Artykuł metodologiczny

Analiza RNA-Seq zróżnicowanej ekspresji genów w rdzeniu kręgowym piskląt poddanych elektroporacji

DOI:

10.3791/51951

⸱

1 listopada 2014

 , 
1Department of Cell and Developmental Biology, Universidade de São Paulo

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten film pokazuje podstawowe kroki do przeprowadzenia analizy całego transkryptomu na wypreparowanych próbkach rdzenia kręgowego piskląt po transfekcji z elektroporacją in ovo.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In ovo elektroporacja cewy nerwowej pisklęcia jest szybką i tanią metodą identyfikacji funkcji genu podczas rozwoju neuronalnego. Analiza całego genomu transkryptów o zróżnicowanej ekspresji po takiej eksperymentalnej manipulacji może potencjalnie odkryć prawie kompletny obraz dalszych skutków spowodowanych przez transfekowany konstrukt. W pracy opisano prostą metodę porównywania transkryptomów z próbek transfekowanych embrionalnych rdzeni kręgowych, obejmującą wszystkie etapy między elektroporacją a identyfikacją transkryptów o zróżnicowanej ekspresji. Pierwszy etap składa się z wytycznych dotyczących elektroporacji oraz instrukcji dotyczących preparacji transfekowanych połówek rdzenia kręgowego z zarodków HH23 w środowisku wolnym od rybonukleazy oraz ekstrakcji wysokiej jakości próbek RNA nadających się do sekwencjonowania transkryptomu. Kolejnym etapem jest analiza bioinformatyczna wraz z ogólnymi wytycznymi dotyczącymi filtrowania i porównywania zestawów danych RNA-Seq na publicznym serwerze Galaxy, co eliminuje potrzebę lokalnej struktury obliczeniowej dla eksperymentów na małą i średnią skalę. Reprezentatywne wyniki pokazują, że metody preparacji generują wysokiej jakości próbki RNA i że transkryptomy uzyskane z dwóch próbek kontrolnych są zasadniczo takie same, co jest ważnym wymogiem dla wykrycia genów o zróżnicowanej ekspresji w próbkach eksperymentalnych. Ponadto podano jeden przykład, w którym eksperymentalna nadekspresja konstruktu DNA może być wizualnie zweryfikowana po porównaniu z próbkami kontrolnymi. Zastosowanie tej metody może być potężnym narzędziem ułatwiającym nowe odkrycia dotyczące funkcji czynników nerwowych zaangażowanych we wczesny rozwój rdzenia kręgowego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania genetyczne na żywych organizmach często wykorzystują zarodek kurczaka jako model, ponieważ elektroporacja in ovo stanowi szybki i tani sposób na częściowe transfekowanie struktur embrionalnych in vivo za pomocą konstruktów DNA1-5. Dwustronowe wektory ekspresyjne, które kodują jeden transkrypt zawierający fluorescencyjny reporter wraz z genem będącym przedmiotem zainteresowania, takie jak pCIG6 lub pMES7, umożliwiają szybką weryfikację jakości transfekcji w pożądanym regionie pod mikroskopem stereoskopowym przed przetworzeniem zarodków do dalszej analizy.

Dzięki najnowszym postępom w sekwencjonowaniu DNA, teraz możliwe jest uzyskanie cyfrowych profili ekspresji całego transkryptomu z próbek RNA za pomocą RNA-Seq8,9. Dlatego zamiast czasochłonnych metod, które umożliwiają równoległą analizę tylko kilku produktów genowych, takich jak hybrydyzacja in situ, immunohistochemia i qPCR, przygotowanie bibliotek cDNA do sekwencjonowania wysokoprzepustowego może dostarczyć informacji o całym transkryptomie. Obserwacja eksperymentalnego wpływu na poziomy ekspresji każdego pojedynczego genu może z kolei dostarczyć potężnych informacji na temat szlaków zmienionych przez zastosowany konstrukt. Jest to szczególnie łatwe, jeśli dostępny jest zestaw genomowy dla użytego organizmu, a zatem zarodek pisklęcia jest ponownie odpowiednim modelem.

