Artykuł metodologiczny

Obrazowanie w czasie rzeczywistym transportu aksonalnego BDNF znakowanego kropkami kwantowymi w neuronach pierwotnych

DOI:

10.3791/51899

⸱

15 września 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosciences, University of California, San Diego, 2School of Biomedical Engineering and Med-X Research Institute, Shanghai Jiao Tong University, 3Department of Anesthesiology, University of California, San Diego, 4VA San Diego Healthcare System

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Axonalny transport BDNF, czynnika neurotroficznego, jest krytyczny dla przetrwania i funkcjonowania kilku populacji neuronów. Niektóre zaburzenia zwyrodnieniowe charakteryzują się zaburzeniem struktury i funkcji aksonów. Zademonstrowaliśmy techniki stosowane do badania żywego transportu QD-BDNF w komorach mikroprzepływowych przy użyciu neuronów pierwotnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BDNF odgrywa ważną rolę w wielu aspektach przetrwania, różnicowania i funkcjonowania neuronów. Strukturalne i funkcjonalne deficyty aksonów są coraz częściej postrzegane jako wczesna cecha chorób neurodegeneracyjnych, w tym choroby Alzheimera (AD) i choroby Huntingtona (HD). Jak dotąd nie jest jasne, jaki jest mechanizm (mechanizmy), za pomocą którego wywoływane jest uszkodzenie aksonów. Informowaliśmy o opracowaniu nowej techniki wytwarzania biologicznie aktywnego, monobiotynylowanego BDNF (mBtBDNF), który można wykorzystać do śledzenia transportu aksonalnego BDNF. BDNF (QD-BDNF) znakowany kropką kwantową został wytworzony przez sprzężenie kropki kwantowej 655 z mBtBDNF. Urządzenie mikroprzepływowe wykorzystano do wyizolowania aksonów z ciał komórek neuronów. Dodanie QD-BDNF do przedziału aksonalnego umożliwiło obrazowanie na żywo transportu BDNF w aksonach. Wykazaliśmy, że QD-BDNF poruszał się zasadniczo wyłącznie wstecz, z bardzo nielicznymi przerwami, z prędkością ruchu około 1,06 μm / s. System ten może być wykorzystany do badania mechanizmów zaburzonej funkcji aksonów w chorobie Alzheimera lub HD, a także innych zaburzeń zwyrodnieniowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurony to wysoce spolaryzowane komórki, których długie i często bardzo skomplikowane procesy są fundamentalne dla ustanowienia i utrzymania struktury i funkcji obwodów neuronowych. Akson odgrywa istotną rolę w przenoszeniu ładunków do i z synaps. Białka i organelle syntetyzowane w somie komórki muszą być transportowane przez aksony, aby dotrzeć do zakończenia presynaptycznego w celu wsparcia funkcji neuronalnych. W związku z tym sygnały odbierane w dystalnych aksonach muszą być transdukowane i przekazywane do somy. Procesy te są niezbędne do przetrwania, różnicowania i utrzymania neuronów. Ponieważ transport aksonalny w niektórych neuronach musi odbywać się na odległość ponad 1000 razy większą niż średnica ciała komórki, łatwo można sobie wyobrazić, że nawet niewielkie deficyty mogą znacząco wpłynąć na funkcjonowanie neuronów i obwodów.

Neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego (BDNF), członek rodziny neurotrofin, jest obecny w wielu obszarach mózgu, w tym w hipokampie, korze mózgowej i podstawie przodomózgowia. BDNF odgrywa kluczową rolę w tworzeniu funkcji poznawczych i pamięci, wspierając przetrwanie, różnicowanie i funkcję neuronów uczestniczących w obwodach poznawczych. BDNF wiąże się ze swoim receptorem, kinazą tyrozynową TrkB, na końcu aksonu, gdzie aktywuje szlaki sygnałowe, w których pośredniczy TrkB, w tym kinazę białkową aktywowaną mitogenem / zewnątrzkomórkową kinazę białkową regulowaną sygnałem (MAPK / ERK), kinazę fosfatydyloinozytolo-3 (PI3K) i fosfolipazę C-gamma (PLCγ). Białka, które uczestniczą w tych szlakach sygnałowych, są upakowane w endocytarnych strukturach pęcherzykowych, tworząc endosom sygnalizacyjny BDNF / TrkB1-6, który jest następnie transportowany wstecznie do somy neuronalnej.

