Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zwyrodnienie i regeneracja siatkówki wywołane przez metylonitromocznik (MNU) u danio pręgowanego: charakterystyka histologiczna i funkcjonalna

11.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51909

⸱

20 października 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Inselspital, University of Bern, 2Department of Ophthalmology, University Hospital of Basel, 3Department of Biology, University of Fribourg

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj pokazujemy ilościowe określenie de- i regeneracji siatkówki oraz jej wpływu na funkcje wzrokowe za pomocą N-metylo-N-nitrozourea u dorosłego danio pręgowanego. Utrata ostrości wzroku i zmniejszenie liczby fotoreceptorów wiązały się z proliferacją w wewnętrznej warstwie jądrowej. Całkowita regeneracja morfologiczna i funkcjonalna nastąpiła po 30 dniach od pierwszego zabiegu.

Streszczenie

Choroby zwyrodnieniowe siatkówki, np. barwnikowe zwyrodnienie siatkówki, z wynikającym z nich uszkodzeniem fotoreceptorów, odpowiadają za większość utraty wzroku w świecie przemysłowym. Modele zwierzęce mają kluczowe znaczenie dla badania takich chorób. W związku z tym specyficzna dla fotoreceptorów toksyna N-metylo-N-nitrozomocznika (MNU) jest szeroko stosowana u gryzoni w celu farmakologicznego wywoływania zwyrodnienia siatkówki. Wcześniej ustaliliśmy model zwyrodnienia siatkówki wywołanego przez MNU, u danio pręgowanego, innego popularnego systemu modelowego w badaniach wizualnych.

Fascynującą różnicą w stosunku do ssaków jest trwała neurogeneza w siatkówce dorosłego danio pręgowanego i jej regeneracja po uszkodzeniu. Aby określić ilościowo tę obserwację, zastosowaliśmy pomiary ostrości wzroku u dorosłego danio pręgowanego. W ten sposób odruch optokinetyczny został wykorzystany do śledzenia zmian funkcjonalnych u ryb nieznieczulonych. Uzupełniono to badaniem histologicznym, a także barwieniem immunohistochemicznym w kierunku apoptozy (TUNEL) i proliferacji (PCNA) w celu skorelowania rozwijających się zmian morfologicznych.

Podsumowując, apoptoza fotoreceptorów następuje trzy dni po leczeniu MNU, po której następuje wyraźna redukcja komórek w zewnętrznej warstwie jądrowej (ONL). Następnie obserwuje się proliferację komórek w wewnętrznej warstwie jądrowej (INL) i ONL. W tym miejscu ujawniamy, że nie tylko pełna regeneracja histologiczna, ale także funkcjonalna zachodzi w ciągu 30 dni. Teraz ilustrujemy metody ilościowego określania i monitorowania degeneracji i regeneracji siatkówki danio pręgowanego za pomocą MNU w formacie wideo.

Wprowadzenie

Wzrok jest najważniejszym zmysłem dla człowieka, a jego upośledzenie ma duży wpływ społeczno-ekonomiczny. W krajach rozwiniętych choroby zwyrodnieniowe siatkówki są główną przyczyną utraty wzroku i ślepoty wśród osób starszych 1. Przyczyna większości chorób zwyrodnieniowych siatkówki jest tylko częściowo poznana, a rozwiązania terapeutyczne mające na celu odzyskanie utraconego wzroku są bardzo ograniczone. Barwnikowe zwyrodnienie siatkówki jest typowym przykładem choroby zwyrodnieniowej siatkówki z pierwotną utratą fotoreceptorów 2-3. N-metylo-N-nitrozomocznik (MNU) indukuje zwyrodnienie siatkówki i dlatego jest szeroko stosowany u gryzoni do modelowania chorób z pierwotną śmiercią komórki fotoreceptora 4. Jest środkiem alkilującym i prowadzi do łagodnych i złośliwych nowotworów, które zwykle pojawiają się kilka miesięcy po ekspozycji 5-7. Ponadto powoduje specyficzną śmierć komórki fotoreceptorowej w krótkim okresie obserwacji. W związku z tym zaobserwowano utratę struktury warstwy siatkówki i znaczne ścieńczenie siatkówki w sposób zależny od stężenia. Komórki glejowe siatkówki były aktywowane, ale nie stwierdzono zmian w nabłonku barwnikowym siatkówki (RPE). Apoptoza związana ze stresem retikulum endoplazmatycznego (ER) wydaje się być główną ścieżką działania MNU w siatkówce 8.

