Wysoce wydajna transfekcja ludzkich makrofagów THP-1 metodą nukleofekcji

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia efektywną i niezawodną metodę transfekcji ludzkich makrofagów THP-1 za pomocą siRNA lub plazmidowego DNA za pomocą elektroporacji z wysoką wydajnością transfekcji, przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej żywotności komórek i pełnej zdolności makrofagów do różnicowania i polaryzacji.

Streszczenie

Makrofagi, jako kluczowi gracze wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, są przedmiotem badań dotyczących homeostazy tkanek lub różnych patologii. Transfekcja za pomocą siRNA i plazmidowego DNA jest skutecznym narzędziem do badania ich funkcji, ale transfekcja makrofagów nie jest sprawą trywialną. Chociaż dostępnych jest wiele różnych podejść do transfekcji komórek eukariotycznych, tylko kilka z nich pozwala na niezawodną i wydajną transfekcję makrofagów, ale często obserwuje się zmniejszoną żywotność komórek i poważnie zmienione zachowanie komórek, takie jak zmniejszona zdolność do różnicowania lub polaryzacji. Dlatego wymagany jest protokół transfekcji, który jest w stanie przenieść siRNA i plazmidowe DNA do makrofagów bez powodowania poważnych skutków ubocznych, umożliwiając w ten sposób badanie działania siRNA lub plazmidu w kontekście normalnego zachowania komórki. Przedstawiony tutaj protokół zapewnia metodę niezawodnej i wydajnej transfekcji ludzkich makrofagów i monocytów THP-1 o wysokiej żywotności komórek, wysokiej wydajności transfekcji i minimalnym wpływie na zachowanie komórek. Podejście to opiera się na Nucleofekcji, a protokół został zoptymalizowany w celu utrzymania maksymalnej zdolności do aktywacji komórek po transfekcji. Protokół jest odpowiedni dla komórek przylegających po oderwaniu, a także komórek w zawiesinie i może być stosowany w przypadku małych i średnich próbek. W związku z tym przedstawiona metoda jest przydatna do badania efektów regulacji genów podczas różnicowania i polaryzacji makrofagów. Oprócz przedstawienia wyników charakteryzujących makrofagi transfekowane zgodnie z tym protokołem w porównaniu z alternatywną metodą chemiczną, omówiono również wpływ selekcji pożywki do hodowli komórkowych po transfekcji na zachowanie komórek. Przedstawione dane wskazują na znaczenie walidacji wyboru dla różnych ustawień eksperymentalnych.

Wprowadzenie

Wśród składników komórkowych ludzkiego układu odpornościowego, makrofagi mają ogromne znaczenie dla wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. Ich zadania są różnorodne; Biorą udział w fagocytozie patogenów i materiału martwiczego, odgrywają ważną rolę w homeostazie tkanek oraz wytwarzają i wydzielają dużą liczbę cytokin regulujących i koordynujących odpowiedź immunologiczną¹. Dlatego makrofagi są integralnie zaangażowane w wiele procesów fizjologicznych i stanów patofizjologicznych. Ze względu na różnorodność ich zadań makrofagi są bardzo niejednorodnym i wieloaspektowym typem komórek. Osiąga się to dzięki różnym polaryzacjom; W zależności od bodźców zewnętrznych makrofagi mogą rozwijać się w różne fenotypy². Zmienność makrofagów i ich wpływ na odpowiedź immunologiczną sprawiają, że są one bardzo interesującym obiektem badań. Aby wyjaśnić ich złożone funkcje metaboliczne i regulacyjne, potrzebne są odpowiednie modele makrofagów in vitro, które prawidłowo odzwierciedlają niejednorodność i zmienność makrofagów.

Transfekcja komórek z plazmidowymi wektorami DNA lub małymi interferującymi RNA (siRNA) w celu zmiany ekspresji genów komórkowych stała się szeroko stosowanym i potężnym narzędziem w biologii komórki do badania zarówno regulacji genów, jak i funkcji genów. Obecnie dostępny jest duży wybór różnych narzędzi do transfekcji komórek eukariotycznych. Narzędzia te obejmują zastosowanie wektorów wirusowych, metody mechaniczne (takie jak pistolety genowe), podejścia chemiczne (które opierają się na polimerach lub lipidach, które mogą tworzyć kompleksy z kwasami nukleinowymi) oraz elektroporację komórek³. Wszystkie te podejścia mają swoje zalety i wady, a wybór najlepiej dopasowanego z tej szerokiej gamy do określonego typu ogniwa i zastosowania może być trudnym i czasochłonnym procesem.

