Izolacja białka z rozwijającego się zarodkowego regionu zastawki serca myszy

Summary

Analiza ekspresji białek w młodych embrionalnych zastawkach myszy została utrudniona przez ograniczoną dostępną tkankę. Manuskrypt ten zawiera protokół przygotowania białka z rozwijających się embrionalnych obszarów zastawki myszy do analizy western blot.

Abstract

Analiza Western blot jest powszechnie stosowaną techniką wykrywania i ilościowego określania poziomu białka. Jednak w przypadku małych próbek tkanek ta metoda analizy może nie być wystarczająco czuła, aby wykryć białko będące przedmiotem zainteresowania. Aby przezwyciężyć te trudności, przeanalizowaliśmy protokoły pozyskiwania białka z zastawek serca dorosłego człowieka i zmodyfikowaliśmy te protokoły dla rozwijających się wczesnych embrionalnych odpowiedników myszy. Krótko mówiąc, zarodkowe obszary zastawki aortalnej myszy, w tym zastawka aortalna i otaczająca ją ściana aorty, są gromadzone w minimalnej możliwej objętości buforu lizy na bazie Tris z inhibitorami proteazy. Jeśli jest to wymagane w oparciu o strategię hodowlaną, zarodki są genotypowane przed połączeniem czterech embrionalnych regionów zastawki aortalnej w celu homogenizacji. Po homogenizacji bufor próbki na bazie SDS jest używany do denaturacji próbki w celu przeprowadzenia na żelu SDS-PAGE, a następnie analizy western blot. Chociaż stężenie białka pozostaje zbyt niskie, aby można je było określić ilościowo za pomocą spektrofotometrycznych testów kwantyfikacji białek i pozostała próbka do kolejnych analiz, technika ta może być wykorzystana do skutecznego wykrywania i półilościowego oznaczania fosforylowanych białek za pomocą western blot z połączonych próbek czterech embrionalnych regionów zastawki aortalnej myszy w dniu 13,5, z których każdy daje około 1 μg białka. Technika ta będzie korzystna w badaniu aktywacji szlaku sygnalizacji komórkowej i poziomów ekspresji białek podczas wczesnego rozwoju zastawki embrionalnej myszy.

Introduction

Zdolność do identyfikacji i ilościowego określania poziomów ekspresji białek jest standardową techniką w eksperymentach na zwierzętach i komórkach. Jednak pomimo długotrwałego zainteresowania wczesnym rozwojem zastawki serca w embrionalnym, ocena ekspresji białka w tej specyficznej tkance podczas rozwoju jest obecnie ograniczona do immunohistochemii zarówno u piskląt, jak i myszy^1,2. Jedną z trudności w ilościowym określeniu ekspresji białka w rozwijających się zastawkach większości organizmów modelowych (np. piskląt i myszy) jest mały rozmiar zastawek, który ogranicza ilość białka, którą można uzyskać. W związku z tym w przypadku analiz ilościowyc....

Protocol

UWAGA: Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Północnej Karoliny w Chapel Hill.

1. Wyciąć zastawkę aortalną

1. Stosując zatwierdzoną technikę eutanazji dla interesującego nas etapu embrionalnego, należy poddać eutanazji ciężarną mysz ze szczeniętami w pożądanym dniu rozwoju embrionalnego (E).
2. Użyj 70% etanolu do sterylizacji brzucha ciężarnej samicy. Podnieś skórę i mięśnie dolnej części brzucha do góry i odsuń od narządów wewnętrznych, a następnie rozetnij dolną jamę brzuszną samicy, aby umożliwić dostęp do rogu macicy.
3. Aby od....

Results

Korzystając z tej techniki przygotowania, udało nam się wykryć fosforylowany Smad^1,5,8 (pSmad) w pojedynczych obszarach zastawki aortalnej z zarodków E13.5. Jak pokazano na rysunku 1A, białko wyizolowane nawet z pojedynczego obszaru zastawki jest wystarczające do wykrycia słabego pasma pSmad. Intensywność sygnału wzrasta proporcjonalnie do liczby obszarów zaworu, które są połączone. Co ważne, stosunek pSmad/β-aktyna pozostaje prawie stały w różnych rozmiarach próbek (ryc. 1C)........

Discussion

Możliwość ilościowego określania poziomów białka we wczesnych zarodkach zastawek serca myszy i kurcząt stanowi dodatkowe narzędzie do zrozumienia krytycznych zdarzeń sygnalizacji komórkowej dla rozwoju zastawek. Nasz protokół opisany w niniejszym dokumencie nie różni się znacznie od standardowych procedur izolacji białek. Jednak modyfikując kilka kluczowych kroków, udało nam się uzyskać fosforylowane białka z wyjątkowo małych rozmiarów próbek. Aby osiągnąć ten wynik, szczególne znaczenie mają następujące kroki. Aby zapew.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mysz			Do wypreparowania w fazie embrionalnej będącej przedmiotem zainteresowania
Mikroskop stereoskopowy	Nikon	SMZ645
0,1 M Tris, pH 7,6
Mikronożyczki	Fine Science Tools	15003-08
Cienkie kleszcze, #5	Fine Science Tools	11251-30
Igła do preparowania posiadacze	Ted Pella Inc.	13560
Igły do preparowania	Ted Pella Inc.	13561-10
Mikropipeta, 20 μ l, z końcówkami
Bufor			50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1%
Triton PhosSTOP	Roche	4906845001	Dodać 1 tabletkę do 10 ml buforu do lizy
TissueLyser LT	Qiagen	85600
Koraliki ze stali nierdzewnej	Qiagen	69989
Mikrowirówka