W tym artykule demonstrujemy standardową metodę wytwarzania zatorowej niedrożności tętnicy środkowej mózgu z homologicznymi skrzepami krwi (bogatymi w fibrynę) u dorosłego szczura. Model ten ściśle naśladuje udar niedokrwienny u ludzi i nadaje się do badań przedklinicznych nad terapią trombolityczną udaru niedokrwiennego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zatorowa niedrożność tętnicy środkowej mózgu (MCAO) w udarze niedokrwiennym z homologicznymi zakrzepami krwi u szczurów
W tym artykule
Informacja o sprostowaniu
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Podsumowanie
Streszczenie
Klinicznie, terapia trombolityczna z użyciem rekombinowanego tkankowego aktywatora plazminogenu (tPA) pozostaje najskuteczniejszym sposobem leczenia ostrego udaru niedokrwiennego. Stosowanie tPA jest jednak ograniczone ze względu na jego wąskie okno terapeutyczne oraz zwiększone ryzyko wystąpienia przemian krwotocznych. Istnieje pilna potrzeba opracowania odpowiednich modeli udaru mózgu w celu zbadania nowych leków trombolitycznych i strategii leczenia udaru niedokrwiennego. Obecnie u szczurów i myszy opracowano dwa główne typy modeli udaru niedokrwiennego: szew śródświetlny MCAO i MCAO zatorowy. Chociaż modele MCAO wykorzystujące technikę szwu śródświetlnego są szeroko stosowane w badaniach nad udarem mózgu opartym na mechanizmie, te modele szwów nie naśladują sytuacji klinicznej i nie nadają się do badań trombolitycznych. Wśród tych modeli, zatorowy model MCAO ściśle naśladuje udar niedokrwienny człowieka i nadaje się do badań przedklinicznych terapii trombolitycznej. Ten model zatorowy został po raz pierwszy opracowany u szczurów przez Overgaarda i wsp.1 w 1992 r., a następnie scharakteryzowane przez Zhanga i in. w 1997 r.2. Chociaż zatorowy MCAO cieszy się coraz większym zainteresowaniem, wiele laboratoriów boryka się z problemami technicznymi. Aby sprostać rosnącym potrzebom badań trombolitycznych przedstawiamy wysoce powtarzalny model zatorowego MCAO u szczura, który może rozwinąć przewidywalną objętość zawału na terytorium MCA. Krótko mówiąc, zmodyfikowana rurka PE-50 jest delikatnie przesuwana z tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA) do światła tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA), aż końcówka cewnika dotrze do początku MCA. Przez cewnik umieszcza się pojedynczy homologiczny skrzep krwi u początku MCA. Aby określić powodzenie okluzji MCA, monitorowano regionalny przepływ krwi w mózgu, mierzono deficyty neurologiczne i objętość zawału. Techniki przedstawione w tym artykule powinny pomóc badaczom w przezwyciężeniu problemów technicznych związanych z ustanowieniem tego modelu do badań nad udarem mózgu.
Wprowadzenie
Udar mózgu jest trzecią najczęstszą przyczyną zgonów w Stanach Zjednoczonych, ale możliwości leczenia ostrego udaru pozostają ograniczone. Obecnie dożylna infuzja rekombinowanego tkankowego aktywatora plazminogenu (tPA) w celu rozpuszczenia skrzepów krwi jest najskuteczniejszą terapią ostrego udaru niedokrwiennego. Stosowanie tPA jest jednak ograniczone ze względu na jego wąskie okno terapeutyczne oraz zwiększone ryzyko krwotoku śródmózgowego. Dlatego pilnie potrzebny jest model udaru odpowiedni do badań trombolitycznych.