Makrofagi są niezwykle trudne do transfekcji, ponieważ prawie wszystkie sprawdzone metody transfekcji drastycznie zmniejszają żywotność makrofagów lub zakłócają ich zachowanie, tj. różnicowanie, a w szczególności polaryzację. Dlatego przedstawiamy tutaj skuteczny, niewirusowy protokół transfekcji ludzkich makrofagów THP-1 przy użyciu technologii Nucleofector opartej na elektroporacji, która reprezentuje zoptymalizowane podejście do elektroporacji wymagające zmniejszonej ilości DNA. Nukleofekcja doskonale nadaje się do wrażliwych komórek, takich jak monocyty i makrofagi. Protokół ten jest adaptacją wcześniej opublikowanych wersji^4,5.

W skrócie, 12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA) jest używany do różnicowania ludzkich monocytów THP-1 przez 48 godzin na przedwczesne makrofagi przed transfekcją siRNA lub plazmidowym DNA. W celu transfekcji wstępnie zróżnicowane makrofagi są odłączane enzymatycznie przez obróbkę Accutase I. Transfekcja odbywa się za pomocą urządzenia Nucleofector 2b do elektroporacji komórek. Po transfekcji różnicowanie jest kontynuowane przez kolejne 24 do 48 godzin, w zależności od potrzeb. Na koniec dojrzałe transfekowane makrofagi są inkubowane z różnymi rodzajami związków do badań funkcjonalnych.

To podejście pozwala na transfekcję linii komórkowych, takich jak ludzkie monocyty THP-1 i makrofagi, i było z powodzeniem stosowane w ciągu ostatnich^6-10 lat. W przeciwieństwie do większości podejść do transfekcji chemicznej, nasza zmodyfikowana procedura Nucleofekcji z wykorzystaniem przedwczesnych makrofagów zapewnia wysoką wydajność transfekcji w połączeniu z niezaburzoną żywotnością komórek, bez konieczności stosowania wektorów wirusowych lub dodawania dalszych związków nośnikowych o nieznanych skutkach ubocznych. Ponadto makrofagi zachowują swój pełny potencjał różnicowania, a także polaryzacji, umożliwiając w ten sposób niezakłócone badania funkcjonalne po transfekcji¹¹.

Ponadto, pożywka do hodowli komórkowej zastosowana po Nucleofekcji silnie wpływa na badania funkcjonalne po transfekcji; w szczególności, zdolność makrofagów do polaryzacji może być zmieniona w zależności od zastosowanej pożywki. Tutaj przetestowano cztery różne typy pożywek do hodowli komórkowych (IMDM, X-VIVO 20, LGM3 i pożywkę dla mysich komórek T Nucleofector Nucleofector Cube) w warunkach dezaktywacji przy użyciu interleukiny (IL) 10. Używając makrofagów THP-1, zaobserwowaliśmy, że reakcja komórek na IL10 jest najsilniejsza, gdy stosuje się pożywkę Nucleofector z mysich komórek T w porównaniu z innymi pożywkami hodowlanymi wymienionymi powyżej. Wyniki te pokazują, że odpowiednia optymalizacja wszystkich warunków hodowli komórkowej jest niezbędna do udanej transfekcji i późniejszych badań funkcjonalnych, ponieważ mogą one znacznie poprawić wyniki eksperymentalne.

Ponieważ makrofagi są zaangażowane w różne choroby ludzkie, wiele badań koncentruje się na wyjaśnieniu zachowania makrofagów, jak również mechanizmów regulacyjnych wpływających na makrofagi lub z kolei kontrolowanych przez makrofagi. Dlatego protokół ten ma znaczenie w wielu różnych obszarach badawczych.

Protokół

1. Predyferencjacja makrofagów THP-1

1. Hodować komórki THP-1 w pożywce RPMI-1640 uzupełnionej 10% (v/v) płodowej surowicy cielęcej (FCS) i 1% (v/v) penicyliny/streptomycyny/L-glutaminy (PSG) w inkubatorze CO₂ (5%) w temperaturze 37 °C.
2. Przed transfekcją podziel komórki i przenieś je na świeżą pożywkę RPMI, tak jak poprzednio. Hoduj komórki przez 24 godziny.
3. Wysiewać 1,0-1,5 x 10⁷ komórek do kolby do hodowli tkankowych o powierzchni 75 cm² lub 2,5 x 10⁷ komórek do kolby do hodowli tkankowych o powierzchni 150 cm² w pożywce RPMI-1640 i dodać 10% (v/v) FCS, 1% (v/v) PSG, 1% (v/v) pirogronianu sodu, 1% (v/v) aminokwasów endogennych, 10 ng/ml PMA, i 50 μM β-merkaptoetanolu przez 48 godzin.

