Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wzbogacanie gDNA za pomocą technologii opartej na transpozazie do analizy NGS całej sekwencji genów BRCA1, BRCA2 i 9 biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA

11.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51902

⸱

6 października 2014

 , 
1Department of Biology and Pathology of Tumors, Unit of Molecular Biology, Platform of Immunomonitoring and Genetics, Centre Georges-François Leclerc

W tym artykule

Podsumowanie

Wzbogacanie gDNA do sekwencjonowania NGS jest łatwym i potężnym narzędziem do badania mutacji konstytucyjnych. W tym artykule przedstawiamy procedurę analizy w prosty sposób pełnej sekwencji 11 genów biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA.

Streszczenie

Powszechne stosowanie sekwencjonowania nowej generacji otworzyło nowe możliwości badań i diagnozowania raka. NGS przyniesie ogromne ilości nowych danych na temat raka, a zwłaszcza genetyki nowotworów. Obecna wiedza i przyszłe odkrycia sprawią, że konieczne będzie zbadanie ogromnej liczby genów, które mogą być zaangażowane w genetyczną predyspozycję do raka. W związku z tym opracowaliśmy projekt Nextera do badania 11 kompletnych genów zaangażowanych w naprawę uszkodzeń DNA. Protokół ten został opracowany w celu bezpiecznego badania 11 genów (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80 i TP53) od promotora do 3'-UTR u 24 pacjentów jednocześnie. Protokół ten, oparty na technologii transpozazy i wzbogacaniu gDNA, daje ogromną przewagę pod względem czasu diagnozy genetycznej dzięki multipleksowaniu próbek. Protokół ten może być bezpiecznie stosowany z gDNA krwi.

Wprowadzenie

W 2010 roku prawie 1,5 miliona osób (głównie kobiet) zachorowało na raka piersi na całym świecie. Szacuje się, że od 5 do 10% tych przypadków było dziedzicznych. Prawie 20 lat temu BRCA1 i BRCA2 zostały zidentyfikowane jako zaangażowane w dziedziczne raki piersi i jajników1. Od około 15 lat sekwencjonowane są regiony kodujące BRCA1 i BRCA2 w celu określenia genetycznej predyspozycji do raka piersi i jajnika. Zmiany w BRCA1 i BRCA2 wykrywa się u 10 do 20%wybranych rodzin2, co sugeruje, że analiza tych regionów nie jest wystarczająca do przeprowadzenia skutecznych badań przesiewowych. Niedawna analiza sekwencji niekodujących (promotor, introny, 3-'UTR) BRCA1 i BRCA2 wykazała, że nowe mutacje/wariacje mogą być związane z wyższym ryzykiem raka piersi3-6.

Białka BRCA1 i BRCA2 biorą udział w naprawie rekombinacji homologicznej (HHR), która jest realizowana przez wielu partnerów7. Podczas gdy zmiany w BRCA1 lub BRCA2 wywołują defekty w naprawie DNA, inni partnerzy mogą również wpływać na ryzyko raka piersi. Wydaje się, że hipoteza ta została potwierdzona, ponieważ BRIP18 i PALB29 mają udowodniony wpływ odpowiednio na raka szyjki macicy i piersi. Ponadto dwa inne geny podatności na raka piersi "umiarkowanego ryzyka", ATM i CHEK2, mogą być również badane rutynowo.

Kontynuując te badania, zdecydowaliśmy się opracować protokół do analizy 11 genów (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAP80 i TP53) u 24 pacjentów jednocześnie, używając bardzo łatwego i stosunkowo szybkiego protokołu opartego na technologii transpozy, z wzbogacaniem i sekwencjonowaniem na urządzeniu o średniej przepustowości. Dzięki tej technice zsekwencjonowaliśmy kompletne geny od początku promotora do końca 3'-UTR, z wyjątkiem RAP80, dla którego region intronowy 2,500 pz nie został pokryty (Chr5: 176,381,588-176,390,180). Daje to w sumie około 1 000 300 pz badanych za pomocą 2 734 sond. Zwykle sekwencje egzoniczne BRCA1 i BRCA2 są analizowane za pomocą sekwencjonowania Sangera, które potrzebuje 1,5 miesiąca dla mniej niż 20 pacjentów. Dzięki obecnemu protokołowi (ryc. 1) w tym samym czasie można było przeanalizować 11 kompletnych genów dla ponad 75 pacjentów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Ocena wydajności gDNA (genomowego DNA)

  1. Określ ilościowo świeżo wyekstrahowane gDNA przed przygotowaniem biblioteki. Użyj metody fluorometrycznej oceny wydajności, aby określić ilościowo nienaruszone gDNA (unikaj używania spektrofotometru do oceny wydajności gDNA). Zmierz stosunek (260/280 nm) i upewnij się, że wynosi od 1,8 do 2. UWAGA: Do eksperymentu wymagane jest 50 ng gDNA.

