Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Namnażanie wirusa Homalodisca coagulata-01 za pośrednictwem hodowli komórkowej Homalodisca vitripennis

11.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51953

⸱

25 września 2014

 ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Texas at Tyler, 2U. S. Horticultural Research Laboratory, USDA ARS

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do rozmnażania komórek Homalodisca vitripennis i HoCV-1 in vitro. Pożywkę usunięto z kultur dodatnich w stosunku do HoCV-1 i ekstrahowano RNA co 24 godziny przez 168 godzin. Przeżywalność komórek określono ilościowo za pomocą barwienia błękitem trypanowym. Całe cząsteczki wirusa zostały wyekstrahowane po zakażeniu. Wyekstrahowany RNA oznaczono ilościowo metodą qRT-PCR.

Streszczenie

Szklistoskrzydły strzelec wyborowy (Homalodisca vitripennis) to wysoce ruchliwy i polifagiczny owad występujący w południowo-zachodnich Stanach Zjednoczonych. Owady te są dominującymi wektorami Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), bakterii ograniczonej do ksylemu, która jest czynnikiem sprawczym choroby Pierce'a (PD) winorośli. Choroba Pierce'a jest szkodliwa ekonomicznie; w związku z tym H. vitripennis stał się celem strategii zarządzania patogenami. Dicystrowirus zidentyfikowany jako Homalodisca coagulata virus-01 (HoCV-01) jest związany ze zwiększoną śmiertelnością w populacjach H. vitripennis. Ponieważ do replikacji HoCV-01 wymagana jest komórka gospodarza, hodowla komórkowa zapewnia jednolite środowisko dla ukierunkowanej replikacji, które jest logistycznie i ekonomicznie cenne dla produkcji biopestycydów. W ramach tego badania opracowano system do namnażania komórek H. vitripennis na dużą skalę za pomocą hodowli tkankowej, zapewniając mechanizm replikacji wirusa. HoCV-01 został wyekstrahowany z owadów na całym ciele i wykorzystany do inokulacji hodowanych komórek H. vitripennis na różnych poziomach. Pożywkę hodowlaną usuwano co 24 godziny przez 168 godzin, RNA ekstrahowano i analizowano za pomocą qRT-PCR. Komórki barwiono błękitem trypanowym i policzono w celu ilościowego określenia przeżywalności komórek za pomocą mikroskopii świetlnej. Całe cząsteczki wirusa ekstrahowano do 96 godzin po zakażeniu, co było punktem czasowym określonym jako poprzedzający całkowite załamanie się hodowli komórkowej. Komórki poddano również barwieniu fluorescencyjnemu i obejrzano za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu zbadania aktywności wirusa na przyłączanie F-aktyny i integralność jąder. Wniosek z tego badania jest taki, że komórki H. vitripennis mogą być hodowane i wykorzystywane do masowej produkcji HoCV-01 na odpowiednim poziomie, aby umożliwić produkcję biopestycydu.

Wprowadzenie

Strzelec wyborowy o szklistych skrzydłach (Homalodisca vitripennis Germar 1821) został zidentyfikowany jako dominujący wektor Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), czynnika wywołującego chorobę winorośli Pierce'a (PD) w Ameryce Północnej1. Zarządzanie populacją owadów szybko stało się przedmiotem badań mających na celu zwalczanie tego niszczycielskiego problemu dla przemysłu winiarskiego w Kalifornii i w całych południowych Stanach Zjednoczonych. Jednoniciowy wirus RNA o pozytywnym sensie, należący do rodziny Dicistroviridae, wirus Homalodisca coagulata-01 (HoCV-01) został zidentyfikowany w dzikich populacjach H. vitripennis i wykazano, że zwiększa śmiertelność w tych populacjach2-4, jednocześnie obniżając odporność owadów na insektycydy.

