Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Testy cytotoksyczności w czasie rzeczywistym w ludzkiej krwi pełnej

12K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51941

⸱

7 listopada 2014

 ,  ,  , 
1Research and Development, Adheren, Inc, 2Research and Development, Eureka Therapeutics

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Test cytotoksyczności krwi pełnej (WCA) jest testem cytotoksyczności opracowanym przez połączenie wysokoprzepustowej technologii pozycjonowania komórek z mikroskopią fluorescencyjną i automatycznym przetwarzaniem obrazu. Tutaj opisujemy, w jaki sposób komórki chłoniaka leczone przeciwciałem anty-CD20 mogą być analizowane w czasie rzeczywistym w ludzkiej krwi pełnej w celu zapewnienia ilościowej analizy cytotoksyczności komórkowej.

Streszczenie

Test cytotoksyczności krwi pełnej oparty na żywych komórkach (WCA), który umożliwia dostęp do informacji czasowych na temat ogólnej cytotoksyczności komórek, został opracowany przy użyciu technologii wysokoprzepustowego pozycjonowania komórek. Docelowe populacje komórek nowotworowych są najpierw wstępnie zaprogramowane do unieruchomienia do formatu matrycy i znakowane zielonymi fluorescencyjnymi barwnikami cytozolowymi. Po utworzeniu macierzy komórkowej dodaje się przeciwciała w połączeniu z ludzką krwią pełną. Następnie dodaje się jodek propidyny (PI) w celu oceny śmierci komórki. Macierz komórek jest analizowana za pomocą automatycznego systemu obrazowania. Podczas gdy barwnik cytozolowy znakuje docelowe populacje komórek nowotworowych, PI oznacza martwe populacje komórek nowotworowych. W ten sposób procent zabijania docelowych komórek rakowych można określić ilościowo, obliczając liczbę komórek docelowych, które przeżyły, w stosunku do liczby martwych komórek docelowych. Dzięki tej metodzie naukowcy są w stanie uzyskać dostęp do informacji o cytotoksyczności komórek zależnych od czasu i dawki. Co ciekawe, nie stosuje się żadnych niebezpiecznych radiochemikaliów. Prezentowany tutaj WCA został przetestowany z chłoniakami, białaczką i liniami komórek guzów litych. W związku z tym WCA pozwala naukowcom ocenić skuteczność leku w bardzo istotnych warunkach ex vivo.

Wprowadzenie

Ostatnie osiągnięcia w przemyśle farmaceutycznym doprowadziły do wzrostu zainteresowania realizacją specyficznych identyfikacji przeciwciał komórek nowotworowych i spersonalizowanych metod leczenia raka; jednak w procesie tym napotyka się kilka przeszkód. Tylko 5% środków, które mają działanie przeciwnowotworowe w fazie rozwoju przedklinicznego, jest dopuszczonych do obrotu po wykazaniu wystarczającej skuteczności w badaniach fazyII-III 1,2. Strategie przedkliniczne (zarówno in vitro, jak i in vivo) są nieoptymalne, ponieważ wiele przykładów wykazało, że leki przeciwnowotworowe zachowują się inaczej u ludzi i u zwierząt laboratoryjnych, głównie ze względu na ich różne składniki krwi3-5.

Aby zaspokoić konieczność stworzenia platformy do badań przesiewowych leków przeciwnowotworowych i zapewnić punkt kontrolny przed kosztownymi eksperymentami na zwierzętach i próbami klinicznymi, proponuje się test cytotoksyczności krwi ludzkiej (WCA) do oceny skuteczności leków przeciwnowotworowych w bardziej odpowiednim środowisku biologicznym. Test cytotoksyczności krwi pełnej może być stosowany do oceny odpowiedzi poszczególnych komórek na przeciwciała i innych kandydatów na leki w ludzkiej krwi pełnej.

WCA jest rozwijane poprzez włączenie technologii pozycjonowania komórek o wysokiej przepustowości z obrazowaniem o wysokiej przepustowości i wysokiej zawartości6. Dzięki zastosowaniu zautomatyzowanego systemu obrazowania można z dużą precyzją określić liczbę zarówno żywych, jak i martwych komórek. Ze względu na fakt, że komórki docelowe są unieruchomione na tej samej płaszczyźnie ogniskowej, WCA jest w stanie zapewnić ilościową analizę cytotoksyczności w czasie rzeczywistym bez usuwania czerwonych krwinek. Co więcej, automatyczny system obrazowania ma kilka zalet, takich jak to, że tylko komórki docelowe, które osiągnęły określone kryteria (np. komórki znakowane fluorescencyjnie i morfologia komórki) są bramkowane i przetwarzane. Pozwala również na produkcję 144 talerzy dziennie. W związku z tym ta zdolność obrazowania i przepustowość pozwalają na jednoczesne przeprowadzanie eksperymentów o wysokiej zawartości i przepustowości. Dzięki połączeniu WCA i zautomatyzowanego systemu obrazowania, można uzyskać wysokoprzepustową ilościową analizę cytotoksyczności komórek w bardziej istotnym biologicznie środowisku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie komórki docelowej