Komora hodowli mikroprzepływowej jest bardzo użyteczną platformą do badania biologii aksonów w normalnych warunkach, jak również w warunkach urazów i chorób7,8. Izolując aksony od ciał komórkowych, urządzenie pozwoliło na zbadanie transportu w aksonach8-10. Platformy mikroprzepływowe oparte na PDMS z barierami mikrorowkowymi 450 μm użyte w tym badaniu zostały zakupione komercyjnie (patrz tabela materiałów). Aby zbadać transport BDNF, opracowaliśmy nowatorską technologię produkcji monobiotynylowanego BDNF (mBtBDNF). Skorzystaliśmy z peptydu akceptora biotyny, AP (znanego również jako AviTag). Jest to sekwencja 15 aminokwasów, która zawiera resztę lizyny, która może być specyficznie ligowana do biotyny przez enzym Escherichia coli ligazę biotyny, BirA. Połączyliśmy AviTag z C-końcem mysiego cDNA pre-pro-BDNF metodą PCR (Figura 1A). Konstrukt został sklonowany do wektora ekspresji ssaków, wektora pcDNA3.1 myc-his. Sklonowaliśmy również bakteryjne DNA BirA do wektora pcDNA3.1 myc-his. Dwa plazmidy były przejściowo kotransfekowane do komórek HEK293FT celu ekspresji obu białek. BirA katalizował ligację biotyny specyficznie do lizyny znajdującej się w AviTag na C-końcu BDNF w stosunku 1:1 w celu wytworzenia monobiotynylowanego monomeru BDNF. Biotynylowany, dojrzały BDNF o masie cząsteczkowej ~18 kDa odzyskano i oczyszczono z pożywki za pomocą żywicy Ni (ryc. 1C). Biotynylacja BDNF była całkowita, co oceniano na podstawie niemożności wykrycia niezmodyfikowanego BDNF za pomocą immunoblottingu (Figura 1D). Sprzężone ze streptawidyną kropki kwantowe, QD 655, użyto do oznaczenia mBtBDNF w celu wytworzenia QD-BDNF. Obecność AviTag nie zakłócała aktywności BDNF, ponieważ mBtBDNF był w stanie aktywować fosforylowany TrkB (Figura 1E) i stymulować wzrost neurytów (Figura 1F) do stopnia rekombinowanego ludzkiego BDNF (rhBDNF). Barwienie immunologiczne wykazało, że QD-BDNF kolokalizował się z TrkB w aksonach hipokampa, co wskazuje, że QD-BDNF jest bioaktywny (Figura 1G). Aby zbadać transport BDNF, QD-BDNF dodano do dystalnego przedziału aksonu kultur mikroprzepływowych zawierających neurony hipokampa E18 szczura (Figura 2A). Transport wsteczny QD-BDNF w aksonach został uchwycony przez obrazowanie na żywo w czasie rzeczywistym czerwonego znacznika fluorescencyjnego (filmy pomocnicze S1, S2). Analizując wygenerowany kimograf, zaobserwowano, że QD-BDNF jest transportowany wstecznie z prędkością ruchu około 1,06 μm / s (ryc. 3A). GFP lub BDNF oznaczone mCherry-tagged zostały użyte do śledzenia ruchu aksonów BDNF. Główną wadą jest to, że nie są wystarczająco jasne do badań pojedynczych cząsteczek. Ponadto obecność zarówno następczych, jak i wstecznych ruchów BDNF utrudnia ocenę, czy transportowany wstecznie BDNF znajdował się w kompleksie neurotrofina/receptor.

W tym filmie pokazujemy techniki używane do badania na żywo transportu QD-BDNF w komorach mikroprzepływowych za pomocą pierwotnych neuronów. Ultrajasność i doskonała fotostabilność kropek kwantowych umożliwia długoterminowe śledzenie transportu BDNF. Techniki te mogą być wykorzystane do wzbogacenia badań nad funkcją aksonów w chorobie Alzheimera, Huntingtona i innych zaburzeniach neurodegeneracyjnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zabiegi chirurgiczne i na zwierzętach są przeprowadzane ściśle według Przewodnika NIH dotyczącego opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Wszystkie eksperymenty z wykorzystaniem zwierząt są zatwierdzane przez UCSD Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Klonowanie plazmidu, ekspresja i oczyszczanie monobiotynylowanego BDNF (mBtBDNF)

UWAGA: Skonstruuj pre-proBDNFavi i BirA cDNA do wektora pcDNA3.1 i koekspresji w HEK293FT komórkach10. Oczyszczać mBtBDNF za pomocą kulek Ni-NTA zgodnie z wcześniej opublikowaną metodą wytwarzania dojrzałego i biologicznie aktywnego monobiotynylowanego czynnika wzrostu nerwów (mBtNGF)10.