2. Wzbogacanie gDNA: Dzień 1, Poranek

  1. Przed rozpoczęciem
    1. Z zestawu do wzbogacania DNA (patrz Tabela materiałów/wyposażenia) rozmrozić roztwory buforu DNA (TD) i enzymu DNA (TDE1) na lodzie. Co najmniej 30 minut przed użyciem doprowadzić oczyszczające kulki magnetyczne i zatrzymać bufor docelowy (ST) do temperatury pokojowej (RT). Dodaj 20 μl próbki gDNA w stężeniu 2-2,5 ng/μl bezpośrednio do 96-dołkowej płytki, 1 dołek na próbkę. WAŻNE: Użyj kontroli pozytywnej w celu walidacji protokołu (próbka ze znaną zmiennością sekwencji).
  2. Tagowanie
    1. Dokładnie wymieszaj wszystkie odczynniki, odwracając 5x i krótko odwiruj. W RT dodać 25 μl buforu TD do każdej studzienki zawierającej 50 ng (20 μl) gDNA, a następnie 5 μl buforu TDE1. Ustaw pipetę na 50 μl, delikatnie odpipetuj całą objętość w górę i w dół 10x.
    2. Przykryć płytkę folią samoprzylepną i wirować przez 1 minutę w temperaturze 280 x g w temperaturze 20 °C. Następnie umieść płytkę w termocyklerze (pokrywa podgrzana do 100 °C) i uruchom program: 55 °C na 5 min i 10 °C na nieograniczony czas.
    3. Podczas tej inkubacji przygotuj przykładowy arkusz za pomocą oprogramowania Experiment Manager, aby zdefiniować indeksy, które będą używane.
  3. Tagmentacja Oczyszczanie
    UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie. Bądź bardzo ostrożny.
    1. Sprawdź, czy nie ma osadu w kulkach magnetycznych oczyszczających i buforze ST. Jeśli obecne są osady, rozgrzej roztwory w dłoniach. Rozmrozić bufor do zawieszania (RSB) na lodzie.
    2. W temperaturze pokojowej odwirować roztwór ST i dodać 15 μl do każdej studzienki zawierającej próbkę. Ustaw pipetę na 65 μl, delikatnie odpipetuj całą objętość w górę i w dół 10x. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przykryć płytkę i wirować przez 1 minutę w temperaturze 280 x g w temperaturze 20 °C.
    3. Do każdej studzienki dodać 52 μl wcześniej zmieszanych kulek magnetycznych do oczyszczania. Ustaw pipetę na 117 μl, delikatnie odpipetuj całą objętość w górę i w dół 10 razy. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przykryć płytkę i wirować przez 1 minutę w temperaturze 280 x g w temperaturze 20 °C.
    4. Usuń folię samoprzylepną. Umieść 96-dołkową płytkę na stojaku magnetycznym na 2 minuty w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że supernatant wydaje się całkowicie przezroczysty.
    5. Przygotować świeży 80% roztwór etanolu (na 24 próbki dodać 2 ml wody destylowanej do 8 ml etanolu). Usunąć i wyrzucić supernatant, uważając, aby nie naruszyć kulek.
    6. Trzymając płytkę na stojaku magnetycznym, dodaj 200 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu do każdej studzienki, nie naruszając kulek i inkubuj płytkę przez co najmniej 30 sekund w temperaturze pokojowej. Wyrzucić supernatant i powtórzyć to płukanie po raz drugi. Upewnij się, że etanol został usunięty. Pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 10 minut lub do całkowitego odparowania etanolu.
    7. Zdejmij płytkę ze stojaka magnetycznego i dodaj 22,5 μl buforu RSB. Ustaw pipetę na 22,5 μl, delikatnie odpipetuj całą objętość w górę i w dół 10x. Umieścić 96-dołkową płytkę na stojaku magnetycznym i inkubować przez 2 minuty. Upewnij się, że supernatant wydaje się całkowicie przezroczysty. Delikatnie przenieść 20 μl supernatantu do nowej płytki 96-dołkowej.
      UWAGA: Opcjonalnie można określić rozmiar oznaczonych próbek za pomocą analizatora fragmentów. Zamiast kroków wymienionych powyżej użyj elektroforezy w żelu akrylowym o wysokiej rozdzielczości. Fragmenty powinny mieć od 150 pz do 1 000 pz.
  4. 1. amplifikacja PCR
    1. Rozmrozić na lodzie mieszaninę główną PCR zawierającą polimerazę (LP-PMM), roztwory startera o indeksie 1 i spłonki o indeksie 2. Dopasuj kombinację indeksów do przykładowego arkusza Menedżera eksperymentów. Do multipleksowania należy przygotować różne i7 o indeksie 1 (i7, N7xx) dla każdej próbki.
    2. Do każdej studzienki dodać 20 μl LP-PMM, 5 μl wskaźnika 1 i 5 μl wskaźnika 2. Ustaw pipetę na 50 μl, delikatnie odpipetuj całą objętość w górę i w dół 10 razy. Przykryj płytkę samoprzylepną folią z mikrouszczelką. Wirować przez 1 minutę przy 280 x g w temperaturze 20 °C.
    3. Umieścić płytkę w termocyklerze (pokrywa podgrzana do 100 °C) i uruchomić program 1 (Tabela 1).
      UWAGA: w tym momencie procedura może zostać przerwana, a reakcje przechowywane przez noc w termocyklerze lub przez 2 dni w temperaturze od 2 do 8 °C.