Opracowanie metod skutecznego wychowania zakażonego H. vitripennis do dorosłości w warunkach laboratoryjnych było trudne, ponieważ H. vitripennis ma różne specyficzne dla danego etapu potrzeby żywieniowe, które wymagają różnych roślin żywicielskich5-8. Do hodowli żywego H. vitripennis w Stanach Zjednoczonych wymagane są specjalne obiekty; w związku z tym hodowla komórkowa jest bardziej ekonomiczną i realną alternatywą, a także coraz bardziej istotną dla wykrywania i replikacji HoCV-012,9. Chociaż opisano podstawowe metody zakładania kultur komórkowych H. vitripennis, metody te nie zostały jeszcze wykorzystane do komercyjnej produkcji środków kontroli biologicznej, takich jak wirusy2.

Ogólnym celem poniższych procedur jest wytworzenie wysokiego stężenia HoCV-01 odpowiedniego do wykorzystania jako środek kontroli biologicznej. Replikacja wirusa wymaga żywej komórki, dlatego skuteczna hodowla i optymalizacja kultur H. vitripennis ma kluczowe znaczenie dla postępu w produkcji opłacalnych poziomów wirusa.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla komórkowa

UWAGA: Linie komórkowe Homalodisca vitripennis założone przez laboratorium Dr. Wayne Hunter w USDA Agricultural Research Service (Ft. Pierce, FL USA) zostały użyte do zainicjowania laboratoryjnego zapasu składającego się z mieszanych etapów komórkowych, w tym początkowych fibroblastów i monowarstw.

  1. Następujące procedury należy wykonać w sterylnym środowisku laboratoryjnym utrzymywanym w zakresie temperatur 20-24 °C za pomocą kolb hodowlanycho średnicy 25 cm2.
  2. Hodować i utrzymywać kultury w kolbach tkankowych o średnicy 25 cm2 przy użyciu pożywki H2G+ Leafhopper, zmodyfikowanej pożywki dla pszczół miodnychWH2 10 (Tabela 1).
  3. Inkubować kolby hodowlane w temperaturze 24 °C przy wilgotności ~53%.
  4. Użyj odwróconego mikroskopu o całkowitym powiększeniu (TM) 100X, aby monitorować wzrost hodowli, np. sprawdzić, czy nie ma nieprawidłowego wzrostu komórek, monitorować pod kątem potencjalnych zanieczyszczeń i sprawdzać postęp wzrostu na całej powierzchni hodowli.
  5. Przeprowadzić pełną zmianę pożywki (~4 ml pożywki na kolbę) co 7 - 10 dni bez naruszania powierzchni hodowli.
  6. Przekaż kultury, gdy powierzchnia hodowli jest w około 80% pokryta wzrostem komórek (zlewającym się) przy użyciu 0,25% trypsyny zawierającej kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) w celu dysocjacji komórek. Dodaj ~ 2 - 3 ml trypsyny do każdej kolby hodowlanej i wystawiaj kulturę (kultury) na działanie enzymu przez krótki czas (5 - 10 minut), aby uzyskać całkowitą dysocjację komórek.
  7. Dodać równą ilość świeżej pożywki do kolby(-i) hodowlanej(-ych) (~2 - 3 ml) w celu zatrzymania aktywności enzymu i przenieść cały roztwór do stożkowej probówki w celu odwirowania.
  8. Komórki osadu przez odwirowanie w temperaturze 4 °C przez 6 minut przy 350 x g.
  9. Usunąć supernatant bez naruszania osadu komórkowego i dodać ~8 ml świeżej pożywki do każdej probówki. Delikatnie homogenizuj komórki za pomocą pipety.
  10. Podzielić kultury w stosunku 1:2 na kolby o średnicy 25 cm(~ 4 ml roztworu komórkowego na kolbę) i pozostawić świeżo przekazane kultury w spokoju przez 48 godzin, aby umożliwić komórkom w zawiesinie bezpieczne przyczepienie się do powierzchni kolby.
    UWAGA: Hodowla komórek na 48-dołkowych sterylnych płytkach do hodowli tkankowych o powierzchni wzrostu 1cm2 jest również możliwa i może być utrzymywana w taki sam sposób jak kolby hodowlane ze zmniejszeniem objętości pożywki hodowlanej do ~250 μl.