Jeśli użytkownik ma dostęp do wiarygodnego centrum sekwencjonowania genomu, głównym problemem jest uzyskanie wysokiej jakości próbek RNA. W niniejszej pracy przedstawiono metodę uzyskiwania próbek RNA z transfekowanych rurek neuronowych odpowiednich dla RNA-Seq, a także dalsze etapy analizy in silico otrzymanych zestawów danych. Po elektroporacji w HH12-13, a następnie 48-godzinnej inkubacji, transfekowane połówki rdzenia kręgowego tułowia zostały wycięte w warunkach wolnych od rybonukleazy, natychmiast poddane lizie i dalej chronione przed degradacją przez ultra niskie zamrażanie do czasu oczyszczenia RNA i przygotowania biblioteki.

Publiczny serwer Galaxy10 zapewnia dostęp do darmowych zasobów do analizy danych sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Ilość miejsca oferowana dla zarejestrowanych użytkowników jest wystarczająca do przeprowadzania małych eksperymentów, eliminując w ten sposób potrzebę korzystania z lokalnej infrastruktury obliczeniowej. Analiza danych RNA-Seq obejmuje filtrowanie, dopasowywanie i kwantyfikację/porównywanie ekspresji genów. Chociaż istnieją ogólne wytyczne dotyczące analizy danych RNA-Seq, parametry filtrowania będą w dużej mierze zależeć od jakości sekwencjonowania i powinny być określone po analizie kontroli jakości surowych danych.

Ten protokół opisuje kroki do uzyskania i porównania profili RNA-Seq z rdzenia kręgowego kurczaka transfekowanego in vivo. W rezultacie reprezentatywny wynik porównanie zbiorów danych uzyskanych z dwóch niezależnych próbek kontrolnych transfekowanych pustym wektorem wykazało, że metoda jest odtwarzalna i powinna umożliwić identyfikację transkryptów o zróżnicowanej ekspresji w próbkach doświadczalnych. W związku z tym zastosowanie tej metody ma potencjał, aby znacznie zwiększyć liczbę odkryć po jednym eksperymencie, a tym samym dostarczyć dużego zestawu danych do późniejszych badań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Elektroportowanie interesującego konstruktu w cewkach nerwowych zarodków kurcząt HH12-13 In ovo

Użyj fluorescencyjnego reportera, najlepiej w transkryptze bicystronicznym lub połączonego z interesującym nas białkiem za pomocą interkalującego wirusowego peptydu2a 11, aby umożliwić szybką identyfikację osób z zadowalającym poziomem transfekcji. UWAGA: Typowy czas inkubacji na tym etapie wynosi około 48 godzin w temperaturze 37,8 °C.

  1. Otwórz małe okienko w jajach po wyjęciu 3 ml albuminy za pomocą strzykawki połączonej z igłą 18 G x 1 1/2. Aby poprawić wizualizację zarodka, wstrzyknij niewielką ilość tuszu indyjskiego rozcieńczonego w stosunku 1:50 do sterylnego roztworu Ringera pod zarodek1-4.
  2. Po pokryciu zarodka sterylnym roztworem Ringera, wstrzyknąć 10 mM roztwór Tris-HCl o pH 8,2 i 0,1% barwniku spożywczym (F, D & C) zawierający 2,5 μg/μl DNA przez tylny koniec cewy nerwowej, aż wypełni się do obszaru tyłomózgowia. Aby przeprowadzić elektroporację, należy ustawić elektrody platynowe (o średnicy 0,5 mm) oddalone od siebie o 4 mm1 wzdłuż obszaru bocznego i dostarczyć 5 impulsów o długości 50 ms i 20 V w odstępie 100 ms między nimi4.
  3. Po elektroporacji inkubuj zmanipulowane zarodki jeszcze przez 48 godzin, aż osiągną stadium HH23 i zidentyfikuj osoby wykazujące wysoki poziom transfekcji w okolicy bocznej pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym.
    UWAGA: Czas trwania inkubacji po elektroporacji zależy od celu eksperymentu. Elektroporowane plazmidy mogą generować znaczne poziomy ekspresji po 2 godzinach2. Tak więc, jeśli zainteresowanie leży w genach o wczesnym początku, okres inkubacji po elektroporacji może zostać skrócony.