Niedawno wprowadziliśmy MNU jako model chemiczny do wywoływania degeneracji fotoreceptorów u danio pręgowanego 9. Danio pręgowany (Danio rerio) stał się ważny w badaniach wizualnych między innymi ze względu na podobieństwa jego układu wzrokowego do innych kręgowców 10. Zewnętrzna siatkówka zawiera fotoreceptory, które można podzielić na cztery różne typy czopków o szczytowej czułości w ultrafiolecie, krótkiej, średniej i długiej długości fali widm widzialnych oraz jeden typ fotoreceptora pręcikowego. W wewnętrznej warstwie jądrowej (INL) znajdują się ciała komórkowe interneuronów dwubiegunowych, poziomych i amakrynowych, a także soma komórkowa komórek glejowych Mullera. W zewnętrznej warstwie splotowatej (OPL) powstają kontakty synaptyczne między fotoreceptorami a siatkówką wewnętrzną, natomiast warstwą komórkową najbliżej soczewki jest warstwa komórek zwojowych (GC), której składowe tworzą długie aksony składające się na nerw wzrokowy i przewód wzrokowy. Kontakty synaptyczne między komórkami zwojowymi a komórkami w wewnętrznej warstwie jądrowej powstają w wewnętrznej warstwie splotowatej (IPL) 11. RPE leży na zewnątrz siatkówki neurosensorycznej i otacza zewnętrzne segmenty fotoreceptora długimi mikrokosmkami wierzchołkowymi 12. Co więcej, danio pręgowany jest wysoce regeneracyjny i zdolny do odbudowy uszkodzonego mózgu, siatkówki, rdzenia kręgowego, serca i innych tkanek 13. Kiedy dochodzi do uszkodzenia siatkówki, komórki w INL, które uważa się za komórki Müllera, są aktywowane i mają potencjał do różnicowania się w różne typy komórek siatkówki. Ponadto generują również przodki pręcików, które znajdują się w ONL. Innym źródłem, które zaopatruje siatkówkę dorosłego danio pręgowanego w nowe komórki, jest rzęskowa strefa brzeżna. Źródło to jest potrzebne do osiągnięcia stałej gęstości fotoreceptorów pręcików w stale rosnącym oku danio pręgowanego 14.

Model MNU może być używany jako proste i powtarzalne podejście do degeneracji/regeneracji tkanki siatkówki. Ze względu na pewne podobieństwa procesów biologicznych u danio pręgowanego i u ludzi, może to otworzyć drzwi do identyfikacji zaangażowanych szlaków śmierci komórkowej i badań przesiewowych potencjalnych leków neuroprotekcyjnych. Opierając się na poprzednim badaniu przeprowadzonym przez naszą grupę, ilustrujemy teraz metody tego indukowanego przez MNU modelu degeneracji siatkówki i wynikającej z niej regeneracji, w tym zmian funkcjonalnych, za pomocą odpowiednich filmów laboratoryjnych 9.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty były zgodne z Oświadczeniem o wykorzystaniu zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Oczami (ARVO).

1. Zwierzęta

  1. Utrzymuj danio pręgowanego (Danio rerio) typu dzikiego (Danio rerio) szczepu AB (Oregon) w wieku od 6 do 12 miesięcy w standardowych warunkach w wodzie o temperaturze 26,5 °C i 14/10 godzinnym cyklu światła/ciemności 15.
  2. Postępuj zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami obowiązującymi w zaangażowanych instytucjach dotyczących doświadczeń na zwierzętach po zatwierdzeniu przez Kantonalny Urząd Weterynaryjny.