2. Ekstrakcja całego wirusa

  1. Homogenizować całe ciała wiruso-dodatniego H. vitripennis w buforze fosforanowym o pH ~ 7,2 z 0,02% trójwodzianu dietyloditiokarbaminianu sodu (DETCA) poprzez wirowanie przez ~ 10 sekund przerwy, aż nie będzie już obecnych dużych grudek tkanki. Ekstrakcja wirusa przez szybkie wirowanie w temperaturze 124 500 x g przez 4 godziny w temperaturze 4 °C lub 22 000 x g przez 16 godzin w temperaturze 4 °C. Jeśli na górze utworzy się osad, usuń go sterylnym wacikiem11.
  2. Odrzucić supernatant.
  3. Zebrać osad i rozpuścić w 5 ml 10 mM buforu fosforanowego (bez DETCA), pH ~7,2, zawierającego 0,4% kwasu Na-deoksycholowego i 4% eteru sześciorakadecylowego glikolu polietylenowego (Brij 52).
    1. Aby dobrze wymieszać osad, usuń osad z boku rurki i w razie potrzeby zmiażdż go aż do roztworu.
    2. Dodaj więcej 10 mM buforu fosforanowego w odstępach co ~ 5 ml, aby w razie potrzeby pomóc osadkowi przejść do roztworu i połączyć w 2 probówki11.
  4. Odwirować roztwór o stężeniu 300 x g przez 15 minut11.
  5. Usunąć supernatant i przepuścić roztwór przez filtr 0,45 μm, a następnie zebrać filtrat do dużej probówkizbiorczej 11.
  6. W razie potrzeby przenieść filtrat do membrany dializacyjnej o odciętej masie cząsteczkowej (MWCO) 3,5 kD, używając niewielkich ilości 10 mM buforu fosforanowego (pH 7) niezawierającego DETCA11.
  7. Umieścić membranę dializacyjną w dużej zlewce wypełnionejddH2O w temperaturze 4 °C. Zmieniać ddH2O co godzinę przez 5-6 godzin, aż w membranieutworzy się biały osad 11.
  8. Zebrać oczyszczonego wirusa z wnętrza membrany i poddać 100% roztwór wirusa serii 10-krotnego rozcieńczenia, dodając 10 μl roztworu do 90 μl ddH2O. Następnie dodać 10 μl rozcieńczenia do kolejnych 90 μl ddH2O, aż do uzyskania rozcieńczenia 1:100 000.
  9. Roztwór wirusa należy przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Replikacja wirusa

