Artykuł metodologiczny

Izolacja białka z rozwijającego się zarodkowego regionu zastawki serca myszy

DOI:

10.3791/51911

⸱

23 września 2014

 ,  , 
1McAllister Heart Institute, University of North Carolina at Chapel Hill, 2New York-Presbyterian Hospital/Weill-Cornell Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza ekspresji białek w młodych embrionalnych zastawkach myszy została utrudniona przez ograniczoną dostępną tkankę. Manuskrypt ten zawiera protokół przygotowania białka z rozwijających się embrionalnych obszarów zastawki myszy do analizy western blot.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza Western blot jest powszechnie stosowaną techniką wykrywania i ilościowego określania poziomu białka. Jednak w przypadku małych próbek tkanek ta metoda analizy może nie być wystarczająco czuła, aby wykryć białko będące przedmiotem zainteresowania. Aby przezwyciężyć te trudności, przeanalizowaliśmy protokoły pozyskiwania białka z zastawek serca dorosłego człowieka i zmodyfikowaliśmy te protokoły dla rozwijających się wczesnych embrionalnych odpowiedników myszy. Krótko mówiąc, zarodkowe obszary zastawki aortalnej myszy, w tym zastawka aortalna i otaczająca ją ściana aorty, są gromadzone w minimalnej możliwej objętości buforu lizy na bazie Tris z inhibitorami proteazy. Jeśli jest to wymagane w oparciu o strategię hodowlaną, zarodki są genotypowane przed połączeniem czterech embrionalnych regionów zastawki aortalnej w celu homogenizacji. Po homogenizacji bufor próbki na bazie SDS jest używany do denaturacji próbki w celu przeprowadzenia na żelu SDS-PAGE, a następnie analizy western blot. Chociaż stężenie białka pozostaje zbyt niskie, aby można je było określić ilościowo za pomocą spektrofotometrycznych testów kwantyfikacji białek i pozostała próbka do kolejnych analiz, technika ta może być wykorzystana do skutecznego wykrywania i półilościowego oznaczania fosforylowanych białek za pomocą western blot z połączonych próbek czterech embrionalnych regionów zastawki aortalnej myszy w dniu 13,5, z których każdy daje około 1 μg białka. Technika ta będzie korzystna w badaniu aktywacji szlaku sygnalizacji komórkowej i poziomów ekspresji białek podczas wczesnego rozwoju zastawki embrionalnej myszy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność do identyfikacji i ilościowego określania poziomów ekspresji białek jest standardową techniką w eksperymentach na zwierzętach i komórkach. Jednak pomimo długotrwałego zainteresowania wczesnym rozwojem zastawki serca w embrionalnym, ocena ekspresji białka w tej specyficznej tkance podczas rozwoju jest obecnie ograniczona do immunohistochemii zarówno u piskląt, jak i myszy1,2. Jedną z trudności w ilościowym określeniu ekspresji białka w rozwijających się zastawkach większości organizmów modelowych (np. piskląt i myszy) jest mały rozmiar zastawek, który ogranicza ilość białka, którą można uzyskać. W związku z tym w przypadku analiz ilościowych badacze zazwyczaj polegają na ekstrakcji i amplifikacji RNA w celu późniejszej ilościowej analizy PCR lub mikromacierzy2-5. Jednak poziomy ekspresji RNA i białek nie są w pełni skorelowane6, więc skupienie się na ekspresji RNA nie może zapewnić rygorystycznego opisu licznych zmian, które zachodzą w dowolnym szlaku sygnałowym w różnych momentach rozwoju. Opierając się na tym ograniczeniu w obecnie dostępnej metodologii, celem tej procedury było opracowanie protokołu wiarygodnego uzyskiwania wystarczających ilości białka z rozwijających się zarodków zastawki serca myszy do analizy ilościowej zmian zachodzących w różnych szlakach sygnałowych, które są ważne w dojrzewaniu tej tkanki.