Tętnica środkowa mózgu (MCA) jest najczęściej zamykana podczas udaru u ludzi. Koncentrując się na tej tętnicy, ustalono wiele zwierzęcych modeli udaru niedokrwiennego. Obecnie opracowano dwa główne typy modeli ogniskowego niedokrwienia gryzoni poprzez okład MCA: model szwu MCAO i zatorowy model MCAO. Chociaż modele MCAO za pomocą techniki szwów śródświetlnych są szeroko stosowane w badaniach nad udarami opartymi na mechanizmie, te modele szwów nie naśladują udaru ludzkiego, ponieważ do 80% udarów u ludzi jest spowodowanych zakrzepicą lub zatorowością. Jednak model udaru zatorowego wykorzystujący skrzepy krwi ściśle naśladuje udar u ludzi i jest uważany za odpowiedni do badań trombolitycznych. Ten model zatorowy został po raz pierwszy opracowany u szczurów przez Overgaarda i wsp.1 w 1992 r., a następnie scharakteryzowane przez Zhanga i wsp. w 1997 r.2 oraz przez Dinapoli i wsp. w 2006 r.3. Chociaż zatorowy MCAO cieszy się coraz większym zainteresowaniem, wiele laboratoriów boryka się z problemami technicznymi.
W tym artykule pokazujemy standardową metodę wytwarzania zatorowego MCAO z homologicznymi skrzepami krwi u dorosłego szczura, który może rozwinąć przewidywalny zawał na terytorium MCA. Techniki przedstawione w tym artykule powinny pomóc badaczom w przezwyciężeniu problemów technicznych związanych z ustanowieniem tego modelu do badań nad udarem mózgu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Oświadczenie etyczne: W tym protokole użyto samców dorosłych szczurów rasy Sprague-Dawley (o wadze 330-380 g). Protokół ten został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w LSU Health Science Center-Shreveport i jest zgodny z "Przewodnikiem opieki i wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych" (ósme wydanie, National Academy of Sciences, 2011).
1. Przygotowanie zmodyfikowanej rurki PE-50
- Trzymaj ręcznie rurkę PE-50 o długości 30 cm nad ogniem gazowym, stopniowo zmiękczaj rurkę. Delikatnie rozciągnij rurkę.
- Za pomocą suwmiarki cyfrowej wybierz punkt na rozciągniętej rurze (Rysunek 1), zaznacz go i przetnij zmodyfikowaną rurkę PE-50 na odcinek o długości 25 cm z końcówką o długości 1 cm (średnica zewnętrzna: 0,30-0,34 mm).
2. Przygotowanie homologicznych skrzepów krwi
- Znieczulić szczura izofluranem (5% do indukcji, 2-3% do podtrzymania) w 70% N2O i 30% O2 za pomocą maski na twarz przed pobraniem krwi. Potwierdź znieczulenie przez uszczypnięcie palca u nogi.
- Wykonać kaniulację tętnicy udowej szczura dawcy opublikowaną metodą4 i przenieść krew z tętnicy udowej bezpośrednio do rurki PE-50 o długości 20 cm. Umieścić probówkę na 2 godziny w temperaturze pokojowej w celu skrzepnięcia krwi, a następnie przechowywać probówkę przez 22 godziny w temperaturze 4 °C. Uwaga: Kantulacja jest wykonywana przy użyciu techniki aseptycznej, jak opisano w kroku 3.1. Szczur-dawca jest odzyskiwany w celu dalszego pobierania próbek.
- Pociąć probówkę PE-50 na segmenty o średnicy 50 mm i wypłukać skrzep z probówki na sterylną szalkę Petriego zawierającą sól fizjologiczną.
- Przenieść skrzep o długości 50 mm do probówki PE-10 o długości 60 mm i połączyć każdy koniec probówki PE-10 z probówką PE-50 o długości 20 cm podłączoną do strzykawki o pojemności 1 ml zawierającej sól fizjologiczną z igłą 23 G (Rysunek 2).
- Przesuwaj skrzep poprzez ciągły naprzemienny ruch z jednej strzykawki do drugiej przez 5 minut, co może usunąć komórki krwi ze skrzepu i zminimalizować kruchość skrzepu pozanaczyniowego, bez naruszania rdzenia fibryny.