3. Wzbogacanie gDNA: Dzień 1, Popołudnie

  1. Przed rozpoczęciem
    1. Rozmrażanie oligonukleotydów (CSO), wychwytywanie bufora docelowego 1 (NCT1) i roztwory RSB na lodzie. Co najmniej 30 minut przed użyciem przynieś oczyszczające kulki magnetyczne do RT.
  2. Oczyszczanie PCR
    1. Odwirować płytkę z kroku 2.4 przez 1 minutę przy 280 x g w temperaturze 20 °C.
    2. W temperaturze pokojowej dodaj 45 μl mieszanych kulek magnetycznych do oczyszczania do każdej studzienki. Ustaw pipetę na 95 μl, delikatnie odpipetuj całą objętość w górę i w dół 10x. Inkubować przez 10 minut w temperaturze suchej masy. Umieścić 96-dołkową płytkę na stojaku magnetycznym na 2 minuty w temperaturze pokojowej.
    3. Upewnij się, że supernatant wydaje się całkowicie przezroczysty. Przygotować świeży 80% roztwór etanolu (na 24 próbki dodać 2 ml wody destylowanej do 8 ml etanolu). Odrzucić sklarowany osad, uważając, aby nie naruszyć osadu.
    4. Trzymając płytkę na stojaku magnetycznym, dodaj 200 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu do każdej studzienki bez naruszania kulek i inkubuj płytkę przez 30 sekund w temperaturze pokojowej. Wyrzucić supernatant i powtórzyć to płukanie po raz drugi. Upewnij się, że etanol został usunięty. Pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej na 15 minut.
    5. Zdejmij płytkę ze stojaka magnetycznego i dodaj 40 μl buforu RSB. Ustaw pipetę na 40 μl, delikatnie odpipetuj całą objętość w górę i w dół 10x.
    6. Umieścić 96-dołkową płytkę na stojaku magnetycznym i inkubować przez 2 minuty. Supernatant powinien wydawać się całkowicie przezroczysty. Delikatnie przenieść 38 μl supernatantu do nowej płytki 96-dołkowej.
    7. Oznaczyć wydajność każdej próbki metodą fluorymetryczną. Ta pierwsza część protokołu zostanie zatwierdzona, jeśli szacowane plony wynoszą od 30 do 50 ng/μl.
  3. 1. Hybrydyzacja
    1. Na tym etapie należy zebrać do 12 próbek z każdej próbki, mieszając 500 ng każdej próbki na nowej 96-dołkowej płytce. Upewnij się, że końcowa objętość każdej puli nie przekracza 40 μl.
      UWAGA: W razie potrzeby zmniejsz objętość basenów za pomocą koncentratora próżniowego w temperaturze pokojowej (Uwaga: stężenie DNA nie może być modyfikowane przez ogrzewanie, nawet w temperaturze 30 °C, ponieważ ogrzewanie powoduje degradację DNA). Dostosować końcową objętość do 40 μl, dodając roztwór RSB.
    2. Dokładnie wymieszaj roztwór NCT1. Do każdej studzienki zawierającej 40 μl zbiorczych próbek DNA dodać 50 μl NCT1 i 10 μl CSO. Ustaw pipetę na 100 μl, delikatnie odpipetuj całą objętość w górę i w dół 10 razy. Uszczelnić płytkę i odwirować przez 1 minutę w temperaturze 280 x g w temperaturze 20 °C.
    3. Umieścić płytkę w termocyklerze (pokrywa podgrzana do 100 °C) i uruchomić program 2 (Tabela 1).