2. Leczenie MNU

  1. Przygotować wodę zawierającą 150 mg/l suchej masy N-metylo-N-nitrozomocznika (MNU). OSTROŻNOŚĆ! MNU jest toksyczny; może powodować raka, dziedziczne uszkodzenia genetyczne lub szkody dla nienarodzonego dziecka.
  2. Inkubować danio pręgowanego w wodzie zawierającej MNU przez 60 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Szybko opłucz danio pręgowanego świeżą wodą i umieść rybę w nowym akwarium bez MNU. Utrzymuj ryby w standardowych warunkach tak długo, jak jest to pożądane dla eksperymentów.

3. Pomiar ostrości wzroku

  1. Uruchom układ optomotoryczny, wybierz z menu "testowanie" i ustaw opcje na "Proste schody", "Ostrość (częstotliwość)" i "Losowe/oddzielne" 16.
  2. Zainstalować butelkę infuzyjną wypełnioną 500 ml wody około 1 m powyżej układu optomotorycznego.
  3. Umieść jednego danio pręgowanego w komorze badawczej i podłącz go do butelki infuzyjnej. Umieścić komorę badawczą w układzie optomotorycznym.
  4. Rozpocznij pomiar i obserwuj ruch gałek ocznych w czasie rzeczywistym na ekranie komputera. W ten sposób odpowiedź pozytywna ("tak") jest definiowana jako kolejne sakkady we właściwym kierunku, podczas gdy odpowiedź negatywna ("nie") reprezentuje przypadkowe ruchy gałek ocznych podobne do tych obserwowanych w przypadku nieruchomych siatek. Jeśli oczy danio pręgowanego wykazują trzy lub więcej następujących po sobie reakcji optokinetycznych (OKR), naciśnij "tak"; Jeśli nie, naciśnij "Nie".
  5. Wyodrębnij ostrość wzroku, która została obliczona przez oprogramowanie poprzez określenie progu częstotliwości przestrzennej bodźca optokinetycznego, w sekcji "Wyniki" w menu.

4. Histologia

  1. Poddaj danio pręgowanego eutanazji przez przedawkowanie metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu (200-300 mg/L) i wyłuszczej oczy.
  2. Utrwalić całe oczy w 4% paraformaldehydzie (PFA) w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (PBS) w temperaturze 4 °C przez 12 godzin, a następnie odwodnić próbki w serii stopniowanych alkoholi.
  3. Zanurz próbki w parafinie, przetnij odcinki 5 μm przez głowicę nerwu wzrokowego (ONH) i zamontuj je na szkiełku podstawowym.
  4. Zabarwić odparafinowane skrawki parafiny hemalem przez 4 minuty i zanurzyć szkiełka dwukrotnie w wodzie destylowanej, a następnie w 0,2% kwasie solnym i 0,8% amoniaku. Skrawki barwić eozyną przez 3 minuty po wytworzeniu się barwienia hemalamu w wodzie z kranu przez co najmniej 10 minut (H&E).
  5. Osadź odwodnione szkiełka w podłożu montażowym i obserwuj szkiełka pod mikroskopem świetlnym.

5. Immunohistochemia

  1. Znakowanie końcowego końca deoksynukleotydylotransferazy dUTP (TUNEL)
    1. Inkubować odparafinowane skrawki z 20 μg/ml proteinazy K w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Przemyć skrawki trzykrotnie buforowanym roztworem soli fizjologicznej Tris (TBS) przez 5 minut każda.
    2. Inkubować skrawki z 50 μl mieszaniny reakcyjnej TUNEL (10% roztwór znakujący i 90% roztwór enzymatyczny) w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C przez 60 min. Przemyć trzy razy TBS przez 5 min każda.
    3. Zamontuj szkiełka z medium montażowym zawierającym DAPI i obserwuj szkiełka pod mikroskopem fluorescencyjnym.
  2. Barwienie antygenem jądrowym proliferacji komórek (PCNA)
    1. Gotować odparafinowane skrawki w buforze do odzyskiwania antygenu (Tris-EDTA + 0,05% Tween 20, pH 9,0) przez 3 minuty i przemywać trzykrotnie TBS przez 5 minut każda. Blok ze 100 μl roztworu blokującego (TBS + 10% koziej normalnej surowicy + 1% albuminy surowicy bydlęcej, pH 7,6) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    2. Wybarwić pierwszorzędowymi przeciwciałami anty-PCNA w rozcieńczeniu 1:200 w wilgotnej komorze w temperaturze 4 °C przez noc. Umyj trzy razy za pomocą TBS + Tween 20 przez 5 minut każdy.
    3. Zakończyć wykrywanie odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi w rozcieńczeniu 1:500 w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    4. Zamontuj szkiełka z medium montażowym zawierającym DAPI i obserwuj szkiełka pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ostrość wzroku:

