Rejestrowanie prądów Ca2+ na błonie czołowej uwalniania presynaptycznego jest kluczem do precyzyjnego zrozumienia wejścia Ca2+ i uwalniania neuroprzekaźników. Przedstawiamy ostrą dysocjację rdzenia kręgowego minoga, która daje funkcjonalne izolowane aksony siateczkowo-rdzeniowe, umożliwiające zapis bezpośrednio z błony czołowej uwalniającej poszczególne zakończenia presynaptyczne.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ostra dysocjacja aksonów siateczkowo-rdzeniowych minoga w celu umożliwienia rejestracji z błony czołowej uwalniającej poszczególnych funkcjonalnych zakończeń presynaptycznych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Transmisja synaptyczna to niezwykle szybki proces. Napędzany potencjałem czynnościowym napływ Ca2 + do zakończenia presynaptycznego, przez bramkowane napięciem kanały wapniowe (VGCC) znajdujące się w błonie czołowej uwalniania, jest wyzwalaczem fuzji pęcherzyków i uwalniania neuroprzekaźników. Kluczowe znaczenie dla szybkości transmisji synaptycznej ma przestrzenna i czasowa synchronizacja między nadejściem potencjału czynnościowego, VGCC i maszynerii uwalniania neuroprzekaźników. Zdolność do bezpośredniego rejestrowania prądów Ca2+ z błony czołowej uwalniającej poszczególnych zakończeń presynaptycznych jest niezbędna do precyzyjnego zrozumienia związku między presynaptycznym Ca2 + a uwalnianiem neuroprzekaźników. Dostęp do błony czołowej uwalniania presynaptycznego w celu zapisu elektrofizjologicznego nie jest dostępny w większości preparatów, a presynaptyczne wejście Ca2 + zostało scharakteryzowane przy użyciu technik obrazowania i makroskopowych pomiarów prądu – technik, które nie mają wystarczającej rozdzielczości czasowej do wizualizacji wejścia Ca2 +. Charakterystyka VGCC bezpośrednio na pojedynczych końcach presynaptycznych nie była możliwa w synapsach centralnych i do tej pory udało się to osiągnąć tylko w synapsie typu kielichowego zwoju rzęskowego pisklęcia oraz w kielichach szczurów. Udało nam się rozwiązać ten problem w gigantycznej synapsie siateczkowo-rdzeniowej rdzenia kręgowego minoga, opracowując ostro zdysocjowany preparat rdzenia kręgowego, który daje izolowane aksony siateczkowo-rdzeniowe z funkcjonalnymi zakończeniami presynaptycznymi pozbawionymi struktur postsynaptycznych. Możemy fluorescencyjnie znakować i identyfikować poszczególne zakończenia presynaptyczne i kierować je do nagrywania. Za pomocą tego preparatu scharakteryzowaliśmy VGCC bezpośrednio na powierzchni uwalniania poszczególnych zakończeń presynaptycznych przy użyciu podejść immunohistochemicznych i elektrofizjologicznych. Prądy Ca2+ zarejestrowano bezpośrednio na błonie czołowej uwalniającej poszczególne zakończenia presynaptyczne, przy czym pierwszy taki zapis przeprowadzono w synapsach centralnych.
Wprowadzenie
Przekaźnictwo synaptyczne jest procesem niezwykle szybkim i precyzyjnym. Dotarcie potencjału czynnościowego do zakończenia presynaptycznego prowadzi do otwarcia kanałów VGCC zlokalizowanych w błonie strefy uwalniania; wynikający z tego wzrost stężenia presynaptycznego Ca2+ działa jako wyzwalacz fuzji pęcherzyków i uwalniania neuroprzekaźnika1. Wszystkie te etapy następują w ciągu setek mikrosekund2, co wymaga ścisłego sprzężenia przestrzennego VGCC z mechanizmem fuzji pęcherzyków3. Przepływy presynaptycznego Ca2+ były charakteryzowane głównie za pomocą metod obrazowania z wykorzystaniem barwników wrażliwych na Ca....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie hydrobromku poli-D-lizyny
- Przygotować 1 mg/ml hydrobromidu poli-D-lizyny w 0,1 M buforze boratowym (pH 8,5).
- Rozdzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -20 °C.
2. Powlekanie szkiełek nakrywkowych poli-lizyną
Uwaga: Wszystkie etapy czyszczenia i powlekania należy przeprowadzać w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
- Umieść szkiełka nakrywki w szalce Petri zawierającej 1 N kwas solny (HCl) na 2 h.
- Odsuń cały HCl i przepłucz 2-3x 70% etanolem (EtOH).
- Pozostaw w 70% EtOH na 1 h.
- Odsuń cały 70% EtOH i przepłucz 2-3x ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Niniejszy protokół dysocjacji pozwala na uzyskanie zdrowych i funkcjonalnych izolowanych aksonów retikulospinalnych pozbawionych projekcji postsynaptycznych Rysunek 2f, które mimo to zachowują funkcjonalne terminale presynaptyczne zdolne do wywołanej egzocytozy i endocytozy pęcherzyków synaptycznych Rysunek 4c oraz Rysunek 4d. Przekroje izolowanych regionów aksonów retikulospinalnych można jednoznacznie zidentyfikować w mikroskopii świetlnej jako wolne od innych wypustek.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Nasz protokół dysocjacji jest znaczący, ponieważ daje izolowane aksony siateczkowo-rdzeniowe pozbawione projekcji postsynaptycznych Figura 2f, ale mimo to zachowują funkcjonalne zakończenia presynaptyczne Figura 4c i Figura 4d. Brak procesów postsynaptycznych przeciwstawnych do zakończenia presynaptycznego umożliwia bezpośredni dostęp do błony czołowej uwalniania presynaptycznego na pojedynczych końcach presynaptycznych, co wcześniej nie było możliwe w synapsach centraln.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów, które mogliby ujawnić.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez NINDS, RO1NS52699 i MH84874 do SA.