2. Przygotowanie Nucleofekcji

1. Umieścić Accutase I i wszystkie podłoża w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
2. Odessać pożywkę hodowlaną z kolby i zastąpić 6 ml (kolba 75 cm²) lub 12 ml (kolba 150 cm²) Accutase I i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C do całkowitego oderwania komórek. Należy obserwować morfologię komórek po leczeniu Accutazą I, aby upewnić się, że komórki mają okrągły wygląd. Jeśli niektóre komórki nadal wydają się być przyczepione, ostrożnie przepłukać kolbę mikropipetą lub delikatnie postukać, aby całkowicie oderwać się. Nie używaj skrobaków do komórek, ponieważ będzie to miało negatywny wpływ na witalność komórek. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 15 ml.
3. Podczas leczenia Accutase I należy przygotować następujące podłoża:
   1. Przygotować pożywkę do transfekcji: uzupełnić pożywkę do hodowli komórkowych 1% (v/v) PSG, 1% (v/v) aminokwasów endogennych, 1% (v/v) pirogronianu sodu i 5% (v/v) surowicy ludzkiej (dla siRNA) lub 20% (v/v) surowicy ludzkiej (dla plazmidowego DNA); przygotować końcową objętość 3 ml/próbkę dla jednej płytki 6-dołkowej lub 4 ml/próbkę dla dwóch płytek 12-dołkowych.
   2. Przygotować pożywkę hodowlaną: uzupełnić pożywkę hodowlaną 1% (v/v) PSG, 1% (v/v) aminokwasów endogennych, 1% (v/v) pirogronianu sodu i 5% (v/v) surowicy ludzkiej (dla siRNA) lub 20% (v/v) surowicy ludzkiej (dla plazmidu), 2,5 ng/ml PMA i 50 μM β-merkaptoetanolu; przygotować końcową objętość 3 ml/próbkę dla jednej płytki 6-dołkowej lub 4 ml/próbkę dla dwóch płytek 12-dołkowych.
4. Zawiesinę komórek wirować przez 5 minut przy 300 x g w temperaturze pokojowej.
5. Odessać Accutazę I i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki RPMI podgrzanej do temperatury 37 °C; policzyć komórki, aby określić liczbę komórek.
   UWAGA: W przypadku stosowania szybkich procedur automatycznego zliczania komórek, kroki 2.4 i 2.5 mogą zostać pominięte, a komórki mogą być zliczane natychmiast po odłączeniu, pod warunkiem że unika się długotrwałego narażenia na Accutase I.
6. Dla każdej próbki transfekcyjnej należy przygotować porcje w probówkach wirówkowych zawierających 2,0-2,5 x 10⁶ komórek.

3. Nucleofekcja makrofagów THP-1

1. Odwirować wszystkie podwielokrotności przez 10 minut przy 250 x g w temperaturze pokojowej.
2. Rozcieńczyć plazmidowy DNA lub siRNA w wodzie wolnej od nukleaz lub odpowiednim buforze. Utrzymuj wymaganą objętość plazmidowego DNA lub siRNA tak małą, jak to możliwe.
3. Przygotuj jedną kuwetę Nucleofector z 1 μg siRNA lub 0,5 μg plazmidowego DNA dla każdej transfekcji.
4. Wykonuj jedną transfekcję na raz. Odessać supernatant z podwielokrotności komórki.
5. Zawiesić granulowane komórki w roztworze nukleofektora, aby uzyskać całkowitą objętość 100 μl roztworu DNA/siRNA i nukleofektora. Ograniczyć czas ekspozycji na czysty roztwór Nucleofector do minimum i zapewnić, że czas ekspozycji nie przekracza 15 minut.
6. Wymieszaj zawieszone komórki i DNA/siRNA w kuwecie Nucleofector przez delikatne stukanie.
7. Transfekcja komórek poprzez wykonanie programu Y-001 w urządzeniu Nucleofector 2b.
8. Przenieść transfekowane komórki do fiolki reakcyjnej za pomocą jednorazowych plastikowych pipet Pasteura.
9. Natychmiast dodać 500 μl przygotowanego podłoża do transfekcji.
10. Powtórzyć kroki 3.4-3.9 dla każdej próbki transfekcyjnej.

4. Opieka po nukleofekcji

1. Przygotować płytki 6-dołkowe lub 12-dołkowe dla transfekowanych komórek. Pobrać pipetą 2,5 ml pożywki do transfekcji do każdego dołka na płytce 6-dołkowej (1 dołek/transfekcja) lub 1,75 ml pożywki do transfekcji do każdego dołka na płytce 12-dołkowej (2 dołki/transfekcja).
2. Zawiesiny komórek dokładnie wymieszać za pomocą mikropipety.
3. Przenieść transfekowane komórki do przygotowanych dołków (albo jeden dołek w płytce 6-dołkowej, albo dwie w 12-dołkowej płytce).
4. Inkubować płytki przez 4 godziny w nawilżanym inkubatorze (5% CO₂, 37 °C).
5. Sprawdź ponowne przyczepienie komórek pod mikroskopem.
   UWAGA: Większość komórek powinna ponownie przylegać. Czasami wydłużenie okresu inkubacji o 1 godzinę zwiększa liczbę przylegających komórek w przypadku niewystarczającego ponownego przyłączenia.
6. Ostrożnie odessać pożywkę do transfekcji za pomocą mikropipety i zastąpić równą ilością podłoża uprawowego. Zasysaj tylko jedną studzienkę na raz.
7. Inkubuj komórki przez wymagany okres czasu, aby uzyskać maksymalny efekt plazmidu lub siRNA (24-72 godziny). Jeśli okres inkubacji przekracza 48 godzin, należy wymienić pożywkę po 48 godzinach.
8. Do dodatkowego leczenia efektorami (np. cytokinami, agonistami, antagonistami i inhibitorami) należy stosować pożywkę wolną od surowicy bez PMA i β-merkaptoetanolu. Zmierz koniec okresu inkubacji efektora z czasem maksymalnego działania plazmidu lub siRNA i odpowiednio zaplanuj zmianę pożywki i dodanie efektora. Nie należy utrzymywać komórek w warunkach wolnych od surowicy dłużej niż 24 godziny.