- Pociąć skrzep na segment o długości 40 mm i przenieść segment skrzepu do zmodyfikowanego cewnika PE-50 zgodnie z opisem w kroku 1.2 w warunkach aseptycznych. Uwaga: Wszystkie rurki PE są sterylizowane tlenkiem etylenu.
3. Zatorowa niedrożność tętnicy środkowej mózgu (Rysunek 3A,B)
- Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne w autoklawie (minimum 121 °C, 15 PSI, przez 15 minut). Zdezynfekuj stół operacyjny i związany z nim sprzęt chirurgiczny za pomocą 70% etanolu.
- Znieczulić szczura izofluranem zgodnie z opisem w kroku 2.1. Przetestuj głębokość znieczulenia, wykonując uszczypnięcie palców u obu tylnych łap, a każdy zaobserwowany ruch (wycofanie łapy) wskazuje, że zwierzę nie jest wystarczająco znieczulone, aby wykonać operację. Nałóż niewielką ilość maści weterynaryjnej na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Ogol futro na brzusznej części szyi i głowy za pomocą elektrycznych maszynek do strzyżenia, aby odsłonić obszary skóry.
- Umieść szczura w pozycji leżącej na poduszce grzewczej. Założyć sondę doodbytniczą, kontrolować i utrzymywać temperaturę ciała w zakresie 36,5-37,5 °C za pomocą homeotermicznej jednostki sterującej.
- Zdezynfekuj ogoloną skórę i otaczającą sierść 10% jodu powidonu, a następnie 70% etanolu.
- Wykonaj nacięcie linii środkowej o długości 2 cm na szyi pod mikroskopem preparacyjnym. Użyj retraktorów, aby odsłonić pole operacyjne i wypreparować prawą tętnicę szyjną wspólną (CCA), tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA), tętnicę szyjną wewnętrzną (ICA) i tętnicę skrzydłowo-podniebienną (PPA) wolną od otaczających nerwów i powięzi (ryc. 3A). Uwaga: Przed zabiegiem zmień sterylne rękawiczki, jeśli żaden asystent nie pomaga w przygotowaniu zwierzęcia.
- Wyciąć CCA z otaczających nerwów (bez uszkadzania nerwu błędnego) i umieścić sterylny jedwabny szew 5-0 pod tętnicą. Zawiąż węzeł ślizgowy (#1) i chwyć szew za pomocą małego hemostatu i pociągnij nauczony w kierunku ciała.
- Przeanalizuj ECA i jego dwie gałęzie, tętnicę potyliczną (OA) i tętnicę tarczycową górną (STA). Koaguluj dwie gałęzie za pomocą weterynaryjnego urządzenia elektrochirurgicznego. Umieść dwa kawałki sterylnych jedwabnych szwów 6-0 pod ECA.
- Oddziel dwa jedwabie umieszczone pod tętnicą, jeden kawałek w kierunku głowy (dystalny koniec), a drugi w kierunku ciała. Zawiąż ciasną ligaturę (#2) po stronie najbliżej głowy, chwyć jedwab małymi hemostatami i pociągnij w kierunku głowy. Przygotuj luźny węzeł (#3) z drugim jedwabiem do późniejszego wykorzystania.
- Odetnij ICA i PPA od otaczających nerwów (bez uszkadzania nerwu błędnego). Zawiąż PPA szwem 6-0 (#4). Wykonaj węzeł poślizgowy z szwem 6-0 wokół ICA (#4). Alternatywnie, przypnij ICA za pomocą klipsa mikronaczyniowego.