2. Zbierz pomyślnie transfekowane zarodki i przeprowadź sekcję połówek rdzenia kręgowego poddanych elektroporacji

UWAGA: Ta procedura trwa od 2 do 3 godzin na każde 10 zarodków i daje 1-2 μg całkowitego RNA na zarodek. Preparacja cew nerwowych wymaga precyzyjnych ruchów i może być konieczne kilka sesji ćwiczeń przed zastosowaniem jej do próbek eksperymentalnych.

  1. Odkazić metalowe narzędzia do preparacji roztworem do odkażania RNazy lub przez pieczenie w temperaturze 150 °C przez 4 godziny12 i przygotować PBS poddane działaniu DEPC. Używaj tylko nowych certyfikowanych wyrobów z tworzyw sztucznych wolnych od RNaz.
    UWAGA: Po zbiorach ważne jest, aby przestrzegać standardowej pielęgnacji, aby zapobiec zanieczyszczeniu RNazą podczas sekcji.
  2. Zbierz zarodki za pomocą cienkich nożyczek do preparowania i przesianej łyżki do zbierania. Przechowywać zarodki w zimnym PBS poddanym działaniu DEPC na 100 mm szalce Petriego.
  3. Za pomocą cienkiej pęsety wyciąć cały obszar boczny (między tylną granicą zawiązka kończyny przedniej a przednią granicą zawiązka kończyny tylnej) i przenieść ten odcinek do nowego naczynia zawierającego PBS poddanego działaniu zimnego DEPC.
  4. Użyj dwóch cienkich szklanych igieł, aby przebić się w trzech różnych punktach po każdej grzbietowo-bocznej stronie zarodka między cewą nerwową a mezodermą przyosiową.
  5. Wprowadź dwie szklane igły do centralnej perforacji i powoli odsuń jedną z nich wzdłuż osi przednio-tylnej cewy nerwowej. Powtórz to dla perforacji, do których nie dotarły pierwsze ruchy. Usuń oderwaną mezodermę przyosiową za pomocą cienkiej pęsety.
  6. Obróć zarodek na bok, włóż końcówki pęsety między cewę nerwową a strunę grzbietową i przesuń je w przeciwnych kierunkach wzdłuż osi przednio-tylnej, aby rozdzielić dwie struktury.
    UWAGA: Powinno to również usunąć większość mezodermy nadal przyczepionej do cewy nerwowej.
  7. Jeśli to konieczne, usuń wszelkie większe kawałki tkanki mezodermicznej, które pozostają przyczepione, ciągnąc pęsetą, lekko przytrzymując rurkę nerwową inną parą pęset. Po zakończeniu delikatnie przenieś rurkę neuronową do innego naczynia zawierającego PBS poddanego zimnej obróbce DEPC, używając szklanej pipety Pasteura bez RNaz połączonej z ręczną pompką do pipet i trzymaj na lodzie, aż wszystkie probówki zostaną wycięte.
  8. Podziel cewy nerwowe na dwie połowy. W tym celu włóż ostrą końcówkę zamkniętej pęsety do światła i otwórz płytę dachową, wysuwając przez nią pęsetę. Następnie oddziel połówki, przecinając płytę podłogową końcówkami pęsety.
  9. Oddzielić wyładowane elektrolacją połówki od nieelektroporowanych połówek pod fluorescencyjnym lunetą sekcyjną i przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml wypełnionej lodowatym PBS poddanym działaniu DEPC. W razie potrzeby delikatnie potrząśnij mikroprobówkami, aby uwolnić wszelkie tkanki przyczepione do plastikowych ścianek i pobudzić sedymentację probówek.
  10. Wirować w tempie 100 x g przez 3 sekundy i bardzo powoli usunąć jak najwięcej PBS za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml. Zrób to, patrząc na źródło światła, które świeci przez mikrorurkę, aby monitorować, czy jakikolwiek materiał embrionalny jest zasysany do końcówki pipety; Jeśli tak się stanie, powoli rozładowuj i powtórz wirowanie.
  11. Dodać 70 μl roztworu do lizy do ekstrakcji RNA na połowę rurki nerwowej i przesunąć probówkę, aby wymieszać zawartość. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut i energicznie wirować. Powtórz 5-minutową inkubację i wirowanie jeszcze dwa razy. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
  12. Zbierz co najmniej osiem połówek cewy nerwowej na próbkę, aby zapewnić odpowiednią wydajność do następnego kroku. Zebrać mniejsze próbki, jeśli wymaganych jest kilka sesji elektroporacji/preparacji, aby zgromadzić wystarczającą liczbę cewek nerwowych. Przechowywać wystarczającą ilość próbek do duplikatów lub potrójnych próbek dla każdego warunku.

