Przedstawiamy protokół korzystania z systemu radio-telemetrycznego do rejestrowania parametrów sercowo-naczyniowych u szczurów z transektem rdzenia kręgowego T4 osiem tygodni po przeszczepieniu embrionalnej nerwowej komórki macierzystej pnia mózgu w miejsce uszkodzenia. Telemetria to zaawansowana technika dokładnej oceny funkcji układu krążenia u przytomnych, swobodnie poruszających się szczurów z uszkodzeniem rdzenia kręgowego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
System radiotelemetryczny do monitorowania funkcji układu krążenia u szczurów z przecięciem rdzenia kręgowego i przeszczepami embrionalnych nerwowych komórek macierzystych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wysoki uraz rdzenia kręgowego w odcinku piersiowym lub szyjnym (SCI) może prowadzić do dysfunkcji układu krążenia. Aby monitorować parametry sercowo-naczyniowe, wszczepiliśmy cewnik podłączony do nadajnika radiowego do tętnicy udowej szczurów, które przeszły przecięcie rdzenia kręgowego T4 z lub bez przeszczepu embrionalnych nerwowych komórek macierzystych pochodzących z pnia mózgu eksprymujących białko zielonej fluorescencji. W porównaniu z innymi metodami, takimi jak wprowadzenie kaniuli lub mankiet ogonowy, telemetria jest korzystna do ciągłego monitorowania ciśnienia krwi i tętna u swobodnie poruszających się zwierząt. Jest również zdolny do długoterminowego wielokrotnego pozyskiwania danych. U szczurów z uszkodzeniem rdzenia kręgowego z powodzeniem zarejestrowano podstawowe dane sercowo-naczyniowe w stanie nieskrępowanym i dysrefleksji autonomicznej w odpowiedzi na rozdęcie jelita grubego. Ponadto parametry sercowo-naczyniowe przed i po SCI można porównać u tego samego szczura, jeśli nadajnik zostanie wszczepiony przed przecięciem rdzenia kręgowego. Jednym z ograniczeń opisanej procedury telemetrii jest to, że implantacja w tętnicy udowej może wpływać na dopływ krwi do ipsilateralnej kończyny tylnej.
Wprowadzenie
Dysfunkcja układu sercowo-naczyniowego występuje po urazie rdzenia kręgowego (SCI) na wysokim poziomie. Objawia się zaburzeniami ciśnienia krwi i tętna w spoczynku, niedociśnieniem ortostatycznym, niedociśnieniem wywołanym wysiłkiem fizycznym i dysrefleksją autonomiczną charakteryzującą się epizodami nadciśnienia tętniczego i bradykardią za pośrednictwem barorefleksji w odpowiedzi na bodźce czuciowe poniżej poziomu urazu1,2. Objawy te zakłócają codzienne życie pacjentów z uszkodzeniem rdzenia kręgowego. Dlatego ważne jest, aby ustanowić skuteczne narzędzia do badania zmian sercowo-naczyniowych u zwierząt z SCI i eksperymentalnych metod leczenia.
Aby zbadać funkcje układu krążenia u zwierząt, użyto kilku technik monitorowania ciśnienia krwi i tętna. Centralne parametry sercowo-naczyniowe można rejestrować za pomocą wprowadzenia kaniuli i telemetrii, podczas gdy nieinwazyjne mankiety ogonowe mogą być stosowane do pomiaru obwodowego ciśnienia krwi3. W porównaniu z innymi metodami, telemetria ma tę główną zaletę, że pozwala na ciągłą rejestrację u swobodnie poruszających się zwierząt i długoterminowe monitorowanie funkcji układu sercowo-naczyniowego4. W modelach zwierzęcych SCI zmiany ciśnienia krwi obwodowej po stymulacji eksperymentalnej mogą nie być wystarczająco duże, aby można je było wykryć. W związku z tym należy wybrać odpowiednią technikę monitorowania serca dla zwierząt z SCI.