Wyniki

Stosując ten protokół transfekcji makrofagów THP-1 za pomocą siRNA, zazwyczaj osiągamy stopień transfekcji powyżej 90% bez istotnego obniżenia żywotności komórek. Rycina 1 przedstawia reprezentatywne dane charakteryzujące stan komórek 24 h po transfekcji siRNA znakowanym fluorescencyjnie w porównaniu z kontrolą nietransfekowaną, która nie była traktowana odczynnikami do nukleofekcji ani impulsem elektrycznym czy siRNA, lecz poddana była wszystkim zmianom mediów hodowlanych, tak jak próbki transfekowane. Na Rycini 1A przedstawiono morfologię komórkową na podstawie pomiaru cytometrycznego. Obrazy mikroskopowe pokazano na Rycini 1B. Ryciny 1C i 1D reprezentują niskie wskaźniki apoptozy (kontrola: 1,5%; nukleofekcja: 5,4%) oraz nekrozy (kontrola: 2,0%; nukleofekcja: 3,2%), co wskazuje na niezakłóconą żywotność komórek. Poziom nekrozy i apoptozy jest nieco wyższy w próbce transfekowanej, ponieważ transfekowane makrofagi THP-1 trudniej odczepić niż komórki nietransfekowane, co zwiększa prawdopodobieństwo uszkodzenia komórek podczas odczepiania. Na koniec wydajność transfekcji przedstawiono na Rycini 1E. Przesunięcie całej populacji transfekowanej względem kontroli wskazuje, że wszystkie komórki zostały poddane transfekcji, co potwierdzają obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej (Rycina 2B). Zarówno dane cytometryczne, jak i obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej wskazują, że wszystkie komórki są spójnie transfekowane, z homogeniczną dystrybucją siRNA pomiędzy komórkami, jak i wewnątrz nich. Jest to przeciwieństwo wielu chemicznych odczynników do transfekcji; dla porównania Ryciny 2A i 2B przedstawiają odpowiednio dane cytometryczne i obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej dla chemicznego środka transfekcyjnego opartego na lipidach. Ryciny te pokazują, że można wykryć dwie odrębne populacje transfekowanych komórek. Pierwsza populacja jest podobna do komórek po nukleofekcji; charakteryzuje się niską całkowitą fluorescencją i homogeniczną dystrybucją siRNA wewnątrz komórek. Druga populacja wyróżnia się bardziej intensywną fluorescencją, która pochodzi z bardzo jasnych wewnątrzkomórkowych aglomeratów siRNA. Morfologia komórkowa pozostaje niezmieniona dla obu metod transfekcji, co pokazano za pomocą kontrastu interferencyjnego na Rycini 2C. Transfekcje z użyciem plazmidowego DNA dają efektyywnie podobne wyniki; w celu zapoznania się z przykładami należy odwołać się do prac Robenek et al. (2009)⁹ lub Xie et al. (2006)⁷.

