$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Precyzyjne i szybkie metody wykrywania białek są bardzo ważne w diagnostyce medycznej i proteomice. Klasyczne macierze wykrywające białka, takie jak biochipy, opierają się na zasadzie rozpoznawania "zamknij i klucz" i wymagają specyficznych receptorów, takich jak aptamery, przeciwciała lub mimetyki.
W ostatnich latachjako alternatywa pojawiła się percepcja różnicowa inspirowana ludzkim węchem i smakiem. To elektroniczne podejście nos/język (eN/eT) opiera się na zróżnicowanym wiązaniu analitów z szeregiem receptorów reagujących krzyżowo (CRR), które nie muszą być wysoce specyficzne lub selektywne dla cząsteczek docelowych, co pozwala przezwyciężyć pracochłonny proces opracowywania wysoce selektywnych receptorów. Jest to połączona odpowiedź wszystkich receptorów, która tworzy odrębny wzór dla każdej próbki, jak odcisk palca, umożliwiając jej identyfikację.
Dwa kluczowe wyzwania dla rozwoju elektronicznego nosa/języka do skutecznego wykrywania białek to produkcja elementów detekcyjnych, które mają zdolność rozróżniania strukturalnie podobnych analitów i odpowiedniego systemu transdukcji dla zdarzenia wiązania. Do tej pory badania opisywały różne podejścia do tworzenia macierzy2. Na przykład w jednym z badań opracowano identyfikację białek opartą na macierzy przy użyciu CRR przygotowanych z pochodnych tetra-karboksyfenyloporfiryny poprzez sprzężenie grup karboksylowych z różnymi aminokwasami lub dipeptydami w celu uzyskania zróżnicowanych receptorów posiadających hydrofobowy rdzeń zapewniający powinowactwo do białek i wyraźne naładowane peryferie do nadawania różnicowego wiązania. Korzystając z tego systemu, zidentyfikowano różne białka i mieszaniny białek, mierząc wygaszanie fluorescencji receptorów po interakcji z analitami3,4. W innym badaniu opracowano bibliotekę 29 CRR zawierających ugrupowania tripeptydu i kwasu borowego zsyntetyzowane w sposób kombinatoryczny na rusztowaniu benzenowym z heksapodstawionym heksapodstawieniem do wykrywania białek z detekcją kolorymetryczną wychwytu wskaźnika5,6. Dzięki takiej konstrukcji każdy receptor wykazywał zróżnicowaną zdolność wiązania z białkami w oparciu o wariancję ramion peptydów, a kwasy boronowe pomagały w różnicowaniu białek od glikoprotein. Niedawno stworzono macierz złożoną z różnych kationowo funkcjonalizowanych nanocząstek złota sprzężonych z anionowym fluorescencyjnym polimerem poli(p-fenyleneethynylenem) (PPE) w celu wykrywania i identyfikacji białek7. Konkurencyjne wiązanie między analitami białkowymi a wygaszonymi kompleksami nanocząstek PPE/złota zregenerowało fluorescencję, tworząc wyraźne wzorce rozpoznawania białek. W tym badaniu funkcjonalizowane interakcje nanocząstka-białko zostały dostrojone przez różne właściwości fizykochemiczne grup końcowych nanocząstek. Ponadto wykazano, że podejście to jest skuteczne w analizie białek w złożonych i bogatych w białko podłożach, takich jak surowica ludzka, w fizjologicznie istotnych stężeniach, pokazując w ten sposób potencjał eT w profilowaniu rzeczywistych próbek do diagnozowania stanów chorobowych8.
Chociaż bardzo obiecujące, te systemy mają pewne nieodłączne ograniczenia. Wymagają one zaprojektowania i zsyntetyzowania od 5 do 29 CRR o dość skomplikowanych strukturach. Ponadto, w przeciwieństwie do układu węchowego, który jest resetowany po każdym pomiarze, wykrywanie białek wymaga przygotowania matrycy dla każdej próbki. Wreszcie, monitorowanie zdarzeń wiązania w czasie rzeczywistym jest niezwykle trudne.
W tym kontekście, zaproponowano podejście kombinatoryczne polegające na użyciu niewielkiej liczby prostych i łatwo dostępnych cząsteczek o różnych właściwościach fizykochemicznych (hydrofilowe, hydrofobowe, dodatnio naładowane, ujemnie naładowane, neutralne, itp.) jako elementy budulcowe (BBs)9. Mieszając kulki w różnych i kontrolowanych proporcjach i pozwalając mieszaninom na samoorganizację na złotej powierzchni pryzmatu, stworzono szereg powierzchni kombinatorycznych o odpowiednich właściwościach wiązania białka. Warto zauważyć, że samoorganizujące się monowarstwy w tym systemie umożliwiają łatwe dostrajanie szeregu właściwości powierzchni w bardzo rozbieżny sposób, umożliwiając szybkie i wydajne wytwarzanie różnorodnych kombinatorycznych receptorów reakcji krzyżowej (CoCRR). Wykrywanie białek przeprowadzono za pomocą optycznego systemu detekcji, obrazowania powierzchniowego rezonansu plazmonów (SPRi). Krótko mówiąc, monochromatyczne światło spolaryzowane o szerokiej wiązce z diody LED oświetla cały obszar matrycy CoCRR na powierzchni pryzmatu. Kamera wideo CCD o wysokiej rozdzielczości zapewnia obrazy różnicowe w czasie rzeczywistym we wszystkich miejscach matrycy CoCRR. Rejestruje wszystkie lokalne zmiany na powierzchni macierzy CoCRR, dostarczając szczegółowych informacji na temat zdarzeń wiązania i procesów kinetycznych10. Tymczasem, za pomocą oprogramowania do obrazowania, obrazy SPR odpowiadające plamkom są automatycznie konwertowane na zmiany współczynnika odbicia w funkcji czasu, generując serię krzywych wiązania kinetycznego zwanych sensorgramami. W ten sposób SPRi umożliwia bezetykietową, synchroniczną, równoległą obserwację zdarzeń wiązania w czasie rzeczywistym. Dodatkowo uzyskana macierz CoCRR jest regenerowalna i nadaje się do wielokrotnego wykorzystania do analizy białek.
Ten protokół opisuje budowę elektronicznego języka przy użyciu tylko dwóch małych molekuł jako elementów budulcowych i ilustruje jego zastosowanie do analizy popularnych białek na podstawie ciągłych wzorców rozpoznawania uzyskanych za pomocą SPRi.