4. Wzbogacanie gDNA: Dzień 2, Poranek

  1. Przed rozpoczęciem
    1. Z zestawu do wzbogacania DNA (patrz Tabela materiałów/sprzętu) rozmrozić 2 N NaOH (HP3), docelowy bufor elucyjny 1 (ET1), docelowy bufor elucyjny 1 ET2, kulki magnetyczne streptawidyny (SMB), roztwór do przemywania 1 (WS1), roztwór do przemywania 2 (WS2), roztwór do przemywania 3 (WS3), CSO i roztwory NCT1 w temperaturze pokojowej.
  2. 1. mycie hybrydyzacyjne
    1. Wyjąć 96-dołkową płytkę z termocyklera i odwirować przez 1 minutę przy 280 x g w temperaturze 20 °C. Bardzo ostrożnie zdjąć samoprzylepną osłonę.
    2. Przenieś 100 μl mieszaniny reakcyjnej z płytki na nową 96-dołkową płytkę MIDI i dodaj 250 μl dobrze zwirowanego roztworu SMB. Ustaw pipetę na 350 μl, delikatnie odpipetuj całą objętość w górę i w dół 10x. Uszczelnić płytkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    3. Wirować przez 1 minutę przy 280 x g w temperaturze 20 °C, usunąć uszczelkę samoprzylepną i umieścić płytkę na stojaku magnetycznym na 2 minuty. Upewnij się, że supernatant wydaje się całkowicie czysty. Odrzucić supernatant i zdjąć płytkę ze stojaka magnetycznego.
    4. Dodać 200 μl dobrze wymieszanego roztworu WS1 do studzienki zawierającej kulki. Ustaw pipetę na 200 μl i delikatnie pipetuj całą objętość w górę i w dół 15 razy, unikając tworzenia się pęcherzyków/piany.
    5. Umieść płytkę na stojaku magnetycznym na 2 minuty. Upewnij się, że supernatant wydaje się całkowicie przezroczysty. Odrzucić supernatant i zdjąć płytkę ze stojaka magnetycznego.
    6. Dodać 200 μl dobrze wymieszanego roztworu WS2 do studzienek zawierających kulki. Ustaw pipetę na 200 μl i delikatnie pipetuj całą objętość w górę i w dół 15 razy, unikając tworzenia się pęcherzyków/piany.
    7. Umieść płytkę na stojaku magnetycznym na 2 minuty. Upewnij się, że supernatant wydaje się całkowicie przezroczysty. Odrzucić supernatant i zdjąć płytkę ze stojaka magnetycznego.
    8. Dodać 200 μl dobrze wymieszanego roztworu WS2 do studzienek zawierających kulki. Ustaw pipetę na 200 μl i delikatnie pipetuj całą objętość w górę i w dół 15 razy.
    9. Przenieść całą objętość na nową płytkę 96-dołkową. Uszczelnić płytkę i umieścić ją w termocyklerze (pokrywa podgrzana do 100 °C). Uruchom termocykler w temperaturze 42 °C na 30 minut.
    10. Natychmiast umieść płytkę na stojaku magnetycznym na 2 minuty. Upewnij się, że supernatant wydaje się całkowicie przezroczysty. Usunąć uszczelkę i natychmiast wyrzucić cały supernatant. Następnie zdejmij płytkę ze stojaka magnetycznego.
    11. Dodaj 200 μl WS2 do studzienek zawierających kulki. Ustaw pipetę na 200 μl i delikatnie pipetuj całą objętość w górę i w dół 15 razy, unikając tworzenia się pęcherzyków/piany. Uszczelnić płytkę i umieścić ją w termocyklerze (pokrywa podgrzana do 100 °C). Uruchom termocykler w temperaturze 42 °C na 30 minut.
    12. Natychmiast umieść płytkę na stojaku magnetycznym na 2 minuty. Upewnij się, że supernatant jest całkowicie przezroczysty. Usunąć uszczelkę i natychmiast wyrzucić cały supernatant. Następnie zdejmij płytkę ze stojaka magnetycznego.
    13. Dodać 200 μl dobrze wymieszanego roztworu WS3 do studzienek zawierających kulki. Ustaw pipetę na 200 μl i delikatnie pipetuj całą objętość w górę i w dół 15 razy.
    14. Umieść płytkę na stojaku magnetycznym na 2 minuty. Upewnij się, że supernatant wydaje się całkowicie przezroczysty. Odrzucić cały supernatant i zdjąć płytkę ze stojaka magnetycznego.
    15. Powtórz mycie WS3 po raz drugi.
    16. Po usunięciu supernatantu należy uszczelnić płytkę i na krótko odwirować w celu usunięcia pozostałego supernatantu. Umieść talerz na stojaku magnetycznym na 2 minuty. Odrzucić pozostałość supernatantu.
    17. W probówce o pojemności 0,2 ml wymieszaj 28,5 μl ET1 i 1,5 μl roztworów HP3. Ta mieszanka dotyczy 1 puli, jeśli przygotowanych jest więcej basenów, pomnóż te objętości przez liczbę przygotowanych basenów.
    18. Zdejmij płytkę ze stojaka magnetycznego. Dodać 23 μl wyżej przygotowanej mieszanki. Ustaw pipetę na 23 μl i delikatnie pipetuj całą objętość w górę i w dół 15 razy. Uszczelnić płytkę i pozostawić na 5 minut w temperaturze pokojowej skutków. Wirować przez 1 minutę w temperaturze 280 x g w temperaturze 20 °C.
    19. Umieść płytkę na stojaku magnetycznym na 2 minuty. Upewnij się, że supernatant wydaje się całkowicie przezroczysty. Usunąć folię adhezyjną i przenieść 21 μl supernatantu na nową płytkę 96-dołkową.
    20. Dodać 4 μl roztworu ET2 do każdego dołka. Ustaw pipetę na 25 μl i delikatnie odpipetuj całą objętość 10 razy w górę i w dół i uszczelnij płytkę.
      UWAGA: w tym momencie procedurę można przerwać, a reakcje przechowywać do 7 dni w temperaturze -15 °C. Jeśli płytka jest zamrożona, całkowicie rozmrozić przed rozpoczęciem 2. hybrydyzacji.
  3. 2. Hybrydyzacja
    1. Odwirować płytkę przez 1 minutę przy 280 x g w temperaturze 20 °C. Usunąć folię klejącą i dodać 50 μl NCT1, 10 μl CSO i 15 μl wody klasy PCR do 25 μl biblioteki. Ustaw pipetę na 100 μl i delikatnie pipetuj całą objętość w górę i w dół 10 razy.
    2. Uszczelnić płytkę i odwirować przez 1 minutę w temperaturze 280 x g w temperaturze 20 °C.
    3. Umieścić płytkę w termocyklerze (pokrywa podgrzana do 100 °C) i uruchomić program 2 (Tabela 1).