Wybór pożywki do hodowli komórek po transfekcji ma duże znaczenie; dlatego w ramach porównania przetestowano różne pożywki do hodowli komórkowych. Wybrane pożywki są odpowiednie do hodowli komórek THP-1 i zostały wybrane zgodnie z zaleceniami firmy Lonza jako pożywki właściwe do hodowli po nukleofekcji. Rysunek 3 przedstawia wydajność wyciszania genów za pomocą siRNA skierowanego przeciwko mRNA IL10RB (łańcuch β receptora interleukiny 10). Dla wszystkich testowanych pożywek ekspresja IL10RB została znacząco zredukowana do około 10 do 20% poziomu kontrolnego (Rysunek 3). Jednakże transfektowane komórki różnią się w zależności od pożywki hodowlanej pod względem potencjału do polaryzacji. Makrofagi THP-1 transfektowane niespecyficznym kontrolnym siRNA lub siRNA specyficznym dla IL10RB hodowano w różnych pożywkach po transfekcji i traktowano IL10. Następnie poziomy ekspresji indukowanego przez IL10 genu SOCS3 (supresor sygnalizacji cytokin 3) na poziomie mRNA zmierzono za pomocą RT-qPCR. Różnice między pożywkami hodowlanymi występują w zakresie stopnia indukcji ekspresji mRNA SOCS3 (Rysunek 4); indukcja dla każdej z testowanych pożywek — Mouse T Cell Nucleofector Medium, LGM3, X-VIVO 20 i IMDM — wyniosła odpowiednio 19,5 [17,7-21,5], 11,5 [8,5-15,7], 8,0 [4,6-14,2] oraz 7,2 [5,6-9,5] krotnie. W związku z tym zastosowanie pożywki Mouse T Cell Nucleofector Medium jest kluczowe. Dodatkowo zaobserwowano różnice w efekcie wyciszenia IL10RB na ekspresję SOCS3 po traktowaniu IL10; poziomy ekspresji mRNA SOCS3 zostały zredukowane 9,5 [8,8-10,3] krotnie w pożywce Mouse T Cell Nucleofector Medium, 2,1 [1,1-4,1] krotnie w LGM3, 4,8 [3,2-7,2] krotnie w X-VIVO 20 i 3,3 [2,7-3,9] krotnie w IMDM. Wartości te odpowiadają redukcjom ekspresji SOCS3 w poszczególnych pożywkach do odpowiednio 49%, 18%, 60% i 45%. Redukcja indukowanej przez IL-10 ekspresji SOCS3 po transfekcji siRNA IL10RB potwierdza skuteczne obniżenie poziomu IL10RB w wyniku transfekcji.

Rysunek 1. Charakterystyka transfekowanych makrofagów THP-1. Stan charakterystyczny komórek nie uległ zmianie, co wykazano w analizach mikroskopowych i cytometrycznych z użyciem komórek kontrolnych nietransfekowanych oraz makrofagów THP-1 transfekowanych zgodnie z przedstawionym protokołem. Makrofagi THP-1 zróżnicowano z użyciem 10 ng/ml PMA przez 48 hr i transfekowano nieswoistym kontrolnym siRNA znakowanym fluorescencyjnie (Alexa 488). 24 hr po transfekcji wykonano obrazy żywych komórek (B) lub oddzielono komórki za pomocą Accutase I i poddano analizie cytometrycznej (A). Barwienie na apoptozę i nekrozę przeprowadzono z użyciem Aneksyny V-fikerytryny (PE) (C) oraz 7-aminoaktynominy (7-AAD) (D). Wydajność transfekcji (E) określono za pomocą cytometrii przepływowej, wykorzystując znacznik fluorescencyjny przyczepiony do siRNA. Sygnał fluorescencji komórek transfekowanych (czarny) przedstawiono w zestawieniu z sygnałem kontrolnym (szary). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Porównanie wewnątrzkomórkowej dystrybucji siRNA po nukleofekcji w stosunku do lipofekcji.Komórki THP-1 poddano różnicowaniu przez 48 hr zgodnie z niniejszym protokołem, a następnie transfekowano za pomocą nukleofekcji lub lipofekcji. Przedstawione wyniki lipofekcji uzyskano z użyciem zestawu Xtremegene siRNA zgodnie z zaleceniami producenta, przy stosunku odczynnika do siRNA wynoszącym 4:1. 24 hr po transfekcji komórki oddzielono za pomocą Accutase I do analizy cytometrycznej lub oceniano mikroskopowo jako komórki żywe. (A) Efektywność transfekcji oraz dystrybucję siRNA na komórkę w obrębie populacji określono metodą cytometrii przepływowej, wykorzystując znakowanie fluorescencyjne siRNA; kontrolami transfekowanymi bez siRNA są próbki zaznaczone na szaro, a próbki transfekowane siRNA zaznaczono na czarno. (B) Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiające wewnątrzkomórkową dystrybucję znakowanego fluorescencyjnie siRNA (Alexa Fluor 488); pasek skali odpowiada 40 µm. (C) Obraz z mikroskopii kontrastowej DIC odpowiadający obrazowi fluorescencyjnemu; pasek skali odpowiada 40 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rycina 3. Wyciszenie ekspresji genu IL10RB za pomocą siRNA w transfekowanych makrofagach THP-1. Makrofagi THP-1 poddano transfekcji zgodnie z opisanym protokołem. Po transfekcji komórki hodowano w czterech różnych pożywkach, mianowicie w pożywce Mouse T Cell Nucleofector (A), IMDM (B), LGM3 (C), oraz X-VIVO 20 (D), uzupełnione zgodnie z opisem w sekcji Protokół. Komórki poddano transfekcji nieswoistym kontrolnym siRNA (Ctrl) lub siRNA specyficznym dla IL10RB (IL10RB). Jako dodatkowe kontrole włączono następujące próbki: kontrola impulsu, t. j.komórki poddane transfekcji bez dodatku siRNA (Pulse) oraz kontrolę medium, t. j.komórki, które poddano jedynie wymianie pożywki hodowlanej, a poza tym pozostały nieleczone. 24 h po transfekcji komórki inkubowano w pożywce bezsurowiczej z dodatkiem lub bez dodatku 50 ng/ml IL10 przez kolejne 24 h. Ekspresję IL10RB zmierzono metodą RT-qPCR; na wykresach przedstawiono średnią z trzech niezależnych eksperymentów, słupki błędów oznaczają błąd standardowy średniej; * p <0.05; ** p <0.01; *** p <0,001 vs. Ctrl. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, należy kliknąć tutaj.