  1. Komórki nasienne w 48-dołkowych płytkach hodowlanych i rosną we wszystkich rzędach, aż wzrost komórek będzie zlewał się w 80% (około 72 godziny po przejściu, jeśli komórki rosną w średnim tempie).
  2. Zaszczepić każdy rząd komórek seryjnie rozcieńczonym wirusem, gdy wzrost komórek osiągnie zbieg, tj. jeden rząd rozcieńczenia 1:10, jeden rząd rozcieńczenia 1:100 itd., z wyjątkiem górnego rzędu. Użyj górnego rzędu jako kontrolki i dodaj 10 μl ddH2O do każdej studzienki jako regulatora głośności.
    1. W celu ustalenia początkowego stężenia komórek w celu porównania z eksperymentalną liczbą komórek, należy przeprowadzić dysocjację i policzyć pierwszą studzienkę z każdego rzędu przed początkowym zaszczepieniem wirusem jakichkolwiek studzienek w kulturach.
  3. Monitorować płytki hodowlane co 24 godziny po inokulacji wirusa pod kątem wszelkich zmian koloru pożywki wskazujących na zmianę pH oraz wszelkich zmian w morfologii komórek.
  4. Wyobraź sobie jedną kolumnę płytki testowej w każdym punkcie czasowym za pomocą mikroskopu odwróconego przy 100X TM.
  5. Usunąć całe podłoże z kolumny, która została zobrazowana w każdym 24-godzinnym punkcie czasowym i przechowywać je krótkotrwale w temperaturze -20 °C w celu ekstrakcji RNA i kwantyfikacji wirusa lub długotrwale w temperaturze -80 °C.
  6. Oddziel komórki od studzienek po usunięciu pożywki, jak opisano wcześniej w krokach 1.6 – 1.9, używając tylko ~250 μl 0.25% trypsyny EDTA i świeżej pożywki do zatrzymania aktywności enzymu oraz ~250 μl świeżej pożywki do ponownego zawieszenia osadu komórkowego.
  7. Dodaj 10 μl 0,4% barwienia błękitem trypanowym do każdej probówki zawierającej komórki, aby przeprowadzić liczenie komórek po dysocjacji komórek przez każdy 24-godzinny okres przez jeden tydzień. Pozostaw plamę na 10 minut przed wykonaniem liczenia komórek.
    1. Przeprowadź liczenie komórek w ciągu 1 godziny od wystawienia na działanie barwnika, w przeciwnym razie żywe komórki zaczną wchłaniać barwnik, a także komórki nieżywotne.
  8. Powoli dodawać 10 μl barwionego roztworu komórek z każdej strony standardowego hemocytometru za pomocą mikropipety. Pozwolić, aby roztwór został wchłonięty przez działanie kapilarne, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.
  9. Policz liczbę żywotnych (niebarwionych) komórek po obu stronach hemocytometru (odpowiednik 4 zliczeń z 16 kwadratów hemocytometru). Wykonaj inwentaryzację komórek dla każdego dołka kolumny, która została usunięta.
  10. Uśrednij liczbę komórek z każdej kolumny i użyj następującego wzoru, aby uzyskać całkowitą liczbę komórek: (średnia liczba komórek / 4) x współczynnik rozcieńczenia = liczba komórek x 104 ml. Jest to gęstość komórek lub liczba żywotnych komórek w hodowli.

4. Ekstrakcja wirusa z hodowli komórkowej

  1. Usunąć leczone komórki H. vitripennis z kolb hodowlanych, jak opisano wcześniej w krokach 1.6 – 1.8, używając tylko ~250 μl 0,25% trypsyny EDTA i świeżej pożywki, aby zatrzymać aktywność enzymu.
  2. Odrzucić supernatant.
  3. Ekstrahować wirusa z komórek hodowlanych zgodnie z protokołem opisanym wcześniej w krokach 2.3 – 2.8.

5. Ekstrakcja RNA

  1. Ekstrahować RNA z pożywki próbek pobranych podczas każdej tygodniowej próby z użyciem tiocyjanianu guanidyny, ekstrakcji fenolem i chloroformem guanidyny, przeznaczonej do próbek ciekłych zgodnie z protokołem producenta.
  2. Wyekstrahowane próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C.