3. Oczyść RNA i przygotuj biblioteki do sekwencjonowania Illumina

  1. Wyjąć próbki z miejsca przechowywania w temperaturze -80 °C i umieścić na lodzie na 15-30 minut. Wznowić rozmrażanie w temperaturze pokojowej aż do zakończenia.
  2. Dobrze odwirować i pozostawić w temperaturze pokojowej na 5 minut. Ponownie odwirować i odwirować przy 15 000 x g przez 1 minutę, aby uzyskać nierozpuszczalny materiał.
  3. Przenieś supernatant do nowej probówki i przystąp do ekstrakcji RNA zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji zestawu do całkowitej izolacji RNA. Elutować w minimalnej zalecanej objętości w celu zwiększenia stężenia.
    UWAGA: Zaleca się leczenie DNazą po oczyszczeniu, aby uniknąć potencjalnego zanieczyszczenia sekwencji genomowego DNA w zestawach danych RNA-Seq.
  4. Przesuń probówkę, aby wymieszać zawartość i usunąć 5 μl w celu analizy kontroli jakości. Pozostałą próbkę przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu przygotowania biblioteki; próbki te należy rozmrażać tylko raz, aby uniknąć degradacji RNA.
  5. Uruchom oczyszczone RNA w przyrządzie do bioanalizatora za pomocą zestawu RNA 6000 Nano; Aby kontynuować, wartość RIN musi być co najmniej wyższa niż 7.
  6. Generuj biblioteki za pomocą zestawu do przygotowywania bibliotek RNA-Seq kompatybilnego z Illumina i multipleksuj do 4 bibliotek na jednym torze zestawu instrumentów HiSeq, aby generować pojedyncze odczyty 100 bp. Jeśli to możliwe, uwzględnij wszystkie próbki w tym samym przebiegu, aby zminimalizować potencjalne artefakty techniczne.
    UWAGA: Powinno to dać do 50 milionów odczytów na próbkę, co jest więcej niż wystarczające do uzyskania pokrycia dla większości genów13.

4. Porównaj zestawy danych sekwencyjnych RNA na serwerze publicznym Galaxy10.

UWAGA: Przestrzeń dyskowa serwera jest ograniczona i eksperymenty porównujące wiele próbek mogą wymagać usunięcia plików pośrednich wygenerowanych w krokach filtrowania.

