (2002).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