  1. Utrzymuj komórki docelowe (np. Komórki chłoniaka Rajiego) w pożywce wzrostowej (pożywka hodowlana RPMI 1640, z 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS), 4nM L-glutaminą i 500 IU / ml penicyliny / streptomycyny) w temperaturze 37oC w inkubatorze 5% CO2
    2. .
  2. Odwirować próbkę, aby zagnieździć komórki docelowe w probówce o pojemności 15 ml. Czas wirowania różni się w zależności od typu komórek; wirować przez 3 minuty przy 468 x g dla komórek Raji.
  3. Najpierw należy zassać wszelkie pęcherzyki powstałe na powierzchni supernatantu i usunąć cały supernatant.
  4. Dodać 10 ml PBS do probówki. Ponownie zawiesić komórki, odpipetowując roztwór kilka razy w górę iw dół, aby rozbić zlepek komórek.
  5. Odwirować próbkę przez 3 minuty przy 468 x g.
  6. Odessać wszelkie pęcherzyki powstałe na powierzchni supernatantu i usunąć cały supernatant.

2. Przygotowanie mikromacierzy komórkowych

  1. Zaopatrz się w zestawy 96-dołkowych płytek do mocowania komórek lub szkiełka do 8-dołkowych z pojedynczą matrycą komórek (patrz tabela materiałów/odczynników).
  2. Nałóż 1,2 μl Aktywatora na odczynnik DNA z zestawu. Nakrętkę zamknąć, odwrócić do góry nogami i delikatnie wstrząsnąć, aby wymieszać roztwór.
  3. Pozwól roztworowi zareagować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Nanieść zmieszany roztwór na osad komórek docelowych (w probówce o pojemności 15 ml).
  5. Dodać zielone barwniki cytozolowe fluorescencyjne o końcowym stężeniu 500 nM.
  6. Inkubować komórki docelowe z mieszanym roztworem i barwnikiem przez 30 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej.
  7. Przemyć komórki dwukrotnie 5 ml PBS i ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki wzrostowej.
  8. Nanieść 100 μl roztworu z kroku 2.7 na każdą studzienkę. Policz liczbę komórek za pomocą hemacytometru. Upewnij się, że liczba komórek mieści się w zakresie od 5×104 do 1×106 komórek na studzienkę.
  9. Po 10-15 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej należy delikatnie przemyć próbki dwukrotnie pożywką o objętości 200-300 μl, aby usunąć wszelkie niezwiązane komórki.
    UWAGA: Po umyciu w każdym dołku pozostaje około 5-10 μl podłoża wzrostowego.

3. Testy cytotoksyczności krwi pełnej

  1. Do każdej próbki należy dodać 180 μl ludzkiej krwi pełnej.
  2. Otrzymać roztwór przeciwciała anty-CD20 w stężeniu 5 mg/ml i przeprowadzić seryjne rozcieńczenie w celu uzyskania 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0,5 μg/ml roztworu przeciwciała anty-CD20 w probówkach o pojemności 1,5 ml. Dodać 20 μl każdego stężenia przeciwciała anty-CD20 do każdej próbki, dobrze wykonując trzy próbki.
  3. Dodać jodek propidyny o końcowym stężeniu 500 nM do każdego dołka.
  4. Otrzymaną płytkę inkubować w temperaturze 37°C z 5% CO2 przez 16 godzin.
  5. Zobrazuj komórki na szkiełkach lub płytkach 96-dołkowych za pomocą automatycznego systemu obrazowania z 8-krotnym powiększeniem.
  6. Użyj programu zliczania komórek automatycznego systemu obrazowania, aby określić ilościowo wyniki.
    UWAGA: Oprogramowanie automatycznego systemu obrazowania zapewnia proste operacje zliczania komórek krok po kroku. Protokół korzystania z tego oprogramowania można znaleźć na stronie internetowej dostawcy.
  7. Wybierz opcję [Review Results] (Przejrzyj wyniki) na stronie głównej oprogramowania.
  8. Wybierz opcję [Plik zapisany dla próbek].
  9. Średnia intensywność pierwszej bramki FITC >50, a następnie średnia intensywność bramki TxRed >20.
  10. Wybierz opcję [Przegląd płyty].
  11. Wybierz [Eksportuj tabele].
    UWAGA: Formuła procentowego zabijania komórek programu jest pokazana poniżej:
    % zabijania komórek docelowych = (# komórek zabarwionych zarówno na zielono, jak i na czerwono/ # komórek zabarwionych na zielono)*100%

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przeciwciała anty-CD20 oraz komórki chłoniaka (komórki Raji i MC/CAR) wybrano jako system modelowy do zademonstrowania testu cytotoksyczności w krwi pełnej (WCA)7,8. Komórki Raji charakteryzowały się wysoką liczbą kopii CD20 na powierzchni komórki, natomiast komórki MC/CAR miały niską liczbę kopii CD20 w swojej błonie. Komórki docelowe najpierw barwiono na zielono za pomocą cytozolowych barwników fluorescencyjnych i rozmieszczano na płytce 96-dołkowej. W każdym dołku unieruchomiono od 10 000 do 50 000 docelowy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