5. Wzbogacanie gDNA: Dzień 2, Popołudnie

  1. Przed rozpoczęciem
    1. Rozmrozić roztwory ET1, ET2, SMB, WS1, WS2, WS3 i HP3 w RT do mycia hybrydyzacyjnego. Z zestawu do wzbogacania DNA rozmrozić główną mieszankę PCR zawierającą polimerazę (TC-PMM), koktajl starterowy PCR (PPC) i roztwory RSB na lodzie w celu amplifikacji PCR.
  2. 2nd mycie hybrydyzacyjne
    1. Postępuj dokładnie tak samo jak w przypadku 4,2 – 1prania hybrydyzacyjnego.
  3. Amplifikacja PCR
    1. Na nowej 96-dołkowej płytce wymieszaj 20 μl elucji z kroku 5.2, 25 μl TC-PMM i 5 μl PPC. Ustaw pipetę na 50 μl i delikatnie pipetuj całą objętość w górę i w dół 10 razy. Uszczelnić płytkę i odwirować przez 1 minutę w temperaturze 280 x g w temperaturze 20 °C.
    2. Umieścić płytkę w termocyklerze (pokrywa podgrzana do 100 °C) i uruchomić program 3 (Tabela 1).

6. Wzbogacanie gDNA: Dzień 3

  1. Przed rozpoczęciem
    1. Rozmrozić roztwór RSB na lodzie. Co najmniej 30 minut przed użyciem przynieś oczyszczające kulki magnetyczne do RT.
  2. Oczyszczanie PCR
    1. Odwirować płytkę z kroku 5.3 przez 1 minutę przy 280 x g w temperaturze 20 °C i zdjąć osłonę kleju.
    2. W temperaturze pokojowej dodaj 90 μl wcześniej zmieszanych kulek magnetycznych do oczyszczania do każdej studzienki. Ustaw pipetę na 140 μl, delikatnie odpipetuj całą objętość w górę i w dół 10x. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Umieścić 96-dołkową płytkę na stojaku magnetycznym na 5 minut w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że supernatant wydaje się całkowicie przezroczysty.
    3. Przygotować świeży 80% roztwór etanolu (na 2 próbki dodać 200 μl wody destylowanej do 800 μl etanolu). Odrzucić sklarowany osad, uważając, aby nie naruszyć osadu.
    4. Trzymając płytkę na stojaku magnetycznym, dodaj 200 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu do każdej studzienki, nie naruszając kulek i inkubuj płytkę przez 30 sekund w temperaturze pokojowej. Odrzuć supernatant i powtórz to płukanie jeszcze raz. Upewnij się, że etanol został usunięty. Pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 15 minut lub do całkowitego odparowania etanolu, gdy płyta znajduje się na stojaku magnetycznym.
    5. Wyjmij płytkę ze stojaka magnetycznego i dodaj 30 μl buforu RSB. Ustaw pipetę na 30 μl i delikatnie odpipetuj całą objętość w górę i w dół 10 razy. Inkubować płytkę przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
    6. Umieścić 96-dołkową płytkę na stojaku magnetycznym i inkubować przez 5 minut lub do momentu, gdy supernatant okaże się całkowicie przezroczysty. Delikatnie przenieść 28 μl supernatantu do nowej płytki 96-dołkowej (typ płytki: TCY).
      UWAGA: Na tym etapie procedurę można przerwać, a reakcje przechowywać w temperaturze -15 °C przez okres do 7 dni.