Rysunek 4. Regulacja SOCS3 zależna od IL10 po wyciszeniu genu IL10RB w transfektowanych makrofagach THP-1. Makrofagi THP-1 poddano transfekcji zgodnie z opisanym protokołem. Po transfekcji komórki hodowano w czterech różnych mediach hodowlanych: Mouse T Cell Nucleofector medium (A), IMDM (B), LGM3 (C) oraz X-VIVO 20 (D) uzupełnione zgodnie z opisem w sekcji Protokół. Komórki poddano transfekcji nieswoistym kontrolnym siRNA (Ctrl) lub siRNA specyficznym dla IL10RB (IL10RB). Jako dodatkowe kontrole włączono następujące próbki: kontrolę impulsu, t. j. komórki poddane transfekcji w obecności siNRA (Pulse) oraz kontrolę ośrodka, t.j.komórki, które poddano jedynie wymianie pożywki hodowlanej, lecz w pozostałym zakresie nie były poddane żadnej obróbce. 24 godziny po transfekcji komórki inkubowano w pożywce bezsurowiczej z dodatkiem lub bez dodatku 50 ng/ml IL10 przez kolejne 24 godziny. Ekspresję SOCS3 mierzono za pomocą metody RT-qPCR; na wykresach przedstawiono średnią z trzech niezależnych eksperymentów, słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej; *, # p <0.05; **, ## p <0.01; ***, ### p <0,001 vs. Ctrl oraz vs. Ctrl + IL-10, odpowiednio. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół przedstawia niezawodny i skuteczny sposób transfekcji makrofagów THP-1, które zwykle są dość trudne do transfekcji. Transfekcję można osiągnąć przy skuteczności transfekcji powyżej 90% dla siRNA bez znacznego zmniejszenia żywotności komórek. Wydajność plazmidów może być mniejsza ze względu na ich rozmiar, ale zwykle można osiągnąć wydajność transfekcji około 70%. Skuteczność knockdownu za pośrednictwem siRNA może sięgać od 80 do 90% w zależności od zastosowanego siRNA. Główną zaletą tego protokołu jest to, że nie zakłóca różnicowania komórek. Po transfekcji komórki nadal normalnie reagują na czynnik różnicujący PMA (ryc. 1A do 1B i ryc. 4)¹². Ponadto polaryzacja komórkowa przez bodźce cytokinowe, takie jak IL10 lub LPS/IFNγ, pozostaje^{niezakłócona 12}, chociaż zależy to również w dużym stopniu od pożywki wybranej do hodowli po transfekcji, jak pokazano na rysunku 4.

W ramach procedury istnieje kilka opcji, które mogą być modyfikowane w celu dostosowania protokołu do konkretnych wymagań. Jak pokazano na rysunku 4 , komórki reagują różnie na ten sam bodziec IL10 w zależności od pożywki wybranej po transfekcji. Wskazuje to, że skład pożywki ma silny wpływ na zachowanie komórek. Ponieważ efekt narzucony przez pożywkę może być różny dla różnych bodźców eksperymentalnych, możliwe jest, że optymalna pożywka może ulec zmianie i dlatego istnieje potrzeba niezależnego sprawdzenia przydatności pożywki do różnych eksperymentów. Jednak pożywka RPMI-1640, która jest domyślną pożywką używaną do hodowli komórek THP-1, okazała się nieodpowiednia do hodowli po transfekcji, ponieważ zaobserwowano znaczną utratę żywotności komórek. Co więcej, protokół może być również stosowany do monocytów THP-1 bez wcześniejszego różnicowania wywołanego przez PMA, co oczywiście eliminuje potrzebę odłączania komórek podczas zabiegu, ale wszystkie pozostałe etapy nie muszą być dostosowywane. W razie potrzeby monocyty THP-1 można później różnicować.