6. RT-PCR

  1. Ustal standardy wirusowe dla RT-PCR, przeprowadzając tradycyjną PCR przy użyciu pary starterów HoCV RT-PCR starter 1 (naprzód 5′-GCTCCCCGGCTGCTGCTGGTT-3′, odwrotny 5′-ACGACGGATCTGCGTGCCAA-3′) z izolatem wirusa z całego ciała H. vitripennis.
  2. Poddaj produkt PCR elektroforezie żelowej przez 60 minut przy napięciu 120 V w 2% żelu agarozowym zawierającym 0,1% bromku etydyny.
  3. Usuń pasma z żelu i oczyść za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z protokołem producenta.
  4. Zebrać wszystkie wycięte i oczyszczone w żelu produkty i dalej oczyścić przez podstawowe wytrącanie etanolu. Eluować produkt wytrącania w około 30 μl Tris EDTA (TE) w celu zwiększenia całkowitego stężenia próbki.
  5. Określ ilościowo poziom cDNA w próbkach zbiorczych za pomocą spektrofotometrii przy użyciu ustawień długości fali 260/230 do wykrywania kwasów nukleinowych.
  6. Wykonać dziesięciokrotną serię seryjnych rozcieńczeń oczyszczonej próbki w zakresie od 57 ng/μl do 57 ag/μl (10-18). Przeprowadzić rozcieńczanie seryjne podobne do opisanego w ppkt 2.8 z dostosowaniem do różnicy w wymaganiach dotyczących stężenia.
  7. Określić granice wykrywalności serii rozcieńczeń, wykonując qRT-PCR przy użyciu zestawu qRT-PCR z wiarygodnym oznaczaniem ilościowym transkryptów o niskiej liczebności.
    UWAGA: Stężenia wirusa niższe niż 5 x 10-3 kopie nie są wykrywalne.
  8. Wyodrębnić RNA z próbek eksperymentalnych, jak opisano wcześniej w kroku 5.1, i określić ilościowo za pomocą spektrofotometrii.
  9. Znormalizować wszystkie wyekstrahowane próbki do 5 ng/μl za pomocą wody wolnej od nukleaz.
  10. Przeprowadzić qRT-PCR na wszystkich próbkach, w duplikatach, jako reakcje 25 μl przy użyciu jednoetapowego zestawu qRT-PCR z możliwością wykrywania niskiej liczby kopii w następujący sposób: 50 °C utrzymać przez 10 minut; 95 °C utrzymać przez 5 minut; 30 cykli po 95 °C przez 10 sekund, 60 °C przez 30 sekund; stopić w temperaturze od 50 do 99 °C przez 5 sekund na każdym etapie.
    1. Przygotować mieszankę wzorcową tak, aby każda mieszanina reakcyjna zawierała 12,5 μl 1x mieszanki wzorcowej, 1,0 μl (0,3 μM) startera wstępnego, 1,0 μl (0,3 μM) startera odwrotnego, 0,25 μl odwrotnej transkryptazy i zmienne ilości matrycy w oparciu o wartości standaryzacji.
    2. Doprowadzić całkowitą objętość reakcji do 25 μl za pomocą wody wolnej od RNazy.
    3. Włączyć pięć standardowych stężeń do każdej serii PCR z następującymi numerami kopii: 5 x 10-10, 5 x 10-8, 5 x 10-6, 5 x 10-4 i 5 x 10-2 kopii. Ustaw próg dla każdego przebiegu na nieco poniżej fluorescencji 10x-2,5, aby zredukować szum podczas wczesnej akwizycji na początku każdego przebiegu.