  1. Utwórz konto użytkownika na publicznym serwerze Galaxy (https://usegalaxy.org) i prześlij na FTP zestawy danych Illumina w formacie fastq.
  2. Przygotuj przesłane pliki za pomocą narzędzia FastqGroomer14 w menu NGS:QC i manipulacji; jeśli wyniki jakości są już zakodowane w Phred+33 (Sanger), pomiń ten krok, po prostu zmieniając typ pliku na fastqsanger w obszarze Atrybuty dla każdego zestawu danych.
  3. Analizuj ogólną jakość każdego zestawu danych za pomocą narzędzia FastQC w menu NGS:QC i manipulacji.
    UWAGA: Szczególną uwagę należy zwrócić na wynikową grafikę dla jakości sekwencji podstawowej i zawartości sekwencji podstawowej, ponieważ dostarczą one szacunków dla parametrów używanych do przycinania końców odczytów.
  4. Trim odczytuje, aby odrzucić końce 3' z danymi o niskiej jakości za pomocą narzędzia FASTQ Quality Trimmer14 w menu NGS:QC i manipulacji. Ustaw narzędzie tak, aby przetwarzało tylko 3-calowe końce, aby uzyskać wynik jakości poniżej 20.
  5. Usuń sekwencje adapterów z odczytów za pomocą narzędzia Clip (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/) w menu NGS:QC i manipulacja. Ustaw narzędzie tak, aby odrzucało odczyty, których pozostało mniej niż 45 punktów bazowych, wprowadź sekwencję używanego adaptera i wybierz wyjście, aby uwzględnić zarówno sekwencje przycięte, jak i nieprzycięte. Ponadto zdecyduj się nie odrzucać sekwencji z nieznanymi zasadami, ponieważ większość zasad niskiej jakości została już usunięta w ostatnim kroku.
  6. Korzystając z narzędzia Trim sequences (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/) w menu NGS:QC i manipulacji, przytnij pierwsze bazy odczytów, aby usunąć odchylenie sekwencji 5' wykryte przez FastQC (zwykle 10).
    UWAGA: W tym momencie dobrym pomysłem jest ponowne uruchomienie FastQC i porównanie z poprzednią analizą, aby określić, czy jakość zestawu danych uległa poprawie.
  7. Pobierz i rozpakuj najnowszy zestaw genomu kurczaka dla przeglądarki genomu UCSC z Illumina iGenomes (http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn) i prześlij plik w formacie fasta całego genomu oraz plik w formacie gtf adnotacji genów do historii galaktyki za pomocą narzędzia Prześlij plik w menu Pobierz dane.
  8. Mapa odczytuje dla każdej próbki genom kurczaka za pomocą nakładki TopHat215 w menu NGS: Analiza RNA. Wybierz, czy chcesz użyć genomu z Historii (wybierz plik fasta przesłany w kroku 4.7).
  9. Zbuduj przewidywany transkryptom dla każdej próbki za pomocą spinek do mankietów16 w menu NGS: Analiza RNA. Wybierz, czy chcesz używać adnotacji referencyjnej jako przewodnika (wybierz plik gtf przesłany w kroku 4.7) i włącz opcje Wykonaj korekcję odchyleń (z Historii, fasta plik z kroku 4.7) i Użyj poprawności wielokrotnego odczytu.
  10. Scal przewidywane transkryptomy dla wszystkich próbek za pomocą Cuffmerge16 w menu NGS: Analiza RNA. Wybierz, czy chcesz użyć adnotacji referencyjnej (plik gtf z kroku 4.7) i danych sekwencji (z Historii, pliku fasta z kroku 4.7).
  11. Porównaj pliki BAM wygenerowane przez TopHat2 dla każdej próbki za pomocą Cuffdiff16 w menu NGS: Analiza RNA. W polu Transkrypcje wybierz scalony transcriptom wygenerowany przez Cuffmerge i włącz opcje Wykonaj korekcję stronniczości (z Historii, fasta plik z kroku 4.7) i Użyj poprawnego odczytu wielokrotnego.
  12. Tabele testowe wyrażeń różnicowych można sortować numerycznie rosnąco w kolumnie 13 (wartość q) za pomocą narzędzia Sortuj w menu Filtruj i sortuj.
    UWAGA: Geny/transkrypty wykazujące znaczącą różnicę ekspresji między warunkami eksperymentalnymi będą miały najniższe wartości q.
  13. Aby wizualnie sprawdzić wyniki za pomocą wykresów pokrycia, najpierw przekonwertuj pliki BAM do formatu bedGraph za pomocą narzędzia Utwórz wykres BedGraph pokrycia genomu17 w menu BEDTools. Wyłącz raportowanie regionów bez zasięgu, wybierz traktowanie wpisów splicingu jako odrębnych interwałów i skaluj pokrycie o czynnik, który normalizuje głębokość sekwencjonowania dla wszystkich porównywanych zestawów danych.