- Wytnij mały otwór (1/2 przelota) w ECA między ciasnymi ligaturami (#2) i luźnymi (#3) za pomocą nożyczek sprężynowych w stylu Vannas. Włożyć zmodyfikowaną rurkę PE-50 zawierającą skrzep krwi do nacięcia i przejść do rozwidlenia CCA. Dokręć luźną ligaturę (#3) wokół światła na tyle, aby zapewnić zachowanie ruchomości rurki w mieszkaniu.
- Odciąć ECA w miejscu małego otworu, aby uwolnić kikut i umieścić kikut poniżej rozwidlenia ECA i ICA; umożliwi to łatwe wsunięcie zmodyfikowanej rurki do ICA. Otwórz ICA i delikatnie przesuń rurkę ze światła ECA do ICA, aż końcówka cewnika dotrze do początku MCA (~17 mm od rozwidlenia). Uwaga: Przed włożeniem końcówki probówki do ECA należy wysterylizować zewnętrzną powierzchnię probówki 70% etanolem, a następnie umyć sterylnym roztworem soli fizjologicznej.
- Wstrzyknąć skrzep przez zmodyfikowany cewnik PE-50 wraz z 10 μl soli fizjologicznej w ciągu 10 sekund za pomocą strzykawki Hamiltona o pojemności 100 μl (ryc. 3B).
- Wyjmij cewnik z ECA 5 minut później. Zremisować Trybunał Obrachunkowy i ponownie otworzyć CCA. Zszyj nacięcie na szyi.
4. Monitorowanie regionalnego przepływu krwi w mózgu (rCBF)
- Przed okluzją MCA wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry głowy o długości 1,2 cm, aby odsłonić kość czaszki. Usuń tkanki z kości czaszki za pomocą skrobaka dentystycznego i sterylnych bawełnianych wymienników. Uwaga: Przed zabiegiem odsłonięty obszar skóry głowy i otaczająca sierść są dezynfekowane 10% jodowidonem, a następnie 70% etanolem.
- Wywierć otwór na zadziory o średnicy 1.5 mm znajdujący się 2 mm z tyłu i 5 mm z boku bregmy za pomocą kulistego zadzioru ze stali nierdzewnej o średnicy 0.7 mm (Rysunek 4).
UWAGA: Utrzymuj oponę twardą w stanie nienaruszonym. - Umieść sondę 0.5 mm nad powierzchnią opony twardej. Monitoruj rCBF po 0 (wartość wyjściowa), 5, 15, 30, 60, 90 i 120 minutach po embolizacji i kontynuuj po 5, 15, 30, 45 i 60 minutach po dożylnym podaniu tPA. Po ostatnim pomiarze rCBF nacięcie skóry głowy zamyka się szwem. Uwaga: Przed nacięciem szyi mierzymy rCBF jako linię bazową przed okluzją MCA. Po okluzji MCA mierzymy rCBF po zamknięciu szwem nacięcia szyi. W ten sposób nacięcie szyi jest utrzymywane w sterylności.
5. Opieka pooperacyjna
- Wstrzyknąć podskórnie 2,5 ml roztworu soli fizjologicznej, aby zapobiec odwodnieniu i wstrzyknąć Buprenex (0,05 mg/kg, SC) natychmiast po zabiegu i co 6-12 godzin, w razie potrzeby w celu złagodzenia bólu.
- Przerwać znieczulenie izofluranem. Umieścić szczura w weterynaryjnej komorze rekonwalescencji o temperaturze 37 °C (utrzymać zwierzę w cieple) i prowadzić obserwację. Zwykle szczur potrzebuje 10 minut, aby dojść do siebie po znieczuleniu. Następnie umieść zwierzę w wysterylizowanej klatce, umieść trochę zwilżonego jedzenia na szalce Petriego w klatce i włóż klatkę z powrotem do pomieszczenia do sterylizacji zwierząt.
- 24 godziny po udarze należy poddać szczura eutanazji za pomocą przedawkowania pentobarbitalu sodu (100 mg/kg masy ciała, IP).