7. Mikroskopia konfokalna

  1. Hodować komórki Homalodisca vitripennis na dwunastodołkowej płytce zawierającej szklane szkiełka nakrywkowe o średnicy 18 mm w każdym dołku.
  2. Zaszczepiać jedną kolumnę na płytce co 24 godziny przez okres czterech dni, po uzyskaniu monowarstwy. Upewnij się, że każda kolumna zawiera studzienkę kontrolną, studzienkę o niskim rozcieńczeniu wirusa (1:10) i studzienkę o wysokim rozcieńczeniu wirusa (1:100 000). Użyj rozwiązań antywirusowych uzyskanych w kroku 2.8.
  3. Usuń wszystkie podłoża piątego dnia i przemyj komórki dwukrotnie 1x PBS (pH 7,4).
  4. Utrwalić komórki zimnym 4% paraformaldehydem w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
  5. Dodaj 500 μl 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) do komórek i myj je przez 10 minut w temperaturze pokojowej na kołysku z niską prędkością. Umyj komórki trzy razy.
  6. Dodaj 500 μl 0,1% Triton X-100 do komórek, aby je przepuszczalne. Pozostaw na 10 minut w RT.
  7. Ponownie umyj komórki, jak opisano wcześniej w kroku 7.5.
  8. Dodać 500 μl 5% roztworu albuminy surowicy bydlęcej (BSA), aby zablokować komórki w temperaturze pokojowej. Odstawić na 2 godziny, a następnie wyjąć.
  9. Rozcieńczyć falloidynę sprzężoną z czerwienią rodaminą (RCP) w stosunku 1:250 w 1x PBS zawierającym 5% BSA i dodać 250 μl rozcieńczenia do każdego dołka w celu wybarwienia F-aktyny.
  10. Przykryj płytkę folią aluminiową, aby zapobiec bieleniu barwnika i inkubować komórki w temperaturze 4 °C O/N.
  11. Usunąć RCP po 12 godzinach inkubacji i zastąpić go 250 μl 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) (250 μg/ml) rozcieńczonego w 1x PBS zawierającym 5% BSA, w celu zabarwienia jąder komórek.
  12. Inkubować komórki zawierające DAPI w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  13. Umyj komórki trzykrotnie 1x PBS, jak opisano wcześniej w kroku 7.5.
  14. Delikatnie wyjmij szkiełka nakrywkowe z dołków i zamontuj na szkiełkach mikroskopowych za pomocą nośnika montażowego z odczynnikiem zapobiegającym blaknięciu.
  15. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia w światłoszczelnych pudełkach, dopóki nie zostaną obejrzane pod mikroskopem konfokalnym. Przeglądaj przygotowane preparaty tak szybko, jak to możliwe, ponieważ barwniki mogą szybko blaknąć.
  16. Obrazowanie barwionych komórek za pomocą systemu konfokalnego wyposażonego w mikroskop zawierający soczewkę planapochromatyczną 63X (olej).
    1. Ustaw długości fal lasera na 543 ± wzbudzenie 10 nm i emisję 575 ± 10 nm dla falloidyny sprzężonej z czerwienią Rhoadmine oraz 369 ± wzbudzenie 10 nm i emisję 450 ± 30 nm dla DAPI.
    2. Użyj identycznych ustawień wzmocnienia i przesunięcia dla detektora, aby uzyskać wszystkie obrazy.
    3. Przetwarzaj obrazy za pomocą odpowiedniego oprogramowania do przetwarzania i sortowania obrazów, a następnie importuj żądane obrazy do oprogramowania do zarządzania obrazami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przyczepienie i wzrost komórek obserwowano w ciągu 48 hr od pasażowania zarówno w małych, jak i dużych kolbach hodowlanych, zarówno w hodowlach pierwotnych, jak i w kolejnych pasażach. W tym samym przedziale czasowym zaobserwowano również wzrost i rozwój fibroblastów. W przypadku zakłócenia nowo zaszczepionych kolbach przed upływem 48 hr odnotowano widoczny spadek przyczepienia komórek, co prowadziło do wolniejszego wzrostu kultur, a niekiedy do całkowitego braku przyczepienia lub wzrostu. Komórki osiągały około 80% konf...