Zastawki embrionalne są już powszechnie wycinane od myszy w celu izolacji RNA i późniejszej analizy ekspresji genów2-5. Jednak badania te ograniczyły się do wykorzystania ekspresji genów jako odczytu aktywacji szlaku sygnałowego, co nie pozwala na wykrycie potranslacyjnych modyfikacji białek, które mogą wpływać na dalszą sygnalizację. Wykorzystując techniki izolacji RNA jako punkt wyjścia, zaczęliśmy od analizy interesujących nas regionów. Ponieważ naszym zainteresowaniem było wykrycie fosforylowanych białek, które wskazywały na aktywność szlaku sygnałowego w określonym okresie rozwoju zastawki aortalnej (E13,5-14,5), przeprowadziliśmy wszystkie sekcje w bezfosforanowym buforze Tris i zebraliśmy zastawki w buforze do lizy na bazie Tris z inhibitorami fosfatazy i proteazy. W naszym konkretnym przypadku pobrano tylko okolice zastawki aortalnej, ale w tym samym czasie można było łatwo uzyskać obszar zastawki płucnej. Obszary zastawek zostały następnie zhomogenizowane i połączone z buforem próbki, który jest obecnie używany do badania ekspresji białek w zastawkach serca dorosłych7. Wykorzystując małe objętości próbek (np. 2 μl) i łącząc regiony zastawek z zarodków o tym samym genotypie, byliśmy w stanie wykryć fosforylowane i niefosforylowane białka w 13,5 dniu embrionalnym. Ponieważ obszary zastawki mogą być zamrażane i przechowywane w buforze do lizy, zarodki można w razie potrzeby genotypować przed połączeniem.

Ta technika poszerza zestaw dostępnych narzędzi do oceny szlaków sygnalizacji komórkowej podczas rozwoju i stanowi ilościowe uzupełnienie immunohistochemii, szczególnie dla rozwijających się zastawek serca. Technika ta powinna być korzystna nie tylko dla kardiologów rozwojowych, ale także dla wszystkich biologów rozwojowych, którzy pracują z zarodkami we wczesnym stadium rozwoju, są zainteresowani regionami zawierającymi ograniczoną tkankę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Północnej Karoliny w Chapel Hill.

1. Wyciąć zastawkę aortalną

  1. Stosując zatwierdzoną technikę eutanazji dla interesującego nas etapu embrionalnego, należy poddać eutanazji ciężarną mysz ze szczeniętami w pożądanym dniu rozwoju embrionalnego (E).
  2. Użyj 70% etanolu do sterylizacji brzucha ciężarnej samicy. Podnieś skórę i mięśnie dolnej części brzucha do góry i odsuń od narządów wewnętrznych, a następnie rozetnij dolną jamę brzuszną samicy, aby umożliwić dostęp do rogu macicy.
  3. Aby odzyskać róg macicy, przytrzymaj szyjkę macicy kleszczami i ostrożnie przytnij ogon do kleszczy. Podnieś róg macicy, przecinając tkankę łączną, która utrzymuje róg na miejscu, i zakończ usuwanie, przecinając połączenie rogu macicy z jajowodem.
  4. Umieść wypreparowany róg macicy na szalce Petriego zawierającej zimny 0,1 M bufor Tris (pH 7,6) i spłucz w razie potrzeby. Następnie rozetnij róg macicy wzdłuż, aby odsłonić woreczki embrionalne.