Układ eksperymentalny [częstotliwość przestrzenna: 0,042 circles/degree (c/d); kontrast: 100%; prędkość dryfu: 20 degrees/second (d/src); luminancja podświetlenia: 152 cd/m2] w niniejszym badaniu umożliwił ocenę OKR u dorosłych danio pręgowanych. Średni czas pomiaru VA wynosił około 5 – 10 minut dla każdej ryby, która dobrze znosiła procedurę. Ostrość wzroku przed ekspozycją na MNU wynosiła 0,577 ± 0,014 cycles/degree (c/d). Rysunek 1 przedstawia prz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wcześniej nasza grupa przeniosła model MNU degeneracji fotoreceptorów od gryzoni do systemu danio pręgowanego 9. Następujące po tym zdarzenia były opisywane i obserwowane przez okres do 30 dni. W tym okresie nastąpiło całkowite zwyrodnienie morfologiczne siatkówki i regeneracja po początkowym leczeniu. Po pierwsze, histologia ujawnia zmniejszoną liczbę pręcików od 3 dnia z minimum w 8 dniu. Odpowiednio, barwienie TUNEL identyfikuje apoptozę fotoreceptorów pręcików 3 dni po leczeniu MNU. Regeneracja rozpoczyna ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Monice Kilchenmann, Federice Bisignani i Agathe Dudzie za ich doskonałą pomoc techniczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas octowySigma-Aldrich, Buchs, SzwajcariaA6283
AmoniakSigma-Aldrich, Buchs, Szwajcaria2949930,80%
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-Aldrich, Buchs, Szwajcaria05470
Dako PenDako, Glostrup, DaniaS2002
Podłoże montażowe DAPIVector Labs, Burlingame, CA, USAH-1200
EozynaSigma-Aldrich, Buchs, Szwajcaria45260
EtanolSigma-Aldrich, Buchs, Szwajcaria2860100%, 96%, 70%
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Sigma-Aldrich, Buchs, SzwajcariaED
Sól metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etyluSigma-Aldrich, Buchs, SzwajcariaE10521Trikaina
EukittSigma-Aldrich, Buchs, Szwajcaria3989
Koza anty-królik Alexa 594Life Technologies, Zug, Szwajcaria A11012
Kozia normalna surowicaDako, Glostrup, DaniaX0907
Kwas solnySigma-Aldrich, Buchs, Szwajcaria3203310,20%
Zestaw do wykrywania śmierci komórkowej in situRoche Applied Sciences, Rotkreuz, Szwajcaria11684795910TUNEL
Kit Roztwór hemalumu MayeraMerck, Darmstadt, Niemcy109249
Methylnitrosourea (MNU)Sigma-Aldrich, Buchs, SzwajcariaN4766Toxic
OptoMotryCerebralMechanics, Lethbridge, AB, Kanadan.a.Paraformaldehyd
(PFA)Sigma-Aldrich, Buchs, SzwajcariaP6148
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Sigma-Aldrich, Buchs, SzwajcariaP5368
Proteinaza KDako, Glostrup, DanmarkS3004
Królik anty-PCNA Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Stany Zjednoczonesc-33756
Szkiełka szklane Superfrost PlusGehard Menzel GmbH, Brunszwik, Niemcy10149870
Sól fizjologiczna buforowana Tris (TBS)Sigma-Aldrich, Buchs, SzwajcariaP5912
Baza TrizmaSigma-Aldrich, Buchs, SzwajcariaT1503
Tween 20Sigma-Aldrich, Buchs, SzwajcariaP1379
XyleneSigma-Aldrich, Buchs, Szwajcaria534056
Danio rerio (Danio rerio) AB (Oregon)szczep Uniwersytet we Fryburgu, Wydział Biologiin.a.Własnyzakład rybny