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Rosnące obawy związane z napływem inwazyjnych gatunków rolniczych doprowadziły do zwiększonego zapotrzebowania na nowe metodologie obrony przed pojawiającymi się szkodnikami i patogenami. Skupienie się na zapobieganiu chorobom i leczeniu ich obejmuje zarządzanie wektorami patogenów i było głównym celem tego badania. Ekonomia odgrywa kluczową rolę w podejmowaniu decyzji o produkcji tego rodzaju biopestycydów w celu zwalczania wektorów patogenów w rolnictwie, ponieważ praktyczne zastosowanie musi obejmować duże ilości na d...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Texas Pierce's Disease Research and Education Program oraz USDA-APHIS za wsparcie finansowe dla tego projektu. Chcielibyśmy również podziękować Hema Kothari z University of Texas Health Science Center w Tyler za jej pomoc w mikroskopii konfokalnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kolby do hodowli komórek CorningSigma AldrichCLS430168Powierzchnia 25 cm2, nasadka skośna, nasadka (uszczelka korkowa)
Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71OlympusMikroskop odwrócony i kamera
Roztwór trypsyny-EDTASigma AldrichT40490,25%, sterylnie filtrowany, BioReagent, odpowiedni do hodowli komórkowych, 2,5 g trypsyny wieprzowej i 0,2 g EDTA i byka; 4Na na litr Hanks′ Zrównoważony roztwór soli z czerwienią fenolową
Greiner CELLSTAR wielodołkowe płytki hodowlaneSigma AldrichM893748 dołków (TC traktowane pokrywką)
DETCASigma Aldrich228680Dityloditiokarbaminian sodu trihydrat
System filtrów próżniowych butelkowych CorningSigmaAldrich CLS431206Membrana z octanu celulozy, wielkość porów 0,45 i mu; m, Powierzchnia membrany 54,5 cm2, Pojemność filtra 500 ml
Brij 52Sigma Aldrich388831Eter sześciokątny glikolu polietylenowego
Roztwór buforowy fosforanuSigma AldrichP5244Otrzymany w postaci 100 mM rozcieńczony do 10 mM sterylną wodą
TRIzol LSLife Technologies10296-028
AgarozaSigma AldrichA5304Do elektroforeza
Bromek etydynySigma AldrichE7637BioReagent, do biologii molekularnej, proszek
QIAquickQiagen28704
QuantiTect qRT-PCR kitQiagen204243
4% paraformaldehydSigma AldrichP6148Klasa odczynnika, krystaliczny
PBSFosforan Sigma AldrichP5368 buforowana sól fizjologiczna
Triton X-100Sigma AldrichX100
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma AldrichA2153
Falloidyna sprzężona z czerwoną rodaminąLife TechnologiesR415Falloidyna rodaminy to sonda F-aktyny o wysokim powinowactwie sprzężona z czerwono-pomarańczowym barwnikiem fluorescencyjnym, tetrametylorodaminą
DAPISigma AldrichD9542
ProLong Gold Antiblade ReagentLife TechnologiesP36934
LSM510 Meta Confocal SystemCarl Zeiss
LSM Zen 2007 SoftwareCarl Zeiss
Grace' s Pożywka dla owadów (uzupełniona, 1x)Sigma AldrichG8142H2G+ skoczek do liści pożywka składnik
L-histydyna monohydratSigma AldrichH8125H2G+ skoczek do liści średni składnik
Medium 199 (10x)Sigma AldrichM4530H2G+ skoczek średni składnik
Medium 1066 (1x)Sigma AldrichC0422H2G+ skoczek do liści średni składnik
Hank' s Sole zrównoważone (1x)Sigma Aldrich51322CH2G+ skoczek liściowy średni składnik
L-glutamina (100x)Sigma AldrichG3126H2G+ skoczek
średni składnik MEM, mieszanka aminokwasów (50x)Sigma Aldrich56419CH2G+ skoczek liściowy średni składnik
1 M roztwór MgClSigma AldrichM8266H2G+ skoczek liściowy średni składnik
Pen-Strep (w/ glutamina)Sigma AldrichG6784H2G+ skoczek liściowy średni składnik
NystatynaSigma AldrichN6261H2G+ skoczek liściowy średni składnik
GentamycinSigma Aldrich46305H2G+ skoczek liściowy średni składnik
DekstrozaSigma AldrichD9434H2G+ skoczek liściowy średni składnik
Surowica bydlęca płoduSigma AldrichF2442Skoczek do liści H2G+ średni składnik
liściowy