6. Wynik deficytu neurologicznego
- Wykonaj punktację Bedersona przed i po 2 godzinach po embolizacji. Użyj skali ocen 0-3, jak opisano wcześniej5: 0, podnosząc szczura za ogon, zwierzę wyciąga obie kończyny przednie do podłogi i nie wykazuje żadnych innych deficytów (normalny ruch); 1, podnosząc szczura za ogon, zegnij przeciwległą kończynę przednią; 2, zmniejszona odporność na odepchnięcie boczne (i zgięcie kończyn przednich) bez krążenia; 3, takie samo zachowanie jak stopień 2 z krążeniem.
UWAGA: Szczury wykazujące wynik Bedersona = 0 (brak deficytu) po 2 godzinach od embolizacji są wykluczone z dalszych badań.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Do monitorowania rCBF podczas indukcji niedokrwienia mózgu wykorzystano laserową flowmetrię dopplerowską (LDF)6,7. Wiele laboratoriów, w tym nasze, wykorzystuje rCBF do identyfikacji zwierząt z udaną okluzją MCA, jednak progi wartości bazowych różniły się między laboratoriami, co wiązało się z miejscem pomiaru. Sonda LDF została umieszczona 2 mm za bregma i 5 mm bocznie względem bregma, zgodnie z wcześniejszym opisem6. rCBF monitorowano w 0, 5, 15, 30, 60, 90 i 120 min po wstrzyknięciu skrzepu. Na p...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym badaniu wykazaliśmy standardową metodę wykonywania zatorowego modelu udaru MCAO u szczura, w którym pochodzenie MCA jest zamknięte przez skrzep bogaty w fibrynę. Główną zaletą tego modelu jest: niedrożność łodygi MCA z zakrzepem krwi bogatym w fibrynę jest podobna do udaru zakrzepowo-zatorowego u ludzi, model udaru zatorowego jest odpowiedni do przeprowadzenia badań przedklinicznych terapii fibrynolitycznej oraz że model ten może rozwinąć odtwarzalną i przewidywalną objętość zawału na terytorium dostarczonym przez ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mamy żadnych potencjalnych sprzecznych interesów, które moglibyśmy ujawnić.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty National Institutes of Health HL087990 (G.L.).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| rh-tPA | Chemiczny | Genentech | |
| Chlorek 2,3,5-trifenylotetrazolu | Chemiczny | Sigma | T8877 |
| Parownik anestezjologiczny | Sprzęt Soma | Technology | Dräger Vapor 19.1 |
| Akumulatorowa mikrowiertarka o dużej prędkości | Sprzęt | Narzędzia do nauki pięknej | 18000-17 |
| Zakrzywione nożyczki | Sprzęt | Narzędzia do nauki pięknej | 14117-14 |
| Kleszcze Dumonta (Medyczne #7) | Sprzęt | Narzędzia do nauki o dużej | 11270-20 |
| Kleszcze Dumont (Medycyna #5) | Sprzęt | Narzędzia do nauki o nauce | 11251-35 |
| Nożyczki | sprężynowe w stylu VannasSprzęt | Fine Science Tools | 15000-03 |
| Weterynaryjna komora rekonwalescencyjna | Wyposażenie | Usługi Peco | V1200 |
| Pompa strzykawkowa Genie plus | Sprzęt | Kent Scientific Corporation | |
| Macierz mózgu szczura | Sprzęt | Kent Scientific Corporation | RBMA-310C |
| Suwmiarka cyfrowa | Sprzęt | Świat Instrumenty precyzyjne | 501601 |
| Mikroskop preparacyjny | Sprzęt Świat Instrumenty precyzyjne | PZMTIII-BS-LWD | |
| Strzykawka Hamilton | Sprzęt | Hamilton | model 710 |
| Jednostka sterująca kocem homeotermicznym | Sprzęt Aparat | ||
| Maszynka do strzyżenia elektrycznego | Sprzęt | Braintree Scientific | CLP-9931 |
| Weterynaryjny unit elektrochirurgiczny | Sprzęt | Firma produkcyjna MACAN | MV-9 |