2. Przygotowanie komór mikroprzepływowych

Mikroprzepływowe urządzenie do hodowli neuronów umożliwia płynne izolowanie aksonów od ciał komórek neuronów. Zmontuj komory ze świeżo pokrytymi szkiełkami nakrywkowymi tuż przed każdym rozwarstwieniem. Komory mikroprzepływowe stosowane w tym protokole są kupowane komercyjnie (patrz tabela materiałów i wyposażenia). Mycie ręczne i ponownie używane komory zakupione komercyjnie do 5-6 razy.

  1. Komory mikroprzepływowe do mycia ręcznego w 1% Alconox. Spłucz trzy razy wodą Milli-Q przez 30 minut każdy. Ponownie umyj komory do mycia rąk w 70% etanolu.
  2. Rozłóż komory do wyschnięcia na Parafilm w okapie z przepływem laminarnym. Naświetlaj i sterylizuj obie strony komór przez 20 minut w promieniowaniu UV. Wysterylizowane komory przechowywać w sterylnym naczyniu o średnicy 15 cm zamkniętym parafilmem w temperaturze pokojowej.
  3. Umieść szkiełka nakrywkowe 24 x 40 mm nr 1 w szklanym pojemniku. Namocz szkiełka nakrywkowe w 35% kwasie chlorowodorkowym przez noc na rotatorze. Następnego dnia spłucz szkiełka nakrywkowe trzy razy po 30 minut wodą.
  4. Sterylizuj szkiełka nakrywkowe jeden po drugim, zanurzając każde szkiełko nakrywkowe w 100% etanolu i paląc nad palnikiem Bunsena. Przechowuj suche szkiełka nakrywkowe na sterylnej szalce Petriego i przechowuj w temperaturze pokojowej do momentu powlekania.
  5. Ułóż szkiełka nakrywkowe w naczyniu hodowlanym o średnicy 15 cm. Pokryj każde szkiełko nakrywkowe 0,7 ml 0,01% poli-L-lizyny (PLL) i inkubuj w kapturze w temperaturze pokojowej.
  6. Po 1 godzinie spłucz szkiełka nakrywkowe trzykrotnie sterylną wodą. Wysuszyć szkiełka nakrywkowe w próżni i umieścić każde szkiełko nakrywkowe w naczyniu hodowlanym o średnicy 6 cm.
  7. Aby zmontować komorę mikroprzepływową, umieść komorę stroną z mikrorowkami u dołu na szkiełku nakrywkowym pokrytym PLL, uważając, aby nie dotykać mikrorowków. Delikatnie dociśnij komorę końcówką pipety, aby upewnić się, że komora jest szczelnie zamknięta.

3. Sekcja kultur neuronalnych i płytki na komorach

  1. Umieścić dwa hipokampy szczurów E17-E18 (jeden mózg) wycięte w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 2 ml buforu do rozwarstwiania (HBSS, bez wapnia, bez magnezu, z 1% wstrzykiwaczem/paciorkowcami i 10 mM HEPES. Za każdym razem płukać tkanki 3x 5 ml buforu do wypreparowania. Usunąć bufor do preparacji w jak największym stopniu i dodać 900 μl świeżego buforu do rozwarstwiania.
  2. Aby strawić tkankę, dodaj 100 μl 10x trypsyny (2,5%) do buforu rozwarstwiającego, aby uzyskać 1x stężenie robocze. Umieścić rurkę stożkową w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Po 10 minutach trawienia dodać 100 μl 10 mg/ml DNazy I do końcowego stężenia około 1 mg/ml.
  3. Używając wypolerowanej na gorąco szklanej pipety Pasteura, delikatnie rozcieraj tkanki, pipetując w górę i w dół 5-10 razy. Bezpośrednio po roztarciu wygaź trypsynę 2 ml pożywki galwanicznej (Neurobasal z 10% FBS, 2 mM GlutaMax, 2% B27).
  4. Pozostawić próbkę w kapturze na 5 minut, aby wszelkie zanieczyszczenia tkanek opadły na dno. Ostrożnie wyjąć 2 ml supernatantu do czystej, sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 x g przez 5 minut w celu osadzenia komórek. Zawiesić osad w pożywce galwanicznej o pojemności 50 μl
  5. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Załaduj 15-20 μl zawiesiny komórek (~ 40 000 komórek) do jednej komory komory mikroprzepływowej. Umieść komorę w inkubatorze na 10 minut, aby komórki mogły przyczepić się do szkiełka nakrywkowego. Po 10 minutach dodaj więcej mediów galwanicznych, aby wypełnić obie komory komory.
  6. W drugim dniu preparacji należy całkowicie wymienić pożywkę galwaniczną na pożywkę podtrzymującą (Neurobasal z 2 mM GlutaMax, 2% B27) zarówno w ciele komórki, jak i w przedziale aksonu. Aksony z neuronów hipokampa zaczynają przekraczać mikrorowki w 3 dniu i docierają do przedziału aksonów między 5-7 dniem. W tym czasie należy wymieniać połowę pożywek hodowlanych na świeże podłoża konserwacyjne co 24 ~ 48 godzin.