Bibliografia

  1. Takiya, D. M., McKamey, S. H., Cavichioli, R. R. Validity of Homalodisca and of H. vitripennis as the Name for Glassy-winged Sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99 (4), 648-655 (2006).
  2. Hunter, W. B., Katsar, C. S., Chaparro, J. X. Molecular analysis of capsid protein of Homalodisca coagulata Virus-1, a new leafhopper-infecting virus from the glassy-winged sharpshooter, Homalodisca coagulata. J. Insect Sci. 6 (28), 1-10 (2006).
  3. Hunnicutt, L. E., Hunter, W. B., Cave, R. D., Powell, C. A., Mozoruk, J. J. Genome sequence and molecular characterization of Homalodisca coagulata virus-1, a novel virus discovered in the glassy-winged sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae). Virology. 350 (1), 67-78 (2006).
  4. Hunnicutt, L. E., Mozoruk, J., Hunter, W. B., Crosslin, J. M., Cave, R. D., Powell, C. D. Prevalence and natural host range of Homalodisca coagulata virus-1 (HoCV-1). Virology. 153, 61-67 (2008).
  5. Jones, W. A., Setamou, M. Biology and Biometry of Sharpshooter Homalodisca coagulata (Homoptera) Cicadellidae) Reared on Cowpea. Ann. Entomol. Soc. Am. 98 (3), 322-328 (2005).
  6. Turner, W. F., Pollard, H. N. Life histories and behavior of five insect vectors of phony peach disease. US Dep. Agric. Tech. Bull. 1188, 1-32 (1959).
  7. Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. Utilization of primary nutrients by the polyphagous xylophage, Homalodisca coagulata, reared on single host species. Arch. Insect Biochem. Physiol. 32, 65-83 (1996).
  8. Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. Effects of total dietary nitrogen and nitrogen form on the development of xylophagous leafhoppers. Arch. Insect Biochem. Physiol. 42, 37-50 (1999).
  9. Kamita, S. G., Do, Z. N., Samra, A. I., Halger, J. R., Hammock, B. D. Characterization of Cell Lines Developed from the Glassy-winged Sharpshooter, Homalodisca coagulata (Hemiptera: Cicadellidae). In vitro Cell Dev.-An. 41, 149-153 (2005).
  10. Hunter, W. B. Medium for development of bee cell cultures (Apis mellifera: Hymenoptera: Apidae). In vitro Cell Dev.-An. 46 (2), 83-86 (2010).
  11. Identification and whole extraction of Homalodisca coagulata-virus01. (HoCV-01) from Texas glassy-winged sharpshooter populations. Bextine, B., Hunter, W., Marshall, P., Hail, D. CA Pierce’s Disease Symposium, Sacramento, CA, , 9-12 (2009).
  12. Rhoades, D. J. Economics of baculovirus – insect cell production. Cytotechnology. 20, 291-297 (1996).
  13. Briske-Anderson, M. J., Finley, J. W., Newman, S. M. The influence of culture time and passage number on the morphological and physiological development of Caco-2 cells. P. Soc. Exp. Biol. Med. 214 (3), 248-257 (1997).
  14. Chin, L., et al. Deficiency Rescues the Adverse Effects of Telomere Loss and Cooperates with Telomere Dysfunction to Accelerate Carcinogenesis. Cell. 97 (4), 527-538 (1999).
  15. Counter, C. M., et al. Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity. Embo. J. 11, 1921-1929 (1992).
  16. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp. Cell. Res. 25, 585-621 (1961).
  17. Goetz, I. E., Moklebust, R., Warren, C. J. Effects of some antibiotics on the growth of human diploid skin fibroblasts in cell culture. In Vitro. 15 (2), 114-119 (1979).
  18. Coriell, L. L. Methods of prevention of bacterial, fungal, and other contaminations. Contamination in Tissue Culture. Fogh, J. . , Academic Press. 29-49 (1973).
  19. Hambor, J. E. Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing. Bioprocess Tech. Bull. 10 (6), 22-33 (2012).
  20. Abbot, A., Cyranoski, D. Biology’s new dimension. Nature. 424, 870-872 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Namna anie wirusaekstrakcja RNAanaliza qRT PCRmikroskopia konfokalnabarwienie b knitem trypanowymultrawirowaniefiltracja przez membran dializacyjnkwantyfikacja wirusa
Namnażanie wirusa Homalodisca coagulata-01 za pośrednictwem hodowli komórkowej Homalodisca vitripennis
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.