  3. Walidacja i kwantyfikacja biblioteki
    1. Określ jakość biblioteki przy użyciu analizatora fragmentów. Elektroforeza w żelu akrylowym o wysokiej rozdzielczości może być stosowana w celu zastąpienia wyżej wymienionych kroków, ale nie jest zalecana. Fragmenty powinny mieć od 150 pz do 1 000 pz.
      UWAGA: Zalecane: Określ ilościowo bibliotekę za pomocą qPCR, aby uzyskać najlepszą liczbę klastrów podczas sekwencjonowania.
    2. Jako odniesienie użyj zweryfikowanej biblioteki (2 nM). Jeśli przygotowywana jest pierwsza biblioteka, należy użyć faga PhiX DNA (10 nM) dostarczonego do kalibracji urządzenia do sekwencjonowania.
    3. Przygotować seryjne rozcieńczenia kontroli dodatniej, aby uzyskać 7 punktów przy 20, 16, 8, 6, 4, 2 i 1 pM w EBT (bufor elucji EB + 0,1% Tween 20). Rozcieńczyć interesującą bibliotekę w proporcjach 1/1 000 i 1/2 000. Każdy punkt musi być analizowany w trzech egzemplarzach.
    4. Przygotuj następującą mieszaninę (pomnóż objętość przez liczbę użytych studzienek): dla 1 dołka dodać 10 μl sybr green zawierającego główną mieszankę qPCR (2x), 0,2 μl startera przedniego (10 μM, AATGATACGGCGACCGAGAT), 0,2 μl startera odwrotnego (10 μM, CAAGCAGAAGACGGCATACGA) i 7,6 μl wody klasy PCR.
    5. Po wymieszaniu umieścić na 96-dołkowej płytce, 18 μl mieszaniny do każdej studzienki i 2 μl kontroli pozytywnej i rozcieńczeń bibliotecznych. Uszczelnić płytkę i odwirować przez 1 minutę w temperaturze 280 x g w temperaturze 20 °C. Następnie umieścić płytkę w ilościowym termocyklerze PCR i uruchomić program 4 (Tabela 1).
    6. Przeanalizuj wyniki jako konwencjonalną bezwzględną kwantyfikację, aby uzyskać wydajność każdej biblioteki. Zaletą qPCR jest to, że określa ilościowo tylko DNA, które będzie oddziaływać z komórką przepływową.
      UWAGA: Nie należy stosować fluorymetrycznej kwantyfikacji DNA ze względu na obecność cząsteczek mimetycznych DNA w jednym z odczynników. Ta metoda kwantyfikacji przeszacowałaby wydajność biblioteki, a w konsekwencji zaniżyłaby wynik grupowania.
  4. Uruchamianie sekwencjonowania
    1. Rozcieńczyć każdą bibliotekę przy 4 nM w końcowej objętości 30 μl buforu elucyjnego (EB), połączyć wszystkie biblioteki i dobrze wymieszać.
    2. Przygotować świeży 0,2 N roztwór NaOH w buforze EB i zmieszać 10 μl tego roztworu NaOH z 10 μl połączonych bibliotek. Dobrze wymieszać i inkubować dokładnie 5 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Po upływie 5 minut należy natychmiast dodać 980 μl buforu hybrydyzacyjnego (z kartridża sekwencjonującego) i dobrze wymieszać. Następnie zmieszać 400 μl tej mieszaniny z 600 μl buforu hybrydyzacyjnego. Dobrze wymieszać i przenieść 600 μl do wkładu na 300 cykli (2 x 150) w celu wstrzyknięcia 8 pM. Uruchom sekwencjonowanie.