  14. Przekonwertuj wynikowy plik bedGraph na format bigWig za pomocą narzędzia Wig/BedGraph-to-bigWig (http://www.genome.ucsc.edu/) w menu Konwertuj formaty. Prześlij pliki bigwig jako niestandardowe ścieżki w przeglądarce genomu UCSC (http://www.genome.ucsc.edu/) dla zestawu galGal4 i wyszukaj interesujący Cię gen, aby zwizualizować pokrycie w zestawach danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby potwierdzić opisaną metodę, wygenerowano dwie próbki kontrolne z zarodków poddanych elektroporacji pustym wektorem pMES7 i jedną próbkę z zarodków transfekowanych tym samym wektorem zawierającym konstrukt wstawiania SCRT2-ZNF, który koduje domeny palców cynkowych kurczaka SCRT218. Próbki dające 11-22 μg całkowitego RNA każda uzyskano z pul od 8 do 12 zarodków. Wszystkie trzy próbki uzyskały optymalną wartość RIN wynoszącą 10 w kontroli jakości przeprowadzonej za pomocą urządzenia Bioanalyzer (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu przedstawiamy wytyczne dotyczące analizy efektów po elektroporacji rdzenia kręgowego kurczaka. Chociaż elektroporacja wektorów DNA jest częściej stosowana do nadekspresji genu będącego przedmiotem zainteresowania, można również użyć konstruktów kodujących dominujące negatywy, białka quimeryczne lub prekursory siRNA do generowania warunków knock-down funkcji genów19-21. W rzeczywistości porównanie profili transkryptomu wynikające zarówno z analizy wzmocnienia, jak i utraty funkcji może wskazać gen...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CYIY jest wspierany przez FAPESP (2012/14421-5), a FMV jest wspierany przez stypendium FAPESP (2009/53695-0). Dziękujemy Rdzeniowi Technologii DNA na Uniwersytecie Kalifornijskim w Davis za przygotowanie i sekwencjonowanie bibliotek RNA-Seq wykorzystanych w tej pracy, zespołowi Galaxy za dostarczenie doskonałego i darmowego interfejsu dla narzędzi do analizy danych sekwencjonowania o wysokiej przepustowości oraz dr Marianne Bronner za umożliwienie nam filmowania w jej przestrzeni laboratoryjnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Atrament indyjskiDowolny dostawca
18G x 1 1/2 igłyBD305196
strzykawka 3 mlBD309657
TrisMP Biomedicals819620
F D & C Niebieski 1Spectra Colors Corporation5.FC.0010P0Barwnik spożywczy używany do wizualizacji
roztworu Ringera do wstrzykiwań DNA (1 L)
        - 7,2 g NaClSigma-AldrichS-9888
        - 0,37 g KClSigma-AldrichP-4504
        - 0.225 g CaCl2• 2H2OFisher Scientific10043-52-4
        - 0,217 g Na2HPO4.7H2OSigma-AldrichS-9390
        - 0,02 g KH2PO4Sigma-AldrichP-5379
        - ddH2O do 800 ml i dostosować pH do 7,4
        - ddH2O do 1 L
        - Filtr i autoklaw
PBS (roztwór buforowany fosforanem) (1 l)
        - 8 g NaClSigma-AldrichS-9888
        - 0,2 g KClSigma-AldrichP-4504
        - 1,15 g Na2HPO4• 7H2OSigma-AldrichS-9390
        - 0,2 g KH2PO4Sigma-AldrichP-5379
        - ddH2O do 800 ml i dostosować pH do 7,2
        - ddH2O do 1 L i filtr
        - 1 ml DEPC (Dietylopirowęglan)Sigma-AldrichD-5758
        - Wstrząśnij energicznie i odstaw na noc w temperaturze
        - Autoklaw
Łyżka do przesiewaniaDowolny dostawca
Sterylne płytki Petriego z polityrynu 60 x 15 mmCorning Life Sciences351007
Roztwór do odkażania RNaz RNaseZapLife TechnologiesAM9780
Nożyczki chirurgiczne z cienkim czubkiemDowolny dostawca
Pęseta prosta z drobnym czubkiemDowolna dostawca
Ciągnięta szklana igła wykonana ze szklanych kapilar o wymiarach 1,1 x 75 mmKimble Chase40A502
9-calowa szklana pipeta PasteuraDowolny dostawca
Ręczna pompa do pipetDowolny dostawca
Przezroczyste probówki polipropylenowe do mikrowirówek o pojemności 1,5 mlCorning Life SciencesMCT-150-C
MikrowirówkaDowolny dostawca
Rozwiązanie RNAlater do stabilizacji RNALife TechnologiesAM7020
Zestaw do izolacji całkowitego RNA RNAwodnyTechnologiesAM1912
Biologia molekularna Etanol klasyDowolny dostawca
Zestaw RNA 6000 NanoAgilent Technologies5067-1511
2100 Elektroforeza Instrument do bioanalizatoraAgilent TechnologiesG2939AA
Zestaw do przygotowania próbek RNA Truseq v2IlluminaRS-122-2001/RS-122-2002
pokojowej Life