Chcielibyśmy podziękować Dr. Dave'owi Featherstone'owi (Wydział Nauk Biologicznych, University for Illinois w Chicago) za dostarczenie nam kleju do szwów używanego w pracach immunohistochemicznych. Dziękujemy Michaelowi Alpertowi za jego komentarze i korektę manuskryptu.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,2 &mikro; m Filtr strzykawkowy | EMD Millipore | SLGV004SL | |
| 22 x 60 mm Szkiełka nakrywkowe | Fisherbrand | 12545J | |
| Advasep-7 | Cydex Pharmaceuticals | ADV7 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | |
| Alexa-633 sprzężone kozie przeciwciało wtórne przeciwko królikowi | Invitrogen/Life Technologies | A21070 | |
| Płyn niezamarzający | Kwas borowy Prestone | ||
| Sigma-Aldrich | B7660 | ||
| Albumina surowicy bydlęcej | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Źródło światła jasnego pola | Dolan-Jenner | Fiberlite 180 | |
| Chlorek wapnia | Sigma Aldrich | C4901 | |
| Kolagenaza typu IA z Cloristridium Histolyticum | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Szkiełko nakrywkowe | Fisher-Scientific | 12-545-J | |
| Dekstroza | Sigma-Aldrich | D9559 | |
| Cyfrowa kamera CCD | Hamamatsu | C8484-03G01 | |
| Kleszcze do preparacji | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Kleszcze preparacyjne | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Mikroskop preparacyjny | Leica Biosystems | Leica MZ 12 | |
| Nożyczki do preparacji | Fine Science Tools | 15025-10 | |
| Nożyczki do preparacji drobne | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Nożyczki do preparacji ultra drobne | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| FM 1-43 | Invitrogen/Life Technologies | T3163 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| Smar wysokopróżniowy | Dow-Corning | ||
| Kwas solny | Fisherbrand | SA-56-500 | |
| Olejek immersyjny | Fisher-Scientific | M2000 | |
| Przemysłowy zbiornik azotu | Praxair | UN1066 | |
| Szpilki do owadów | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Płynny klej do szwów | Braun Veterinary Cair Division | 8V0305 | Klej do szwów, którego używaliśmy w naszych eksperymentach, został nam dostarczony przez inne laboratorium. Nie jest już produkowany. Pozyskaliśmy klej do szwów histoakrylowych do wykorzystania w przyszłości od Aesculap (Ts1050071FP) |
| Chlorek magnezu | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Metanol | Sigma-Aldrich | 154903 | |
| Beztłuszczowe mleko w proszku | Technologia sygnalizacji komórkowej | 9999S | |
| P-87 Ściągacz do mikropipet | Sutter Instruments | ||
| Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Pompa perfuzyjna | Cole-Palmer | Masterflex C/L | |
| szalka Petriego 100 x 15 mm | Fisher-Scientific | 875712 | |
| szalka Petriego 35 x 10 mm | Fisher-scientific | 875712 | |
| Bromowodorek poli-D-lizyny | Sigma-Aldrich | P1024 | MW > 300 000 |
| Chlorek potasu | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Fosforan potasu jednozasadowy | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Przeciwciała pierwszorzędowe Kanał wapniowy typu R | Alomone Labs | ACC-006 | |
| Proteaza typu XIV ze Streptomyces Griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Ostrza skalpela | World Precision Instruments | 500240 | |
| Butelka ciśnieniowa Schot Duran | Fisher-Scientific | 09-841-006 | |
| Rurka silikonowa do nakładania kleju | Cole-Palmer | 07625-26 | |
| Płyta podstawy do krojenia | Leica Biosystems | 14046327404 | |
| Komora do krojenia | Leica Biosystems | 14046230132 | |
| Chlorek sodu | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Wodorotlenek | S8045 | ||
| Fosforan sodu dwuzasadowy | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| Tetraboran sodu | Sigma-Aldrich | B3545 | |
| Sylgard 160 Zestaw elastomerów silikonowych | Dow Corning | SYLGARD® 160 | Aby przygotować, wymieszaj elastomer A i elastomer B 10:1 wagowo |
| Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych | Dow Corning | SYLGARD® 184 | Aby przygotować, wymieszaj elastomer i utwardzacz w stosunku wagowym 10:1 |
| Kleszcze pokryte teflonem | Fine Science Tools | 11626-11 | |
| Metanosulfonian trikainy | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Ostrza wibratome | World Precision Instruments | OSTRZA | |
| Nikon |
Bibliografia
- Katz, B., Miledi, R. The timing of calcium action during neuromuscular transmission. Journal of Physiology. 189 (3), 535-544 (1967).
- Sabatini, B. L., Regehr, W. G. Timing of neurotransmission at fast synapses in the mammalian brain. Nature. 384 (6605), 17....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
