Elektroniczny język generujący ciągłe wzorce rozpoznawania do analizy białek

Summary

Opisano nowatorskie podejście do budowy elektronicznego języka (eT), które znacznie upraszcza projektowanie i produkcję materiałów detekcyjnych, a także pozwala eT generować ciągłe profile ewolucji i krajobrazy dla próbek w cieczy. Uzyskany eT jest skuteczny w powszechnej analizie białek, takiej jak dyskryminacja.

Abstract

W obecnym protokole opracowano podejście kombinatoryczne, aby uprościć projektowanie i produkcję materiałów detekcyjnych do budowy języków elektronicznych (eT) do analizy białek. Mieszając niewielką liczbę prostych i łatwo dostępnych cząsteczek o różnych właściwościach fizykochemicznych, wykorzystywanych jako bloki budulcowe (BB), w różnych i kontrolowanych proporcjach oraz pozwalając mieszaninom na samoorganizację na złotej powierzchni pryzmatu, stworzono szereg powierzchni kombinatorycznych o odpowiednich właściwościach do wykrywania białek. W ten sposób można szybko i skutecznie uzyskać dużą liczbę receptorów reagujących krzyżowo. Łącząc taki układ kombinatorycznych receptorów reakcji krzyżowej (CoCRR) z optycznym systemem detekcji, takim jak obrazowanie powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPRi), uzyskany eT może monitorować zdarzenia wiązania w czasie rzeczywistym i generować ciągłe wzorce rozpoznawania, w tym profil ciągłej ewolucji 2D () i krajobraz ciągłej ewolucji 3D (CEL) dla próbek w cieczy. Taki system eT jest skuteczny w rozróżnianiu powszechnie stosowanych oczyszczonych białek.

Introduction

Precyzyjne i szybkie metody wykrywania białek są bardzo ważne w diagnostyce medycznej i proteomice. Klasyczne macierze wykrywające białka, takie jak biochipy, opierają się na zasadzie rozpoznawania "zamknij i klucz" i wymagają specyficznych receptorów, takich jak aptamery, przeciwciała lub mimetyki.

W ostatnich latach^{jako alternatywa} pojawiła się percepcja różnicowa inspirowana ludzkim węchem i smakiem. To elektroniczne podejście nos/język (eN/eT) opiera się na zróżnicowanym wiązaniu analitów z szeregiem receptorów reagujących krzyżowo (CRR), które nie muszą być wysoce specyficzne lub selektywne dla cząsteczek docelowych, co pozw....

Protocol

1. Przygotowanie różnych roztworów i próbek białek

1. Przygotować 100 ml buforu fosforanowego (PBS-G) zawierającego 50 mM NaH₂PO₄, 50 mM NaCl i 10% glicerolu o pH 6,8.
2. Przygotować 250 ml roztworu buforowego HEPES zawierającego 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,005% Tween 20 przy pH 7,4.
3. Przygotować roztwór podstawowy laktozy z bloku budulcowego 1 (BB1) i laktozy siarczanowanej z bloku budulcowego 2 (BB2) (ryc. 1) w stężeniu 0,2 mM w PBS-G.
4. Przygotować 1 ml roztworów białkowych w HEPES:lektyna A rachis hypogaea (AHL) przy 500 nM, mioglobina przy 1 μM i lizozym przy 500 nM.
5. Przygo....

Results

Aby zbadać zdolność elektronicznego języka do powszechnej analizy białek, użyto trzech białek: AHL, mioglobiny i lizozymu. Dla każdego białka eT wygenerował odrębny profil ciągłej ewolucji 2D,, jak pokazano na rysunku 6.

Ponadto, dzięki SPRi, który jest w stanie monitorować kinetykę adsorpcji i desorpcji w czasie rzeczywistym, dla każdego białka wygenerowano zależny od czasu wzorzec ciągłego rozpoznawania, zwany 3D Continuous Evolution Landscape (CEL). Na rycinie 7

Discussion

Najbardziej krytyczne etapy budowy tego eT są poświęcone zapewnieniu dobrej odtwarzalności systemu. Na przykład, czyszczenie złotej powierzchni pryzmatu za pomocą znormalizowanej procedury przed użyciem, dodanie 10% glicerolu do jedenastu czystych i zmieszanych roztworów BB1 i BB2 w celu wyeliminowania parowania rozpuszczalnika podczas samoorganizacji kulek na złotej powierzchni pryzmatu, osadzanie wielu powtórzeń dla każdego stosunku [BB1]/([BB1]+[BB2]) itp. Jeśli chodzi o wykrywanie białek przez SPRi, wybór ką.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aparatura SPRi	Aparat Horiba Scientific-GenOptics		SPRi umieszcza się w inkubatorze o regulowanej temperaturze w temperaturze 25 °C.
Inkubator	Memmert
Pompa strzykawkowa	Instrumenty naukowe	Cavro XLP 6000
Micro Elite Degazser	Alltech	AT590507
6-portowy średniociśnieniowy zawór wtryskowy	Upchurch Scientific		Objętość zastosowanej pętli wtryskowej wynosi 500 &mikrolitrów.
Myjka plazmowa Femto (wersja 7)	Diener Elektroniczny		system odgazowywania on-line z 2 kanałami.
Spotter	Siliflow		Jest to bezkontaktowy obserwator piezoelektryczny.
SPRi-Biochip	Horiba Scientific-GenOptics	36000067	Pryzmat wykonany jest ze szklanego pryzmatu o wysokim współczynniku załamania światła pokrytego cienką złotą folią (45 nm) i specjalnie opracowanego do celów obrazowania.
Erythrina cristagalli lectin	Sigma-Aldrich	L5390
Lektyna Arachis hypogaea	Sigma-Aldrich	L0881
Mioglobina	Sigma-Aldrich	M1882
Lizozym	Sigma-Aldrich	L6876
CXCL12&alfa;			Dostarczone przez Dr. Hugues Lortat-Jacob; Szczegółowe informacje na temat przygotowania znajdują się w informacjach uzupełniających w numerze referencyjnym
9 CXCL12γ			Dostarczone przez Dr. Hugues Lortat-Jacob; aby uzyskać szczegółowe informacje dotyczące przygotowania, patrz informacje uzupełniające w pozycji 9
Laktoza			Dostarczone przez prof. Davida Bonnaffa; w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat przygotowania, patrz informacje uzupełniające w pozycji 9
Laktoza			Dostarczone przez prof. Davida Bonnaffa; w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat przygotowania, patrz informacje uzupełniające w pozycji 9
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5150
SDS	Sigma-Aldrich	L4509
Tween 20	Sigma-Aldrich	274348
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Fosforan sodu jednozasadowy	Sigma-Aldrich	S0751
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich	S3014