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1 (8), 207-20 (1999).
  2. Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Dev. Dyn. 229 (3), 433-439 (2004).
  3. Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. J. Vis. Exp. (9), 10-3791 (2007).
  4. Sauka-Spengler, T., Barembaum, M. Gain- and loss-of-function approaches in the chick embryo. Methods Cell Biol. 87, 237-256 (2008).
  5. Ghadge, G. D., et al. Truncated wild-type SOD1 and FALS-linked mutant SOD1 cause neural cell death in the chick embryo spinal cord. Neurobiol. Dis. 21 (1), 205-20 (2006).
  6. Megason, S. G., McMahon, A. P. A mitogen gradient of dorsal midline Wnts organizes growth in the CNS. Development. 129 (9), 2087-2098 Forthcoming.
  7. Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Dev. Biol. 233 (1), 13-21 (2001).
  8. Cloonan, N., et al. Stem cell transcriptome profiling via massive-scale mRNA sequencing. Nat. Methods. 5 (7), 613-619 (2008).
  9. Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat. Methods. 5 (7), 621-628 (2008).
  10. Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J. Galaxy Team. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), 86(2010).
  11. Trichas, G., Begbie, J., Srinivas, S. Use of the viral 2A peptide for bicistronic expression in transgenic mice. BMC Biol. 6, 40(2008).
  12. Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular cloning. A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1982).
  13. Wang, Y., et al. Evaluation of the coverage and depth of transcriptome by RNA-Seq in chickens. BMC Bioinformatics. 12, 10-1186 (2011).
  14. Blankenberg, D., et al. Manipulation of FASTQ data with Galaxy. Bioinformatics. 26 (14), 1783-1785 (2010).
  15. Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), 36(2013).
  16. Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat Biotechnol. 28 (5), 511-515 (2010).
  17. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  18. Vieceli, F. M., Simões-Costa, M., Turri, J. A., Kanno, T., Bronner, M., Yan, C. Y. The transcription factor chicken Scratch2 is expressed in a subset of early postmitotic neural progenitors. Gene Expr. Patterns. 13 (5-6), 189-196 (2013).
  19. Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).
  20. Katahira, T., Nakamura, H. Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system. Dev. Growth. Differ. 45 (4), 361-367 (2003).
  21. Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo. Dev. Dyn. 231 (3), 592-600 (2004).
  22. Lu, Y., Lin, C., Wang, X. PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord. Nucleic Acids Res. 37 (21), 141(2009).
  23. Simões-Costa, M., Tan-Cabugao, J., Antoshechkin, I., Sauka-Spengler, T., Bronner, M. E. Transcriptome analysis reveals novel players in the cranial neural crest gene regulatory network. Genome Res. 24 (2), 281-290 (2014).
  24. Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat. Protoc. 7 (3), 562-578 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

In Ovo ElectroporationTranscriptome ComparisonGalaxy Public ServerRNA Isolation KitFASTQ Quality TrimmerCufflinks ToolDifferential Expression Genes

Powiązane artykuły