Najbardziej krytycznymi elementami protokołu są, po pierwsze, oderwanie, a po drugie, czas potrzebny na transfekcję. Odklejanie należy wykonać tak delikatnie, jak to możliwe, aby utrzymać wysoką żywotność komórek. Dlatego zalecamy stosunkowo łagodne enzymatyczne oderwanie za pomocą Accutase I zamiast dość agresywnych metod, takich jak trypsynizacja. Dalsze metody odklejania, takie jak leczenie lidokainą lub skrobanie, okazały się raczej szkodliwe i nie powinny być stosowane. W przypadku, gdy 30 minut leczenia Accutase I nie powinno wystarczyć do prawidłowego odłączenia wszystkich komórek, jest to zwykle oznaką nieprawidłowo przechowywanego lub przeterminowanego roztworu Accutase I lub zbyt wielu cykli zamrażania i rozmrażania. Uzyskaliśmy dobre wyniki, przechowując małe porcje Accutase I w temperaturze -20 °C w celu zmniejszenia liczby cykli zamrażania i rozmrażania. Jednakże, gdy odklejenie jest niewystarczające, należy zastąpić Accutazę I świeżą Accutazą lub wydłużyć czas inkubacji do 1 godziny. Ponadto delikatne stukanie lub płukanie kolby lub płytki może pomóc w oderwaniu. Jeśli chodzi o wymagany czas transfekcji, czas ekspozycji komórek na czysty roztwór nukleofektora ma duży wpływ na przeżycie komórek i dlatego powinien być jak najkrótszy. Najlepszym sposobem na osiągnięcie tego celu jest wykonywanie każdej transfekcji na raz (kroki od 2.10 do 2.15), a nie wykonywanie wielu transfekcji równolegle.

Jeśli skuteczność knockdown jest niska, zwykle nie jest to spowodowane niską wydajnością transfekcji, ale można to łatwo zweryfikować za pomocą cytometrii przepływowej lub mikroskopii fluorescencyjnej i fluorescencyjnie znakowanego siRNA lub plazmidu kodującego GFP. Najczęściej przyczyną jest nieefektywne siRNA lub plazmidowe DNA. W tych okolicznościach należy rozważyć zwiększenie ilości siRNA (do 2-3 μg) lub plazmidowego DNA (do 1-2 μg) lub użycie innego siRNA lub wektora ekspresyjnego, jeśli jest dostępny. Alternatywnie, zadowalające wyniki można również osiągnąć, stosując pulę kilku różnych siRNA skierowanych przeciwko temu samemu celowi. Ponadto mogą być wymagane eksperymenty w czasie, aby dokładnie określić okres maksymalnego efektu, który zwykle osiąga się po 24 do 72 godzinach od transfekcji.

Oprócz transfekcji za pomocą elektroporacji istnieją inne dobrze znane techniki transfekcji komórek ssaków. Często stosowanymi systemami są chemiczne środki transfekcyjne, które mogą tworzyć kompleksy z kwasem nukleinowym ładunku, a następnie ułatwiać transport do komórek. Najczęściej stosowane odczynniki są oparte na różnych gatunkach lipidów lub mogą być wybierane spośród wielu polimerów kationowych³. Dla obu podejść na rynku dostępny jest różnorodny wybór. Te odczynniki do transfekcji mają tę zaletę, że są zwykle łatwe w użyciu, nie wymagają dużo czasu i działają również z przylegającymi komórkami, eliminując w ten sposób konieczność odłączania. Niestety, makrofagi są raczej trudne do transfekcji tymi metodami, ponieważ nie namnażają się znacząco in vitro i posiadają mechanizmy obronne skierowane przeciwko obcemu cytozolowemu DNA^13-15. W związku z tym metody transfekcji chemicznej często prowadzą do poważnego zmniejszenia żywotności komórek. Jednak, jak pokazano na rysunku 2 , istnieją chemiczne środki transfekcyjne, które mogą z powodzeniem przenosić siRNA do makrofagów, ale jak wskazują analizy cytometryczne przepływowe (Figura 2A) i mikroskopy fluorescencyjne (Rysunek 2B), nie są one w stanie osiągnąć takiej samej jednorodnej dystrybucji siRNA w komórkach, jak uzyskano za pomocą nukleofekcji. W rzeczywistości dane z cytometrii przepływowej wskazują, że występują dwie różne populacje transfekowanych komórek, po pierwsze populacja o podobnej fluorescencji jak komórki po wykryciu nukleofekcji, a po drugie istnieje populacja o bardziej intensywnej fluorescencji. Ostateczne potwierdzenie jest nadal wymagane, ale przypuszczamy, że pierwsza populacja jest w mikroskopii fluorescencyjnej identyczna z tymi komórkami, które wykazują jednorodny rozkład fluorescencyjnego siRNA w cytozolu, podczas gdy druga populacja prawdopodobnie odpowiada komórkom z bardzo jasnymi aglomeratami. Dane cytometryczne przepływowe pokazane na rysunku 2A sugerują, że nukleofekcja powoduje mniej siRNA na komórkę niż alternatywne podejście lipofekcji. Jednak dane na rycinie 3 pokazują, że nawet stosunkowo niewielka ilość siRNA włączonego przez Nucleofection jest już wystarczająca do 80 do 90% knockdownu docelowego genu. W związku z tym dodatkowa ilość siRNA włączona do drugiej populacji po transfekcji chemicznej jest najprawdopodobniej nadwyżką, a zatem bardziej prawdopodobne jest, że spowoduje niepożądane skutki uboczne niż jeszcze bardziej zwiększy skuteczność knockdownu. Poza tym tworzenie się aglomeratów wewnątrzkomórkowych jest już samo w sobie niepożądane, ponieważ te cząsteczki siRNA prawdopodobnie nie działają lub przynajmniej są mniej wydajne niż wolne cząsteczki siRNA i mogą powodować efekty niepożądane. Co więcej, prawdziwa natura tych aglomeratów nie jest jeszcze jasna. Możliwe, że te jasne plamy reprezentują endosomy wskazujące, że siRNA zostało zinternalizowane przez komórki, ale następnie uwolnienie z endosomów nie powiodło się, a siRNA pozostaje uwięzione, a zatem nieskuteczne. Alternatywnie plamki mogą być aglomeratami, które powstają wewnątrzkomórkowo. Oceny funkcjonalne transfekcji chemicznej są w toku, dlatego nie można jeszcze wydać ostatecznych stwierdzeń na temat skuteczności knockdownu, nadal istnienie dwóch odrębnych populacji jest już niekorzystne, ponieważ oznacza to, że wszystkie wyniki opisują średnią obu populacji, a zatem nie odpowiada żadnej z populacji. Z tego powodu Nucleofekcja jest lepszym podejściem.