7. Analiza danych

  1. Gdy urządzenie przetworzy dane, przenieś pliki .bam i .vcf na nowy komputer.
    UWAGA: Fragmentacja transpozazy obejmuje ślady stóp. W związku z tym oprogramowanie automatycznie przycina te dane.
  2. Zbierz wariacje genetyczne uzyskane za pomocą analizy urządzenia.
  3. Analizuj wyeksportowane pliki (.bam, .vcf) za pomocą innego oprogramowania (Alamut), postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie porównaj wariacje genetyczne uzyskane za pomocą obu analiz. Tylko zmiany wykryte dwukrotnie są uważane za obecne.

Tabela 1. Warunki PCR

programtemperaturaGodzinaLiczba powtórzeń
172 °CCzas trwania: 3 min1
98 °C30 sekund1
98 °C10 sekund10
60 °C30 sekund
72 °C30 sekund
72 °CCzas trwania: 5 min1
10 °Cnieograniczony
295 °CCzas trwania: 10 min1
93 °C1 min1
91 °C1 min1
89 °C1 min1
87 °C1 min1
85 °C1 min1
83 °C1 min1
81 °C1 min1
79 °C1 min1
77 °C1 min1
75 °C1 min1
71 °C1 min1
69 °C1 min1
67 °C1 min1
65 °C1 min1
63 °C1 min1
61 °C1 min1
59 °C1 min1
58 °C1 min16-18 godz
398 °C30 sekund1
98 °C10 sekund10
60 °C30 sekund
72 °C30 sekund
72 °CCzas trwania: 5 min1
10 °Cnieograniczony
495 °CCzas trwania: 10 min1
95 °C15 sekund40
60 °C1 min

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wyniki kontroli jakości próbek

Zdolność tej metody do określania sekwencji genów docelowych zależy od jakości gDNA (Rysunek 2A) oraz jakości etapu tagmentacji. Jeśli tagmentacja jest niewystarczająca (Rysunek 2B, górny panel), sekwencjonowanie nie będzie satysfakcjonujące. Jak wspomniano powyżej, po oczyszczaniu po tagmentacji, gDNA powinno zostać poddane tagmentacji do fragmentów o długości od 150 bp do 1 000 bp, przy czym większość fragmentów powinna mieć długo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Powszechne stosowanie urządzeń i technologii NGS stworzyło nowe możliwości w badaniach nad nowotworami i zaburzeniami genetycznymi. Oprócz sekwencjonowania całego genomu lub sekwencjonowania RNA, analiza dużej ilości wybranych sekwencji gDNA u wielu pacjentów jednocześnie daje duże perspektywy diagnostyczne. W tym przypadku opracowaliśmy specjalny projekt (dostępny na żądanie) przy użyciu technologii Nextera do badania 11 kompletnych genów u 24 pacjentów jednocześnie za pomocą urządzenia do sekwencjonowania o średniej pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Ligue contre le Cancer de Côte d'Or i Centre Georges-François Leclerc za ich wsparcie finansowe. Dziękujemy Philipowi Bastable'owi za redakcję rękopisu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
MiSeqIlluminaSY-410-1001Urządzenie do sekwencjonowania/średniej przepustowości
Nextera Zestaw wzbogacający IlluminaFC-123-1208Technologia oparta na transpozazie
Katridż 300 cykliIllumina15033624
Koraliki AMPureBeckman CoulterA63881Magnetyczne kulki oczyszczające
Stojak magnetycznyAlpaquaA32782
96-dołkowe płytkiLife Technologies4306737
MIDI 96-dołkowe płytkiBioradAB0859
Mikropieczęć ABioradMSA-5001Ta uszczelka jest niezbędna tylko do amplifikacji PCR. Inne standardowe plomby mogą być używane przez cały czas trwania eksperymentu
MiSeqIlluminaWyposażony w urządzenie do sekwencjonowania
oprogramowanie Experiment Manager
Adres internetowy: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new
Narzędzie do tworzenia stron internetowych producenta