| Sprzęt do przepływomierza krwi | Adinstruments | ||
| PowerLab 4/30 | Sprzęt | Adinstruments | |
| Oprogramowanie LabChart 7.2 | Adinstruments | ||
| Strzykawka 1 ml | Materiały eksploatacyjne | Becton, Dickinson and Company | 309659 |
| Igła 23 G | Materiał eksploatacyjny | Becton, Dickinson and Company | 305143 |
| Igła 30 G | Materiały eksploatacyjne | Becton, Dickinson and Company | 305106 |
| rurki PE-50 | Materiały eksploatacyjne | Becton, Dickinson and Company | 427517 |
| Rurki PE-10 | Materiały eksploatacyjne | Becton, Dickinson and Company | 427400 |
| 6-0 Materiał | eksploatacyjny | Aparat Harvard | 723287 |
| 5-0 Jedwabny szew | Materiał eksploatacyjny | Aparat Harvard | 517607 |
Bibliografia
- Overgaard, K., Sereghy, T., Boysen, G., Pedersen, H., Høyer, S., Diemer, N. H. A rat model of reproducible cerebral infarction using thrombotic blood clot emboli. J Cereb Blood Flow Metab. 12 (3), 484-490 (1992).
- Zhang, R. L., Chopp, M., Zhang, Z. G., Jiang, Q., Ewing, J. R. A rat model of focal embolic cerebral ischemia. Brain Res. 766 (1-2), 83-92 (1997).
- Dinapoli, V. A., Rosen, C. L., Nagamine, T., Crocco, T. Selective MCA occlusion: a precise embolic stroke model. J. Neurosci. Methods. 154 (1-2), 233-238 (2006).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. J Vis Exp. 59 (3496), (2012).
- Bederson, J. B., Pitts, L. H., Tsuji, M., Nishimura, M. C., Davis, R. L., Bartkowski, H. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke. 17 (3), 472-476 (1986).
- Henninger, N., Bouley, J., Bråtane, B. T., Bastan, B., Shea, M., Fisher, M. Laser Doppler flowmetry predicts occlusion but not tPA-mediated reperfusion success after rat embolic stroke. Exp Neurol. 215 (2), 290-297 (2009).
- Zhu, H., et al. Annexin A2 combined with low-dose tPA improves thrombolytic therapy in a rat model of focal embolic stroke. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (6), 1137-1146 (2010).
- Cheng, T., et al. Activated protein C inhibits tissue plasminogen activator-induced brain hemorrhage. Nat Med. 2 (11), 1278-1285 (2006).
- Taniguchi, H., Andreasson, K. The hypoxic-ischemic encephalopathy model of perinatal ischemia. J Vis Exp. 21 (955), (2008).
- Sicard, K. M., Fisher, M. Animal models of focal brain ischemia. Exp Transl Stroke Med. 1 (7), (2009).
- Florian, B., et al. Long-term hypothermia reduces infarct volume in aged rats after focal ischemia. Neurosci Lett. 438 (2), 180-185 (2008).
- Noor, R., Wang, C. X., Shuaib, A. Effects of hyperthermia on infarct volume in focal embolic model of cerebral ischemia in rats. Neurosci Lett. 349 (2), 130-132 (2003).
- Westendorp, W. F., Nederkoorn, P. J., Vermeij, J. D., Dijkgraaf, M. G., van de Beek, D. Post-stroke infection: a systematic review and meta-analysis. BMC Neurol. 11 (110), (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Sprostowanie
Formal Correction: Erratum: Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats
Posted by JoVE Editors on 11/01/2014. Citeable Link.
A correction was made to Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats. The institution information was updated.
The institution "Louisiana State University Health Science Center" was changed to "Louisiana State University Health Science Center, Shreveport".