W obecnym badaniu wprowadzono system radio-telemetryczny do monitorowania funkcji układu krążenia u dorosłych szczurów po całkowitym przecięciu rdzenia kręgowego. Szczury otrzymały przeszczepy syngenicznych komórek macierzystych pochodzących z pnia mózgu (E14) pochodzących z pnia mózgu (BS-NSC) w miejscu uszkodzenia. Szczury z obrażeniami i bez przeszczepu oraz naiwne, nieranne szczury służyły jako kontrole. Procedura telemetrii obejmuje sterylizację i implantację nadajnika (ryc. 1), rejestrację podstawowych parametrów sercowo-naczyniowych, reakcje wywołane rozdęciem jelita grubego oraz czyszczenie i przechowywanie nadajnika.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC). Wytyczne NIH dotyczące opieki i bezpieczeństwa zwierząt laboratoryjnych są ściśle przestrzegane. Zwierzęta z zabiegami chirurgicznymi były odpowiednio leczone w celu zminimalizowania bólu i dyskomfortu.
1. Krzywizna rdzenia kręgowego i przeszczepianie komórek
- Autoklaw narzędzi chirurgicznych przed wszystkimi operacjami. Użyj sterylizatora gorących kulek (Fine Science Tools), aby usunąć patogeny i zanieczyszczenia mikrobiologiczne z narzędzi między zabiegami na różnych zwierzętach. Podczas operacji należy używać sterylnych rękawiczek chirurgicznych, fartucha i zasłon. Stosuj aseptyczną technikę chirurgiczną do każdego zabiegu chirurgicznego.
- Znieczulenie samic szczurów Fischer 344 za pomocą kombinacji (2 ml/kg) ketaminy (25 mg/ml), ksylazyny (1,3 mg/ml) i acepromazyny (0,25 mg/ml) podawanych we wstrzyknięciu dootrzewnowym (i.p.).
- Ogol plecy i kilkakrotnie oczyść skórę betadyną i etanolem.
- Przetnij skórę za pomocą ostrza #10 i tępo wypreparuj warstwy mięśni. Użyj skalpela, aby odizolować kręgi, odsłonić kręg T3 i wykonać laminektomię grzbietową za pomocą rongeurs z cienką końcówką.
- Naciąć oponę twardą wzdłużnie i przeciąć rdzeń kręgowy na poziomie T4 za pomocą kombinacji nożyczek do irydektomii i mikroaspiracji, aby utworzyć około 1 mm szczelinę ostrocaudalną między kikutami rdzenia kręgowego.
- Odczekaj około 1 - 2 minuty, aż krwawienie całkowicie ustaje, następnie zszyj mięśnie 3-0 Vycril i zamknij skórę klipsami do ran.
- Natychmiast po zabiegu należy wstrzyknąć mleczaną chorobę Ringera (5 ml), buprenorfinę (0,035 mg/kg) i ampicylinę (33 mg/kg) podskórnie i utrzymywać szczury w ciepłym inkubatorze do momentu przebudzenia.
- Roztwór Ringera i ampicyliny należy wstrzykiwać raz na dobę przez okres do 10 dni, a buprenorfinę dwa razy na dobę przez 3 dni lub do momentu ustąpienia objawów bólu i niepokoju. Nie należy zwracać zwierzęcia do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie wyzdrowieje w pełni.
- Ręcznie opróżniać pęcherz dwa razy dziennie przez około dwa tygodnie, aż do ustalenia się odruchowego opróżniania pęcherza, a następnie opróżniać pęcherz raz dziennie przez cały okres przeżycia, jeśli to konieczne.
- Dwa tygodnie później ponownie znieczul szczury po SCI, jak opisano powyżej, i ponownie odsłonij miejsce uszkodzenia rdzenia kręgowego. Trzymaj oponę twardą zamkniętą, aby zatrzymać wszczepione komórki w miejscu uszkodzenia.