Bibliografia

  1. Cornelisse, C. J., Cornelis, R. S., Devilee, P. Genes responsible for familial breast cancer. Pathol. Res. Pract. 192 (7), 684-693 (1996).
  2. Culver, J., Lowstuter, K., Bowling, L. Assessing breast cancer risk and BRCA1/2 carrier probability. Breast Dis. 27, 5-20 (2007).
  3. Cox, D. G., et al. Common variants of the BRCA1 wild-type allele modify the risk of breast cancer in BRCA1 mutation carriers. Hum. Mol. Genet. 20 (23), 4732-4747 (2011).
  4. Maia, A. T., et al. Effects of BRCA2 cis-regulation in normal breast and cancer risk amongst BRCA2 mutation carriers. Breast Cancer Res. 14 (2), 63(2012).
  5. Anczuków, O., et al. BRCA2 deep intronic mutation causing activation of a cryptic exon: opening toward a new preventive therapeutic strategy. Clin. Cancer Res. 18 (18), 4903-4909 (2012).
  6. Brewster, B. L., et al. Identification of fifteen novel germline variants in the BRCA1 3'UTR reveals a variant in a breast cancer case that introduces a functional miR-103 target site. Hum. Mutat. 33 (12), 1665-1675 (2012).
  7. Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nat Rev Cancer. 12 (1), 68-78 (2012).
  8. Ma, X. D., et al. First evidence for the contribution of the genetic variations of BRCA1-interacting protein 1 (BRIP1) to the genetic susceptibility of cervical cancer. Gene. 524 (2), 208-213 (2013).
  9. Haanpää, M., Pylkäs, K., Moilanen, J. S., Winqvist, R. Evaluation of the need for routine clinical testing of PALB2 c.1592delT mutation in BRCA negative Northern Finnish breast cancer families. BMC Med. Genet. 14, 82(2013).
  10. Southey, M. C., Teo, Z. L., Winship, I. PALB2 and breast cancer: ready for clinical translation. Appl. Clin. Genet. 6, 43-52 (2013).
  11. Ulahannan, D., Kovac, M. B., Mulholland, P. J., Cazier, J. B., Tomlinson, I. Technical and implementation issues in using next-generation sequencing of cancers in clinical practice. Br. J. Cancer. 109, 827-835 (2013).
  12. Hernan, I., Borràs, E., de Sousa Dias, M., Gamundi, M. J., Mañé, B., Llort, G., Agúndez, J. A., Blanca, M., Carballo, M. Detection of genomic variations in BRCA1 and BRCA2 genes by long-range PCR and next-generation sequencing. J. Mol. Diagn. 14, 286-293 (2012).
  13. Knierim, E., Lucke, B., Schwarz, J. M., Schuelke, M., Seelow, D. Systematic comparison of three methods for fragmentation of long-range PCR products for next generation sequencing. Plos One. 6, e28240(2011).
  14. de Sousa Dias, M., Hernan, I., Pascual, B., Borràs, E., Mañé, B., Gamundi, M. J., Carballo, M. Detection of novel mutations that cause autosomal dominant retinitis pigmentosa in candidate genes by long-range PCR amplification and next-generation sequencing. Mol. Vis. 19, 654-664 (2013).
  15. The Breast Cancer Linkage Consortium. Cancer Risks in BRCA2 Mutation Carriers. J. Natl. Cancer Inst. 91, 1310-1316 (1999).
  16. Levy-Lahad, E., Friedman, E. Cancer risks among BRCA1 and BRCA2 mutation carriers. Br. J. Cancer. 96 (1), 11-15 (2007).
  17. Risch, H. A., et al. Population BRCA1 and BRCA2 mutation frequencies and cancer penetrances: a kin-cohort study in Ontario, Canada. J. Natl. Cancer Inst. 98 (23), 1694-1706 (2006).
  18. Slater, E. P., et al. PALB2 mutations in European familial pancreatic cancer families. Clin. Genet. 78, 490-494 (2010).
  19. Brennan, G. T., Relias, V., Saif, M. W. BRCA and pancreatic cancer. J.O.P. 14 (4), 325-328 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Technologia transpozazyanaliza BRCA1 i BRCA2sekwencjonowanie nowej generacjiwychwyt poprzez hybrydyzacjamplifikacja PCRoczyszczanie za pomoc kulek magnetycznychanalizator fragment wanaliza bioinformatyczna
Wzbogacanie gDNA za pomocą technologii opartej na transpozazie do analizy NGS całej sekwencji genów BRCA1, BRCA2 i 9 biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.