  5. Aby odsłonić zarodek, należy rozciąć worek embrionalny na styku łożyska i zarodka i przeciąć naczynia pępowinowe, aby uwolnić zarodek. Umieścić wypreparowany zarodek na drugiej szalce Petriego z zimnym 0,1 M buforem Tris. Umieść pierwszą szalkę Petriego z pozostałymi niewypreparowanymi zarodkami do lodu, aż będzie gotowa na następny zarodek.
  6. Aby poprawić dostęp do ściany klatki piersiowej w obrębie zarodka, odetnij głowę zarodka. Jeśli konieczne jest genotypowanie, należy usunąć i zachować dodatkowy fragment tkanki w probówce Eppendorfa umieszczonej na lodzie.
  7. Umieść zarodek na plecach i przetnij ścianę klatki piersiowej pionowo wzdłuż boku klatki piersiowej, w pobliżu kończyny przedniej i poziomo nad przeponą, aby uwidocznić serce. Następnie otwórz ścianę klatki piersiowej, aby odsłonić serce.
  8. Używając kleszczy, aby trzymać się wysoko wzdłuż wielkich naczyń, podnieś serce za pomocą kleszczy i przetnij naczynia poniżej. Następnie przetnij nad kleszczami, aby uwolnić serce. Jeśli naczynia płucne pozostają nieprzecięte, płuca mogą zostać usunięte wraz z sercem i powinny zostać usunięte przed kontynuacją.
  9. Przeciąć i usunąć tętnicę płucną powyżej poziomu zastawki; w etapach embrionalnych opisanych w niniejszym dokumencie tętnica płucna jest lekko nieprzezroczysta, co pomaga w jej odróżnieniu od obszaru zastawki. Przeciąć tuż poniżej zastawki płucnej, omijając mięsień sercowy komory z bebekulacją i zebrać zgodnie z opisem w kroku 1.10, jeśli ten obszar jest również interesujący. Tutaj i w następnym kroku użyj działania kapilarnego, aby odciągnąć nadmiar buforu Tris od obszaru zainteresowania przed zebraniem w buforze do lizy.
  10. Ostrożnie usuń aortę dystalną do zastawki aortalnej, tuż nad poziomem zastawki; podobnie jak tętnica płucna, aorta pozostaje lekko nieprzezroczysta w tych stadiach embrionalnych, pomagając w jej usunięciu. Przeciąć tuż poniżej zastawki aortalnej, ponownie omijając mięsień sercowy komory poprzecznej, i przenieść zastawkę za pomocą kleszczy do probówki Eppendorfa z 2 μl buforu do lizy (opisanego w tabeli materiałów) zawierającego inhibitory proteazy i fosfatazy na lodzie.
  11. Powtarzaj kroki 1.6-1.10 aż do wycięcia zastawek ze wszystkich zarodków, zbierając każdą zastawkę do oddzielnej probówki Eppendorfa. Jeśli wszystkie zarodki mają ten sam genotyp, wszystkie zastawki można pobrać do jednej probówki Eppendorfa.
  12. Jeżeli ma być przeprowadzone genotypowanie w celu określenia, które zawory należy połączyć razem, należy natychmiast umieścić próbki w buforze do lizy w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia. Próbki można następnie połączyć po genotypowaniu (krok 2.1.1).