- Wstrzyknąć 10 μl roztworu komórkowego (3,5 × 105 μl), pobranego z wszechobecnych transgenicznych zarodków szczurów GFP E14 i osadzonego w fibrynogenie i trombinie5,6, do epicentrum jamy zmiany chorobowej oraz na granicy rostralnej i ogonowej zmiany z wieloma miejscami wstrzyknięcia, używając wyciągniętej szklanej mikropipety o średnicy wewnętrznej 40 μm, podłączony do strzykawki Hamiltona.
- Zszyj warstwy mięśniowe i zamknij skórę klipsami do ran.
- Wykonaj wstrzyknięcie po operacji i pielęgnację pęcherza zgodnie z opisem w krokach 1.6 – 1.8.
- Na tydzień przed perfuzją wstrzyknij dootrzewnowo 0,5% Fluorogold (FG, 0,4 ml w wodzie destylowanej), aby wstecznie oznaczyć współczulne neurony przedzwojowe w rdzeniu kręgowym7.
2. Implantacja nadajnika
- Namocz nadajniki w 2% roztworze aldehydu glutarowego (4 ml 50% glutaraldydu w 96 ml wody destylowanej) przez co najmniej 1 - 2 godziny (do 10 godzin) w temperaturze pokojowej w celu sterylizacji.
- Dokładnie umyj nadajniki sterylnym 0,9% soli fizjologicznej 3 razy i przechowuj je w soli fizjologicznej do czasu użycia (nie dłużej niż 1 godzina).
- Osiem tygodni po przeszczepie komórek E14 (10 tygodni po urazie) należy ponownie znieczulić szczury, które przeszły SCI z przeszczepem komórek lub bez oraz naiwne szczury kontrolne.
- Ogol okolice brzucha i kończyny tylne. Oczyść skórę za pomocą Betadine. Połóż szczura na stole operacyjnym w pozycji leżącej.
- Naciąć skórę na brzusznej części brzucha i wewnętrznej stronie uda po prawej stronie za pomocą ostrza #15.
- Przetnij podskórne tkanki łączne, aby odsłonić wiązkę naczyń udowych i nerw za pomocą małych nożyczek.
- Oddziel tętnicę udową od żyły i nerwu za pomocą cienkich kleszczy z zakrzywionymi końcówkami.
- Umieść trzy jedwabne szwy pod tętnicą i zrób luźny węzeł w każdym szwie.
- Nałóż 0,1 ml lidokainy (2%) na powierzchnię tętnicy, aby wywołać rozszerzenie naczyń krwionośnych w celu późniejszego cewnikowania.
- Zabezpiecz naczynie dystalnie trwałym węzłem jedwabnym i tymczasowym blokiem proksymalnie, rozciągając luźny szew jedwabny.
- Nakłuć tętnicę za pomocą zakrzywionej igły o rozmiarze 20 i wprowadzić końcówkę cewnika telemetrycznego (o długości 8 cm) za pomocą narzędzia do wprowadzania cewnika.
- Wprowadzić cewnik rostrale do 4 cm, umieszczając w ten sposób końcówkę w aorcie piersiowej.
- Zakotwicz cewnik w naczyniu, zawiązując trzy jedwabne szwy wokół tętnicy udowej.
- Wykonaj podskórną kieszeń wzdłuż boku między ogonową krawędzią klatki piersiowej a najbardziej czaszkowym przedłużeniem zasięgu kolana za pomocą nożyczek.
- Włóż korpus nadajnika do kieszeni i zszyj go z tkanką łączną otaczającą nadajnik, aby uniknąć nadmiernego ruchu.
- Zszyj skórę jedwabną nicią nr 6.
- Natychmiast po zabiegu należy wstrzyknąć mleczaną chorobę Ringera (5 ml), buprenorfinę (0,035 mg/kg) i ampicylinę (33 mg/kg) podskórnie i utrzymywać szczury w ciepłym inkubatorze do momentu przebudzenia.
3. Zapis podstawowego średniego ciśnienia tętniczego (MAP) i tętna (HR)
- Już jednego dnia po wszczepieniu nadajnika połóż pojedyncze zwierzę na podkładce odbiornika i włącz nadajnik. Odczekaj około 10 - 15 minut, aby przyzwyczaić zwierzę i ustabilizować parametry sercowo-naczyniowe.