Bibliografia

  1. Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
  2. Bhatti, M. T. Retinitis pigmentosa, pigmentary retinopathies, and neurologic diseases. Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 6 (5), 403-413 (2006).
  3. Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368, 1795-1809 (2006).
  4. Tsubura, A., Yoshizawa, K., Kuwata, M., Uehara, N. Animal models for retinitis pigmentosa induced by MNU; disease progression, mechanisms and therapeutic trials. Histol. Histopathol. 25, 233-248 (2010).
  5. Machida, K., Urano, K., Yoshimura, M., Tsutsumi, H., Nomura,, Usui, T. Carcinogenic comparative study on rasH2 mice produced by two breeding facilities. J. Toxicol. Sci. 33, 493-501 (2008).
  6. Morton, D., et al. N-Methyl-N-Nitrosourea (MNU): A positive control chemical for p53+/- mouse carcinogenicity studies. Toxicol. Pathol. 36, 926-931 (2008).
  7. Terracini, B., Testa, M. C. Carcinogenicity of a single administration of N-nitrosomethylurea: a comparison between newborn and 5-week-old mice and rats. 24, 588-598 (1970).
  8. Zulliger, R., Lecaudé, S., Eigeldinger-Berthou, S., Wolf-Schnurrbusch, U. E. K., Enzmann, V. Caspase-3-independent photoreceptor degeneration by N-methyl-N-nitrosourea (MNU) induces morphological and functional changes in the mouse retina. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 249, 859-869 (2011).
  9. Tappeiner, C., et al. Characteristics of rod regeneration in a novel zebrafish retinal degeneration model using N-methyl-N-nitrosourea (MNU). PLOS One. 12, (2013).
  10. Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. Int. J. Dev. Neurosci. 19, 621-629 (2001).
  11. Fleisch, C., Neuhauss, S. Visual Behavior in Zebrafish. Zebrafish. 3, 191-201 (2006).
  12. Hodel, C., Neuhauss, S. C. F., Biehmaier, O. Time course and development of light adaptation processes in the outer zebrafish retina. InterScience. 288, 653-662 (2006).
  13. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).
  14. Brockerhoff, S. E., Fadool, J. M. Genetics of photoreceptor degeneration and regeneration in zebrafish. Cell Mol. Life Sci. 68, 651-659 (2011).
  15. Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , IRL Press. 7-38 (2002).
  16. Tappeiner, C., Gerber, S., Enzmann, V., Balmer, J., Jazwinska, A., Tschopp, M. Visual acuity and contrast sensitivity of adult zebrafish. Front. Zool. 9 (1), 10(2012).
  17. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Exp. Eye Res. 91, 601-612 (2010).
  18. Nelson, C. M., Hyde, D. R. Müller glia as a source of neuronal progenitor cells to regenerate the damaged zebrafish retina. Adv. Exp. Med. Biol. 723, 425-430 (2012).
  19. Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Invest. Ophthalmol Vis. Sci. 45 (12), 4611-4616 (2004).
  20. Beck, J. C., Gilland, E., Tank, D. W., Baker, R. Quantifying the ontogeny of optokinetic and vestibulo-ocular behaviors in zebrafish, medaka, and goldfish. J. Neurophysiol. 92 (6), 3546-3561 (2004).
  21. Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. Regeneration of Inner Retinal Neurons after Intravitreal Injection of Ouabain in. Zebrafish. J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).
  22. Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev. Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
  23. Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Siatk wka ryby danio ostrobramowejtraktowanie MNUostro wzrokuodpowied optokinetycznaanaliza histologicznaapoptoza fotoreceptor wbarwienie PCNAbarwienie TUNELregeneracja siatk wki
Zwyrodnienie i regeneracja siatkówki wywołane przez metylonitromocznik (MNU) u danio pręgowanego: charakterystyka histologiczna i funkcjonalna
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.