Analiza ekspresji białek w młodych embrionalnych zastawkach myszy została utrudniona przez ograniczoną dostępną tkankę. Manuskrypt ten zawiera protokół przygotowania białka z rozwijających się embrionalnych obszarów zastawki myszy do analizy western blot.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja białka z rozwijającego się zarodkowego regionu zastawki serca myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Analiza Western blot jest powszechnie stosowaną techniką wykrywania i ilościowego określania poziomu białka. Jednak w przypadku małych próbek tkanek ta metoda analizy może nie być wystarczająco czuła, aby wykryć białko będące przedmiotem zainteresowania. Aby przezwyciężyć te trudności, przeanalizowaliśmy protokoły pozyskiwania białka z zastawek serca dorosłego człowieka i zmodyfikowaliśmy te protokoły dla rozwijających się wczesnych embrionalnych odpowiedników myszy. Krótko mówiąc, zarodkowe obszary zastawki aortalnej myszy, w tym zastawka aortalna i otaczająca ją ściana aorty, są gromadzone w minimalnej możliwej objętości buforu lizy na bazie Tris z inhibitorami proteazy. Jeśli jest to wymagane w oparciu o strategię hodowlaną, zarodki są genotypowane przed połączeniem czterech embrionalnych regionów zastawki aortalnej w celu homogenizacji. Po homogenizacji bufor próbki na bazie SDS jest używany do denaturacji próbki w celu przeprowadzenia na żelu SDS-PAGE, a następnie analizy western blot. Chociaż stężenie białka pozostaje zbyt niskie, aby można je było określić ilościowo za pomocą spektrofotometrycznych testów kwantyfikacji białek i pozostała próbka do kolejnych analiz, technika ta może być wykorzystana do skutecznego wykrywania i półilościowego oznaczania fosforylowanych białek za pomocą western blot z połączonych próbek czterech embrionalnych regionów zastawki aortalnej myszy w dniu 13,5, z których każdy daje około 1 μg białka. Technika ta będzie korzystna w badaniu aktywacji szlaku sygnalizacji komórkowej i poziomów ekspresji białek podczas wczesnego rozwoju zastawki embrionalnej myszy.
Wprowadzenie
Zdolność do identyfikacji i ilościowego określania poziomów ekspresji białek jest standardową techniką w eksperymentach na zwierzętach i komórkach. Jednak pomimo długotrwałego zainteresowania wczesnym rozwojem zastawki serca w embrionalnym, ocena ekspresji białka w tej specyficznej tkance podczas rozwoju jest obecnie ograniczona do immunohistochemii zarówno u piskląt, jak i myszy1,2. Jedną z trudności w ilościowym określeniu ekspresji białka w rozwijających się zastawkach większości organizmów modelowych (np. piskląt i myszy) jest mały rozmiar zastawek, który ogranicza ilość białka, którą można uzyskać. W związku z tym w przypadku analiz ilościowyc....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Północnej Karoliny w Chapel Hill.
1. Wyciąć zastawkę aortalną
- Stosując zatwierdzoną technikę eutanazji dla interesującego nas etapu embrionalnego, należy poddać eutanazji ciężarną mysz ze szczeniętami w pożądanym dniu rozwoju embrionalnego (E).
- Użyj 70% etanolu do sterylizacji brzucha ciężarnej samicy. Podnieś skórę i mięśnie dolnej części brzucha do góry i odsuń od narządów wewnętrznych, a następnie rozetnij dolną jamę brzuszną samicy, aby umożliwić dostęp do rogu macicy.
- Aby od....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Stosując tę technikę przygotowania, byliśmy w stanie wykryć fosforylowane Smad1,5,8 (pSmad) w pojedynczych obszarach zastawki aorty embrionów w stadium E13.5. Jak pokazano na Rysunku 1A, białko wyizolowane nawet z jednego obszaru zastawki jest wystarczające do wykrycia słabej prążka pSmad. Intensywność sygnału zwiększa się proporcjonalnie do liczby połączonych obszarów zastawki. Co ważne, stosunek pSmad/β-aktyna pozostaje niemal stały dla różnych rozmiarów próbek (Rysunek 1C)........
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Możliwość ilościowego określania poziomów białka we wczesnych zarodkach zastawek serca myszy i kurcząt stanowi dodatkowe narzędzie do zrozumienia krytycznych zdarzeń sygnalizacji komórkowej dla rozwoju zastawek. Nasz protokół opisany w niniejszym dokumencie nie różni się znacznie od standardowych procedur izolacji białek. Jednak modyfikując kilka kluczowych kroków, udało nam się uzyskać fosforylowane białka z wyjątkowo małych rozmiarów próbek. Aby osiągnąć ten wynik, szczególne znaczenie mają następujące kroki. Aby zapew.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Andrei Portbury i Davinowi Townleyowi-Tilsonowi za krytyczną lekturę manuskryptu oraz NIH (grant # R01HL061656) za wsparcie finansowe.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Mysz | Do wypreparowania w fazie embrionalnej będącej przedmiotem zainteresowania | ||
| Mikroskop stereoskopowy | Nikon | SMZ645 | |
| 0,1 M Tris, pH 7,6 | |||
| Mikronożyczki | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Cienkie kleszcze, #5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Igła do preparowania posiadacze | Ted Pella Inc. | 13560 | |
| Igły do preparowania | Ted Pella Inc. | 13561-10 | |
| Mikropipeta, 20 μ l, z końcówkami | |||
| Bufor | 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% | ||
| Triton PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Dodać 1 tabletkę do 10 ml buforu do lizy |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | |
| Koraliki ze stali nierdzewnej | Qiagen | 69989 | |
| Mikrowirówka |
Bibliografia
- Wirrig, E. E., Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Differential expression of cartilage and bone-related proteins in pediatric and adult diseased aortic valves. J Mol Cell Cardiol. 50, 561-569 (2011).
- Chakraborty, S., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