- Rejestruj spoczynkowe MAP i tętno, które są uzyskiwane na podstawie ciśnienia tętniczego tętna za pomocą skomputeryzowanego systemu gromadzenia danych przez co najmniej 1 godzinę. Zbieraj dane co 5 sekund.
- Monitoruj zwierzęta w sposób ciągły i usuwaj punkty danych podczas występowania widocznych skurczów. Dla każdego zwierzęcia średnie punkty danych, aby uzyskać wartości średnie.
4. Dysrefleksja autonomiczna wywołana rozdęciem jelita grubego
- Szczury szczepione NSC lub kontrolne SCI należy trzymać w ręczniku dostarczonym z granulkami jedzenia w środku na odbiorniku nadajnika. Zwykle szczury mogą pozostać w gotowości do współpracy podczas zabiegu.
- Wprowadzić cewnik zakończony lateksem z balonem do odbytnicy na około 2 cm i przymocować go do ogona za pomocą taśmy8.
- Włącz nadajnik i odczekaj 10-15 minut, aby ciśnienie krwi powróciło do stanu sprzed insercji.
- Wywołaj wzdęcie jelita grubego poprzez powolne napełnianie balonu przez 10 sekund za pomocą 1,4 ml powietrza przez 1 minutę, aby wytworzyć ciśnienie około 30 mmHg.
- Rejestruj MAP i HR 1 minutę przed, 1 minutę w trakcie i 1 minutę po wzdęciu jelita grubego; próbki danych co 3 sekundy podczas 3-minutowej procedury.
- Wykonaj 2-3 próby na zwierzę z co najmniej 15-minutowym odstępem czasu między dwoma badaniami.
- Przedawkowanie zwierząt (i. p.) z kombinacją znieczulenia w podwójnej dawce opisaną powyżej, jeśli nie ma dalszej oceny. Zwierzęta należy przelać solą fizjologiczną, a następnie 4% paraformaldehydem.
- Dla każdego zwierzęcia należy uśrednić wartości odpowiednio przed i w trakcie rozdęcia jelita grubego; obliczyć różnicę między zmianami MAP i HR wywołanymi rozdęciem dla każdego badania; uśrednić z 2-3 prób, aby uzyskać wartości średnie.
5. Czyszczenie nadajnika
- Usuń nadajnik z ciała zwierzęcia po znieczuleniu, ale przed perfuzją. Natychmiast namoczyć w zlewce wypełnionej wodą destylowaną do czasu czyszczenia; Unikaj wysuszenia urządzenia telemetru.
- Przenieś telemetr do 1% enzymatycznego roztworu czyszczącego Terg-A-Zyme (10 g/l wody) na 24 godziny w temperaturze pokojowej.
- Ponownie zeżeluj końcówkę cewnika nadajnika za pomocą igły o rozmiarze 30 podłączonej do strzykawki z żelem.