4. Transport aksonalny QD-BDNF

  1. Przed obrazowaniem na żywo transportu aksonalnego QD-BDNF, należy zubożyć BDNF zarówno z korpusu komórki, jak i przedziałów aksonów komory mikroprzepływowej, dokładnie przepłukując oba przedziały pożywką neuropodstawową bez BDNF, surowicy co 30 minut przez 2 godziny.
  2. Podczas wyczerpania BDNF przygotuj koniugaty QD-BDNF. Zmieszać 50 nM monobiotynylowanego dimeru BDNF z 50 nM koniugatami QD655-streptawidyny w pożywkach neuropodstawowych i inkubować na lodzie przez 60 minut.
  3. Usunąć pożywkę z komory aksonu i dodać 300 μl QD-BDNF o końcowym stężeniu 0,25 nM przez 4 godziny w temperaturze 37 °C. Aby zminimalizować dyfuzję QD-BDNF do przedziału ciała komórki, bardzo ważne jest, aby zawsze utrzymywać wyższy poziom pożywki w komorze ciała komórki niż w komorze aksonowej. Zmyć niezwiązany QD-BDNF po inkubacji przed obrazowaniem na żywo.
  4. Przeprowadzaj obrazowanie na żywo transportu QD-BDNF za pomocą odwróconego mikroskopu wyposażonego w soczewkę obiektywu olejowego 100X. Rozgrzej lunetę i dołączoną do niej komorę środowiskową do stałej temperatury (37 °C) i CO2 (5%). Użyj zestawu czerwonych kostek wzbudzenia/emisji z Teksasu, aby zobrazować sygnał QD655.
  5. Rejestruj i rejestruj zdjęcia poklatkowe w środkowych osiach z prędkością 1 klatki/s przez łącznie 2 minuty za pomocą kamery CCD. Używaj mikrorowków bez aksonów, które nie mają QD, a tym samym nie mają sygnału, jako kontroli infiltracji.
  6. Analizuj transport BDNF za pomocą dowolnego oprogramowania do analizy obrazu lub NIH ImageJ.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Produkcja i oczyszczanie biologicznie aktywnego mono-biotynilowanego BDNF

Wektor ekspresyjny BDNF połączony z sekwencją AviTag (GGGLNDIFEAQKIEWHE) został stworzony zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem10. Masę cząsteczkową pełnej białka fuzji przewidywano na ~32 kDa (http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html). Monobiotynowany dojrzały BDNF o przewidywanej masie cząsteczkowej 18 kDa (Rycina 1A...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu informujemy o opracowaniu nowej techniki wytwarzania biologicznie aktywnego, monobiotynylowanego BDNF (mBtBDNF), który można wykorzystać do śledzenia transportu aksonalnego BDNF. Poprzez sprzężenie białka ze streptawidyną w kropce kwantowej i zastosowanie komory mikroprzepływowej, metoda ta pozwala na wykrycie aksonalnego transportu BDNF w neuronach pierwotnych z czułością pojedynczej cząsteczki, w czasie rzeczywistym oraz z rozdzielczością przestrzenną i czasową. Narzędzia użyte w niniejszym dokumencie zap...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Yue (Pauline) Hu, Rachel Sinit za ich pomoc techniczną. Badanie jest wspierane przez grant NIH (PN2 EY016525) oraz przez fundusze z Down Syndrome Research and Treatment Foundation i Larry L. Hillblom Foundation.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Polimeraza DNA platyny pfx Invitrogen11708021
EcoRI FermentasFD0274
BamHI FermentasFD0054
HEK293FT komórkiInvitrogenR70007
DMEM-podłoże o wysokim poziomie glukozyMediatech10-013-CV
D-biotyna SigmaB4639
TurboFect FermentasR0531
PMSF   SigmaP7626
AprotyninaSigmaA6279
Żywice Ni-NTAQiagen30250
Inhibitory proteazykoktajl Sigma  S8820
Zestaw do barwienia srebra G-Biosciences786-30
Ludzkie rekombinowane BDNFGenentech
Komory mikroprzepływoweXonaSND450
24 x 40 mm Szkiełka nakrywkowe szklane nr 1 VWR48393-060
Poli-L-lizyna Cultrex3438-100-01
HBSSGibco14185-052
DNase IRoche10104159001
TrypsinGibco15090-046
Neurobasal Gibco21103-049
FBS Invitrogen16000-044
GlutaMax Invitrogen35050-061
B27   Gibco17504-044
QD655-streptawidyna koniugatyInvitrogen 
przeciwciało anty-Avi tagGenScriptA00674
paciorkowce streptawidyny-agarozy Technologia życiowa  SA100-04
Kwas trichlorooctowySigmaT6399
HRP-streptawidyna Przeciwciało anty-pTrkB Thermo ScientificN100
hojny prezent od dr M. Chao z NYU
przeciwciało anty-TrkBBD Science610101
Q10121MP