WCA jest kluczowym narzędziem do badań przesiewowych in vitro w kierunku nowotworów o rozdzielczościpojedynczej komórki 12-16, idealnie wykorzystywanym po tradycyjnych docelowych badaniach przesiewowych, takich jak testy CDC i ADCC9-11, oraz przed przedklinicznymi testami na zwierzętach. Obecnie podstawowe docelowe testy przesiewowe, takie jak testy CDC lub ADCC, są wykonywane w uproszczonej pożywce lub systemie buforowym. Jednak kandydaci na leki, którzy wykazują skuteczność w tych uproszc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy programowi IMAT National Cancer Institute z NIH za sfinansowanie tej pracy [R33 CA174616-01A1].

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestawy płytek 96-dołkowych do mocowania komórek AdherenAP9601
Zawiesina Jednokomórkowa matryca 8-dołkowa szkiełko komoroweAdherenSS0801
Adherent Jednokomórkowa matryca 8-dołkowa szkiełkoAdherenSS0802
Linia komórkowa chłoniaka CD20 +ATCCCCL-86Komórki Raji
Linia komórkowa chłoniaka CD20-ATCCCRL-8083MC/CAR
RPMI 1640 z L-glutaminąLife Technologies11875-119
Płodowa surowica bydlęcaThermoSH30070.01HI
Peni/StrepLife Technologies15070063
Barwnik cytozolowyLife TechnologiesC7025Cell Tracker Green
Rituxan (biopodobny) Eureka Therapeutics
Ludzka krew pełnaAllcellsWB001
Jodek propidynySigmaP4170-10MG
Automatyczny system obrazowaniaUrządzenia molekularneSkontaktuj się z dostawcąCell Reporter
Program zliczania komórekUrządzenia molekularneSkontaktuj się z dostawcąCell Reporter

Bibliografia

  1. Hutchinson, L., Kirk, R. High drug attrition rates--where are we going wrong. Nat Rev Clin Oncol. 8, 189-1890 (2011).
  2. Moreno, L., Pearson, A. D. Attrition rates be reduced in cancer drug discovery. Informa healthcare. 8, 363-368 (2013).
  3. Seok, J., et al. Inflammation and Host Response to Injury, Large Scale Collaborative Research Program. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3507-3512 (2013).
  4. Suntharalingam, G., et al. Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412. N Engl J Med. 355, 1018-1028 (2006).
  5. Eastwood, D., et al. Monoclonal antibody TGN1412 trial failure explained by species differences in CD28 expression on CD4+ effector memory T-cells. Br J Pharmacol. 161, 512-526 (2010).
  6. Hsiao, S. C., Liu, H., Holstlaw, T. A., Liu, C., Francis, C. Y., Francis, M. B. Real time assays for quantifying cytotoxicity with single cell resolution. PLoS One. 8, 10-1371 (2013).
  7. Wang, S. Y., Weiner, G. Rituximab: a review of its use in non-Hodgkin’s lymphoma and chronic lymphocytic leukemia. Expert Opin Biol Ther. 8, (2008).
  8. Dalle, S., Thieblemont, C., Thomas, L., Dumontet, C. Monoclonal antibodies in clinical oncology. Anticancer Agents Med Chem. 8, 523-532 (2008).
  9. Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14, 181-196 (1968).
  10. Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J Immunol Methods. 64, (1983).
  11. Gerlier, D., Thomasset, N. J. Use of MTT colorimetric assay to measure cell activation. Immunol Methods. 94, 57-63 (1986).
  12. Toriello, N. M., et al. Integrated microfluidic bioprocessor for single-cell gene expression analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (2008).
  13. Douglas, E. S., Hsiao, S. C., Onoe, H., Bertozzi, C. R., Francis, M. B., Mathies, R. A. DNA-barcode directed capture and electrochemical metabolic analysis of single mammalian cells on a microelectrode array. Lab on a Chip. 9, 2010-2015 (2008).
  14. Mayr, L. M., Bojanic, D. Novel trends in high-throughput screening. Current opinion in pharmacology. 9, 580(2009).
  15. Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends in Biotechnology. 28, 237-245 (2010).
  16. Coelho, J., P, L., Quinn, S., Murphy, R. F. Automated image analysis for high-content screening and analysis. J Biomol Screen. 15, 726-734 (2010).
  17. Sundberg, S. A. High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution- and cell-based approaches. Current Opinion in Biotechnology. 11, 47(2000).
  18. Simmons, L. A. Personalized medicine is more than genomic medicine: confusion over terminology impedes progress towards personalized healthcare. PERS MED. 9, 85(2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Cytotoksyczność krwi pełnejdocelowe komórki nowotworowejodek propidynyautomatyczny system obrazowaniatworzenie macierzy komórkowejprzeciwciało anty-CD20fluorescencyjne barwniki cytozoloweskuteczność cytotoksyczności leku
Testy cytotoksyczności w czasie rzeczywistym w ludzkiej krwi pełnej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.