- Ostrożnie osusz nadajnik za pomocą złożonej miękkiej chusteczki i przechowuj go w oryginalnej plastikowej tacy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Stosując opisaną powyżej technikę telemetrii, pomyślnie zarejestrowano parametry układu krążenia u zwierząt z urazem rdzenia kręgowego. U zwierząt z samym SCI (urazem rdzenia kręgowego) MAP było znacząco obniżone, podczas gdy HR wzrosło w porównaniu z naiwnymi zwierzętami, co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami9. U zwierząt z przeszczepem BS-NSC wartości MAP i HR zbliżyły się do poziomów mierzonych u zwierząt naiwnych (Rycina 2). Podczas rozciągania jelita grubego szczura uznawano za wy...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Tradycyjnie, kaniula wypełniona płynem jest wprowadzana do tętnicy i podłączana do przetwornika ciśnienia w celu zarejestrowania parametrów sercowo-naczyniowych jako migawki końcowej u każdego zwierzęcia11. Aby stale monitorować wydolność układu krążenia przez długi czas, w wielu laboratoriach stosuje się systemy radio-telemetryczne. To bardziej wyrafinowane narzędzie może rejestrować ciśnienie krwi u przytomnych, swobodnie poruszających się zwierząt. W porównaniu z cewnikami wypełnionymi płynem, telemetria je...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Praca była wspierana przez granty z NIH/NINDS (NS054883), Fundacji Craiga H. Neilsena (280072) oraz Veterans Administration i Canadian Spinal Research Organization. Dziękujemy Rat Resource and Research Center, University of Missouri, Columbia, Missouri, za dostarczenie szczurów GFP.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Fibrynogen (szczur) | Sigma | F6755-25MG | 2 godziny w 37 oC do dystrybucji |
| Trombiny (szczur) | Sigma | T5772-100UN | Dissovle w 10 mM CaCl2 |
| 1% Terg-A-Zyme | Sigma | Z273287 | Enzymatyczny roztwór do czyszczenia telemetru |
| Fluorogold | Fluorochrome | Dissovle w wodzie destylowanej i unikać światła | |
| Telemetr (PA-C40) | Data Sciences International | ||
| Telementric | Międzynarodowe Stymulator Danych Międzynarodowy Stymulator Sygnału, Matryca Wymiany Danych, odbiorniki, Monitor ciśnienia otoczenia Cewnik | ||
Bibliografia
- Krassioukov, A. V., Furlan, J. C., Fehlings, M. G. Autonomic dysreflexia in acute spinal cord injury: an under-recognized clinical entity. J Neurotrauma. 20, 707-716 (2003).
- Lindan, R., Joiner, E., Freehafer, A. A., Hazel, C. Incidence and clinical features of autonomic dysreflexia in patients with spinal cord injury. Paraplegia. 18, 285-292 (1980).
- Inskip, J. A., Ramer, L. M., Ramer, M. S., Krassioukov, A. V. Autonomic assessment of animals with spinal cord injury: tools, techniques and translation. Spinal Cord. 47, 2-35 (2009).
- Mayorov, D. N., Adams, M. A., Krassioukov, A. V. Telemetric blood pressure monitoring in conscious rats before and after compression injury of spinal cord. J Neurotrauma. 18, 727-736 (2001).
- Hou, S., Tom, V. J., Graham, L., Lu, P., Blesch, A. Partial restoration of cardiovascular function by embryonic neural stem cell grafts after complete spinal cord transection. J Neurosci. 33, 17138-17149 (2013).
- Lu, P., et al. Long-distance growth and connectivity of neural stem cells after severe spinal cord injury. Cell. 150, 1264-1273 (2012).
- Akhavan, M., Hoang, T. X., Havton, L. A. Improved detection of fluorogold-labeled neurons in long-term studies. J Neurosci Methods. 152, 156-162 (2006).
- Maiorov, D. N., Fehlings, M. G., Krassioukov, A. V. Relationship between severity of spinal cord injury and abnormalities in neurogenic cardiovascular control in conscious rats. J Neurotrauma. 15, 365-374 (1998).
- Laird, A. S., Carrive, P., Waite, P. M. Cardiovascular and temperature changes in spinal cord injured rats at rest and during autonomic dysreflexia. J Physiol. 577, 539-548 (2006).
- Phillips, A. A., Krassioukov, A. V., Ainslie, P. N., Warburton, D. E. Baroreflex function after spinal cord injury. J Neurotrauma. 29, 2431-2445 (2012).
- Osborn, J. W., Taylor, R. F., Schramm, L. P. Determinants of arterial pressure after chronic spinal transection in rats. Am J Physiol. 256, 666-673 (1989).
- Rabchevsky, A. G., et al. Effects of gabapentin on muscle spasticity and both induced as well as spontaneous autonomic dysreflexia after complete spinal cord injury. Front Physiol. 3, 329(2012).
- Hou, S., Lu, P., Blesch, A. Characterization of supraspinal vasomotor pathways and autonomic dysreflexia after spinal cord injury in F344 rats. Auton Neurosci. 176, 54-63 (2013).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
