Opisujemy tutaj ulepszoną metodę transferu energii rezonansu luminescencji (LRET), w której wprowadzamy miejsce rozszczepienia proteazy między miejscem fluoroforu dawcy i akceptora. Modyfikacja ta pozwala na uzyskanie specyficznych sygnałów LRET pochodzących z interesujących nas białek błonowych, co pozwala na badanie białek błonowych bez oczyszczania białek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Transfer energii rezonansu luminescencyjnego w celu zbadania zmian konformacyjnych w białkach błonowych ulegających ekspresji w komórkach ssaków
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rezonans luminescencji (LRET) to potężna technika używana do pomiaru odległości między dwoma miejscami w białkach w zakresie odległości 10-100 A. Mierząc odległości w różnych warunkach ligacji, można łatwo ocenić zmiany konformacyjne białka. W przypadku LRET, lantanowiec, najczęściej chelatowany terb, jest używany jako fluorofor donorowy, co zapewnia korzyści, takie jak dłuższy czas trwania emisji tylko dla donora, elastyczność w stosowaniu wielu fluoroforów akceptorowych oraz możliwość wykrywania uczulonej emisji akceptora jako łatwego sposobu pomiaru transferu energii bez ryzyka wykrycia sygnału tylko od dawcy. W tym miejscu opisujemy metodę stosowania LRET na białkach błonowych wyrażanych i oznaczanych na powierzchni nienaruszonych komórek ssaków. Wprowadzamy miejsce rozszczepienia proteazy między parą fluoroforów LRET. Po uzyskaniu oryginalnego sygnału LRET, rozszczepienie w tym miejscu usuwa specyficzny sygnał LRET z białka będącego przedmiotem zainteresowania, co pozwala nam ilościowo odjąć sygnał tła, który pozostaje po rozszczepieniu. Metoda ta pozwala na wykonanie bardziej istotnych fizjologicznie pomiarów bez konieczności oczyszczania białka.
Wprowadzenie
Luminescencyjny Rezonansowy Transfer Energii (LRET) jest pochodną powszechnie znanej techniki Fluorescencyjnego Rezonansowego Transferu Energii (FRET)1. Podobnie jak FRET, LRET może być wykorzystywany do pomiaru odległości oraz zmian odległości pomiędzy fluoroforami donorem i akceptorem, przyłączonymi do specyficznych miejsc w badanym białku, w zakresie od 10-100 Å1-3. Zasady LRET są również podobne do FRET w tym sensie, że rezonansowy transfer energii zachodzi pomiędzy dwoma blisko położonymi fluoroforami, gdy widmo emisji fluoroforu donora pokrywa się z widmem absorpcji fluoroforu akceptora. Efektywność tego transferu jest powiązana z odległośc....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Tworzenie konstruktu zawierającego białko docelowe
Sklonuj gen kodujący interesujące białko do odpowiedniego wektora. Użyj wektorów takich jak seria pcDNA lub pRK5, ponieważ są one dobrze dostosowane do ekspresji w systemach ssaczych, takich jak komórki HEK293 i CHO.
2. Wybór miejsc w białku, które zostaną oznakowane fluoroforami
- Wybierz miejsca znakowania, które są w stanie odzwierciedlić możliwe zmiany konformacyjne w obrębie białka. Jeśli to możliwe, wykorzystaj strukturę krystaliczną białka lub białka homologicznego, aby ułatwić dokonanie tego wyboru. W przypadku braku dostępnej struktury krystal....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Prawidłowy pomiar LRET z wykorzystaniem donora lantanowcowego powinien wykazać czas życia samego donora w zakresie milisekund. Czas życia uwrażliwionej emisji LRET dla białka znakowanego zarówno donorem, jak i akceptorem będzie wyraźnie krótszy i wyniesie od kilku do kilkudziesięciu mikrosekund po odjęciu tła Rycina 3. Cięcie proteolityczne skutkuje zwiększeniem czasu życia, który z czasem powinien ulec stabilizacji (tj. przestać się zmieniać), co wskazuje na zakończenie procesu cięcia przez pro.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
LRET to potężna technika, która pozwala naukowcom mierzyć odległości między domenami w pojedynczym białku, a także między podjednostkami w białku multimerycznym. W związku z tym LRET doskonale nadaje się do badania zmian konformacyjnych i dynamiki białek lub innych makrocząsteczek. Powyższy protokół powinien pozwolić odpowiednio wyposażonemu laboratorium na łatwe przetestowanie swoich hipotez; Istnieje jednak wiele powszechnych źródeł błędów, które mogą nękać nowego badacza. Jeśli sygnał LRET jest słaby lub nie jest wido.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health Grant GM094246, American Heart Association Grant 11GRNT7890004 oraz National Science Foundation Grant MCB-1110501.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| LanthaScreen Tiol Reaktywny Chelat Tb | Technologie Życia | PV3579 | |
| Akceptor fluorofor-fluorescein-5-maleimidowy | Life Technologies | F-150 | Wybór akceptora zależy od konkretnego eksperymentu |
| Akceptor fluorofor-Alexa Fluor 488 C5 Maleimide | Life Technologies | A-10254 | Wybór akceptora zależy od konkretnego eksperymentu |
| Akceptor fluorofor-Alexa Fluor 555 C2 Maleimide | Life Technologies | A-20346 | Wybór akceptora zależy od konkretnego eksperymentu |
| Akceptor fluorofor-Alexa Fluor 594 C5 Maleimide | Life Technologies | A-10256 | Wybór akceptora zależy od konkretnego eksperymentu |
| Akceptor fluorofor-Alexa Fluor 680 C2 Maleimide | Life Technologies | A-20344 | Wybór akceptora zależy od konkretnego eksperymentu |
| QuantaMaster 3-SS | Photon Technology | powinien mieć wzbudzenie impulsowe z możliwością pomiaru czasu życia w zakresie milisekund | |
| FluoreScan 2.0 | Photon Technology International | Data Acquisition Software używane w manuskrypcie. Oprogramowanie dostarczane z instrumentem fluorescencyjnym | |
| Origin 8.6 | OriginLab | Origin to oprogramowanie do analizy danych używane w protokole. Może korzystać z innego podobnego oprogramowania do analizy danych | |
| Kuweta kwarcowa | Starna Cells, Inc | 3-Q-10 | |
| Mieszadło | Bel-Art Products | F37119-0007 | Stosowany w kuwecie do utrzymywania komórek w zawiesinie. Można użyć dowolnego mieszadła, które pasuje do kuwety |
Bibliografia
- Selvin, P. R. Principles and biophysical applications of lanthanide-based probes. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31, 275-302 (2002).
- Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer:....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