Niemniej jednak istnieją również ograniczenia dotyczące opisanej tutaj procedury transfekcji. Ponieważ komórki muszą być w zawieszeniu dla Nucleofekcji, przylegające komórki muszą zostać odłączone, co stanowi dodatkowy czynnik stresujący dla komórek. Co więcej, cały protokół jest dość czasochłonny. Ponieważ transfekcje nie mogą być wykonywane jednocześnie, ale muszą być wykonywane szybko, aby uniknąć uszkodzenia komórek, liczba próbek jest ograniczona do około 8 - 10 na eksperyment. W związku z tym protokół ten nie nadaje się do projektów przesiewowych o wysokiej przepustowości. Do zastosowań o wysokiej przepustowości dostępne są różne systemy Nucleofector. Po pierwsze, istnieje system 4D-Nucleofector, który oferuje 16-dołkowy format paska. Aby uzyskać jeszcze większą przepustowość, dostępny jest 96-dołkowy system Shuttle i 384-dołkowy system HT Nucleofector . Ponieważ jednak te nowsze systemy działają z przewodzącymi elektrodami polimerowymi zamiast aluminium, a zatem warunki elektryczne, tj. programy i skład roztworu Nucleofectora, uległy odpowiednim zmianom, należy ustalić, czy nasz protokół można przenieść do tych systemów.

Jednak pomimo tych ograniczeń przedstawiony tutaj protokół zapewnia niezawodną i skuteczną transfekcję komórek THP-1, która jest lepsza niż wszystkie inne podejścia niewirusowe. Protokół ten umożliwia badanie skutków zmienionej ekspresji genów w komórkach THP-1, które we wszystkich innych aspektach różnicują się i polaryzują normalnie, a tym samym wykazują jak najmniej skutków ubocznych transfekcji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Accutase I	Sigma-Aldrich	A6964
Aminokwasy, nieistotne	PAA	M11-003
Probówki wirówkowe (15 ml)	TPP	TPP91015
Surowica cielęca płodu (złoto FCS)	PAA	A15-151
Zestaw nukleofektorów ludzkich monocytów	Lonza	VPA-1007	Zawiera roztwór nukleofektora, kuwety i Pasteura pipety
Surowica ludzka ze skrzepu	Lonza	C11-020
Zmodyfikowana pożywka Dulbecco firmy Isove (IMDM) z 25 mM HEPES i 25 mM L-glutaminą	Lonza	12-722F
3 (LGM3)	Lonza	CC-3211
Mysi nukleofektor komórkowy	Lonza	VZB-1001
Nucleofector 2b	Lonza	AAD-1001
Penicylina / streptomycyna / L-glutamina (100x)	Sigma-Aldrich	G1146
12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA)	Fisher Scientific	BP685
Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI 1640)	PAA	E15-840
siRNA / plazmid Pirogronian
sodu (100 mM)	Sigma-Aldrich	S8636
THP-1 monocyty ludzkiej białaczki	CLS	300356
Kolby do hodowli tkankowych (75 cm²; 150 cm²)	TPP	TPP90076/TPP90151
Płytki do hodowli tkankowych (6-dołkowe; 12-dołkowe)	Probówki TPP	TPP92406/TPP92012
(1,5 ml)	StarLab	S 1615-5500
Woda (bez nukleaz) lub odpowiedni bufor siRNA/plazmidowy
X-Vivo 20 z gentamycyną	Lonza	BE04-448Q
β-merkaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148