2. Ekstrakcja białka

  1. Rozmrozić zebrane tkanki na lodzie i odwirować przy 13 100 x g przez 1 minutę, aby zebrać tkanki w buforze do lizy na dnie probówki.
    1. Jeśli zarodki zostały zgenotypowane, użyj pipety, aby delikatnie zebrać i zebrać bufor do lizy zawierający obszary zastawki od zarodków o podobnych genotypach. Aby zapewnić mocne prążki, zaleca się zebranie 3-4 regionów zastawki z zarodków E13,5 na próbkę.
    2. Jeśli wszystkie zarodki miały ten sam genotyp i wszystkie obszary zastawek zostały zebrane razem w kroku 1.10, poddaj lizie całą próbkę, jak opisano w kroku 2.2.
  2. Sprawdzić objętość otrzymanej próbki zbiorczej i dodać bufor do lizy do całkowitej objętości 40 μl, a następnie rozdrobnić i homogenizować próbki za pomocą kulek ze stali nierdzewnej o średnicy 5 mm w probówkach Eppendorfa. Uruchom lizer na 2-4 minuty przy 50 Hz, zgodnie z instrukcjami producenta. Krótko zakręć probówkami (~13 100 x g przez 1 minutę) i przenieś próbki do nowych probówek, pozostawiając nierozpuszczalne zanieczyszczenia.
  3. Przygotować i oddzielić próbki do SDS-PAGE i przenieść do późniejszej analizy western blot, zgodnie z protokołem takim jak Eslami i wsp. 9. Blotting dla białka kontrolującego obciążenie jest niezbędny do ilościowego oznaczania białka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z tej techniki przygotowania, udało nam się wykryć fosforylowany Smad1,5,8 (pSmad) w pojedynczych obszarach zastawki aortalnej z zarodków E13.5. Jak pokazano na rysunku 1A, białko wyizolowane nawet z pojedynczego obszaru zastawki jest wystarczające do wykrycia słabego pasma pSmad. Intensywność sygnału wzrasta proporcjonalnie do liczby obszarów zaworu, które są połączone. Co ważne, stosunek pSmad/β-aktyna pozostaje prawie stały w różnych rozmiarach próbek (ryc. 1C)....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Możliwość ilościowego określania poziomów białka we wczesnych zarodkach zastawek serca myszy i kurcząt stanowi dodatkowe narzędzie do zrozumienia krytycznych zdarzeń sygnalizacji komórkowej dla rozwoju zastawek. Nasz protokół opisany w niniejszym dokumencie nie różni się znacznie od standardowych procedur izolacji białek. Jednak modyfikując kilka kluczowych kroków, udało nam się uzyskać fosforylowane białka z wyjątkowo małych rozmiarów próbek. Aby osiągnąć ten wynik, szczególne znaczenie mają następujące kroki. Aby zapew...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Andrei Portbury i Davinowi Townleyowi-Tilsonowi za krytyczną lekturę manuskryptu oraz NIH (grant # R01HL061656) za wsparcie finansowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
MyszDo wypreparowania w fazie embrionalnej będącej przedmiotem zainteresowania
Mikroskop stereoskopowyNikonSMZ645
0,1 M Tris, pH 7,6
MikronożyczkiFine Science Tools15003-08
Cienkie kleszcze, #5Fine Science Tools11251-30
Igła do preparowania posiadaczeTed Pella Inc.13560
Igły do preparowaniaTed Pella Inc.13561-10
Mikropipeta, 20 μ l, z końcówkami
Bufor50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1%
Triton PhosSTOPRoche4906845001Dodać 1 tabletkę do 10 ml buforu do lizy
TissueLyser LTQiagen85600
Koraliki ze stali nierdzewnejQiagen69989
Mikrowirówka
w ciąży w czasie do lizy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wirrig, E. E., Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Differential expression of cartilage and bone-related proteins in pediatric and adult diseased aortic valves. J Mol Cell Cardiol. 50, 561-569 (2011).
  2. Chakraborty, S., et al. Twist1 promotes heart valve cell proliferation and extracellular matrix gene expression during development in vivo and is expressed in human diseased aortic valves. Dev Biol. 347, 167-179 (2010).
  3. Lee, M. P., Yutzey, K. E. Twist1 directly regulates genes that promote cell proliferation and migration in developing heart valves. PLoS One. 6 (e29758), (2011).
  4. Peacock, J. D., Huk, D. J., Ediriweera, H. N., Lincoln, J. Sox9 transcriptionally represses Spp1 to prevent matrix mineralization in maturing heart valves and chondrocytes. PLoS One. 6 (e26769), (2011).
  5. Chakraborty, S., Cheek, J., Sakthivel, B., Aronow, B. J., Yutzey, K. E. Shared gene expression profiles in developing heart valves and osteoblast progenitor cells. Physiol Genomics. 35, 75-85 (2008).
  6. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13, 227-232 (2012).
  7. Meng, X., et al. Expression of functional Toll-like receptors 2 and 4 in human aortic valve interstitial cells: potential roles in aortic valve inflammation and stenosis. Am J Physiol Cell Physiol. 294, 29-35 (2008).
  8. Dyer, L. A., Wu, Y., Moser, M., Patterson, C. BMPER-induced BMP signaling promotes coronary artery remodeling. Developmental Biology. 386, 385-394 (2014).
  9. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
  10. Garside, V. C., Chang, A. C., Karsan, A., Hoodless, P. A. Co-ordinating Notch, BMP, and TGF-beta signaling during heart valve development. Cell Mol Life Sci. 70, 2899-2917 (2013).
  11. Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M. Fate of the mammalian cardiac neural. Development. 127, 1607-1616 (2000).
  12. Scherptong, R. W., et al. Morphogenesis of outflow tract rotation during cardiac development: the pulmonary push concept. Dev Dyn. 241, 1413-1422 (2012).
  13. Mohler, E. R., Adam 3rd, L. P., McClelland, P., Graham, L., Hathaway, D. R. Detection of osteopontin in calcified human aortic valves. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 547-552 (1997).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Western Blot AnalysisTissue DissectionTris Lysis BufferSDS PAGE GelPhosphorylated ProteinsCell Signaling PathwayAortic Valve RegionEmbryonic Day 13 5

Powiązane artykuły