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wu, C., et al. A functional dynein-microtubule network is required for NGF signaling through the Rap1/MAPK pathway. Traffic. 8, 1503-1520 (2007).
  2. Wortzel, I., Seger, R. The ERK Cascade: Distinct Functions within Various Subcellular Organelles. Genes & cancer. 2, 195-209 (2011).
  3. Huang, E. J., Reichardt, L. F. Trk receptors: roles in neuronal signal transduction. Annual review of biochemistry. 72, 609-642 (2003).
  4. Nonomura, T., et al. Signaling pathways and survival effects of BDNF and NT-3 on cultured cerebellar granule cells. Brain research. Developmental brain research. 97, 42-50 (1996).
  5. Weissmiller, A. M., Wu, C. Current advances in using neurotrophic factors to treat neurodegenerative disorders. Translational neurodegeneration. 1, 14(2012).
  6. Zhang, K., et al. Defective axonal transport of Rab7 GTPase results in dysregulated trophic signaling. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 7451-7462 (2013).
  7. Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature methods. 2, 599-605 (2005).
  8. Cui, B., et al. One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).
  9. Xie, W., Zhang, K., Cui, B. Functional characterization and axonal transport of quantum dot labeled BDNF. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4, 953-960 (2012).
  10. Sung, K., Maloney, M. T., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of neuroscience methods. 200, 121-128 (2011).
  11. Tani, T., et al. Trafficking of a ligand-receptor complex on the growth cones as an essential step for the uptake of nerve growth factor at the distal end of the axon: a single-molecule analysis. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2181-2191 (2005).
  12. Bronfman, F. C., Tcherpakov, M., Jovin, T. M., Fainzilber, M. Ligand-induced internalization of the p75 neurotrophin receptor: a slow route to the signaling endosome. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 3209-3220 (2003).
  13. Kruttgen, A., Heymach, J. V., Kahle, P. J., Shooter, E. M. The role of the nerve growth factor carboxyl terminus in receptor binding and conformational stability. The Journal of biological chemistry. 272, 29222-29228 (1997).
  14. Zuccato, C., Cattaneo, E. Brain-derived neurotrophic factor in neurodegenerative diseases. Nature reviews. Neurology. 5, 311-322 (2009).
  15. Gharami, K., Xie, Y., An, J. J., Tonegawa, S., Xu, B. Brain-derived neurotrophic factor over-expression in the forebrain ameliorates Huntington's disease phenotypes in mice. Journal of neurochemistry. 105, 369-379 (2008).
  16. Gauthier, L. R., et al. Huntingtin controls neurotrophic support and survival of neurons by enhancing BDNF vesicular transport along microtubules. Cell. 118, 127-138 (2004).
  17. Her, L. S., Goldstein, L. S. Enhanced sensitivity of striatal neurons to axonal transport defects induced by mutant huntingtin. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 13662-13672 (2008).
  18. Rong, J., et al. Regulation of intracellular trafficking of huntingtin-associated protein-1 is critical for TrkA protein levels and neurite outgrowth. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 6019-6030 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Transport BDNFznakowanie kropkami kwantowymikomora mikroprzep ywowaobrazowanie na ywomikroskopia fluorescencyjnatransport wstecznyBDNF znakowany kropkami kwantowymineurony hipokampa

Powiązane artykuły