Artykuł metodologiczny

Analiza migracji komórek w obrębie trójwymiarowej matrycy kolagenowej

DOI:

10.3791/51963

⸱

5 października 2014

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Immunology & Experimental Oncology, Center for Biomedical Education and Research (ZBAF), Witten/Herdecke University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Migracja komórek to zjawisko biologiczne, które bierze udział w wielu procesach fizjologicznych, takich jak gojenie się ran i reakcje immunologiczne oraz procesy patofizjologiczne, takie jak rak. Test migracji macierzy kolagenu 3D jest wszechstronnym narzędziem do analizy właściwości migracyjnych różnych typów komórek w środowisku fizjologicznym 3D.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność do migracji jest cechą charakterystyczną różnych typów komórek i odgrywa kluczową rolę w wielu procesach fizjologicznych, w tym w rozwoju embrionalnym, gojeniu się ran i reakcjach immunologicznych. Jednak migracja komórek jest również kluczowym mechanizmem w raku, umożliwiającym tym komórkom rakowym odłączenie się od guza pierwotnego i rozpoczęcie rozprzestrzeniania się przerzutów. W ciągu ostatnich lat opracowano różne testy migracji komórek w celu analizy zachowań migracyjnych różnych typów komórek. Ponieważ zachowanie lokomotoryczne komórek znacznie różni się między środowiskiem dwuwymiarowym (2D) i trójwymiarowym (3D), można założyć, że analiza migracji komórek osadzonych w środowisku 3D dostarczy bardziej znaczących danych dotyczących migracji komórek. Zaletą opisanego testu migracji macierzy kolagenowej 3D jest to, że komórki są osadzone w fizjologicznej sieci 3D włókien kolagenowych reprezentujących główny składnik macierzy zewnątrzkomórkowej. Dzięki wideomikroskopii poklatkowej mierzona jest rzeczywista migracja komórek, co pozwala na określenie kilku parametrów migracji, a także ich zmian w odpowiedzi na czynniki promigracyjne lub inhibitory. Za pomocą tej techniki można analizować różne typy komórek, w tym limfocyty/leukocyty, komórki macierzyste i komórki nowotworowe. Podobnie, również klastry komórkowe lub sferoidy mogą być osadzone w macierzy kolagenowej wraz z analizą emigracji pojedynczych komórek z klastra komórkowego / sferoidy do sieci kolagenowej. Dochodzimy do wniosku, że test migracji macierzy kolagenowej 3D jest wszechstronną metodą analizy migracji komórek w fizjologicznym środowisku 3D.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podobnie jak fuzja komórek (zobacz przegląd patrz 1,2), migracja komórek jest kolejnym zjawiskiem biologicznym, które bierze udział w wielu procesach fizjologicznych, w tym w rozwoju embrionalnym, gojeniu się ran i reakcjach immunologicznych (dla przeglądu patrz 3). Jednak zdolność do migracji jest również warunkiem wstępnym dla komórek nowotworowych do przerzutów (przegląd patrz 3,4).

Migracja komórek to złożony, jeszcze nie w pełni zrozumiany proces, który jest kierowany przez wzajemne oddziaływanie kilku szlaków transdukcji sygnału inicjowanych przez różne ligandy (np. cytokiny, chemokiny, czynniki wzrostu, hormony, składniki macierzy zewnątrzkomórkowej) interakcje (np. receptorowe kinazy tyrozynowe, receptory chemokin, integryny)5 ostatecznie powodując reorganizację cytoszkieletu aktynowego wraz z de- i ponownym składaniem ogniskowych kompleksów adhezyjnych i sygnalizacją za pośrednictwem integryn6.

Aby przeanalizować migrację komórek, w ciągu ostatnich dziesięcioleci opracowano kilka testów migracji komórek in vitro i in vivo, w tym test komory Boydena/transwell7, test zadrapań/test gojenia ran8-10, trójwymiarowy (3D) test migracji macierzy kolagenowej11, jak również obrazowanie/mikroskopia przyżyciowe (dla przeglądu patrz 12). Każdy z tych testów migracji komórek ma swoje plusy i minusy, np. dotyczące kosztów i zapotrzebowania na sprzęt, obsługi czy wiarygodności uzyskanych danych.

Zarówno test komory Boydena/transwell, jak i test zadrapań/test gojenia się ran są łatwymi, tanimi i dobrze rozwiniętymi testami do pomiaru migracji komórek in vitro7-10. W komorze Boydena/teście transwella komórki są wysiewane na wierzchu wkładki zawierającej pory (o średnicy około 8 μm) - tak zwanej górnej komorze7. Opcjonalnie wkładka może być pokryta składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej, np. fibronektyną, kolagenem itp., Aby naśladować bardziej fizjologiczne środowisko. Podobnie, komórki śródbłonka mogą być hodowane na wierzchu wkładki, naśladując w ten sposób barierę komórkowąśródbłonka 13. Te komórki, które przeszły przez pory w określonym przedziale czasu do dolnego przedziału zawierającego pożywki i suplementy, takie jak czynniki wzrostu i chemokiny, są wykorzystywane jako odczyt do ilościowego określenia migracji komórek (lub wynaczynienia).

W teście zadrapań/gojenia ran komórki są umieszczane na płytkach i rosną do zbiegu10. W zależności od eksperymentalnego ustawienia, płytki mogą być wstępnie pokryte składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej, takimi jak fibronektyna. Po utworzeniu zadrapania/rany poprzez zeskrobanie jednowarstwowej komórki, pojedyncze komórki z każdej strony zadrapania/rany mogą migrować do szczeliny, wypełniając ją w ten sposób/lecząc10. Odległość między dwiema stronami zadrapania/ran jest określana w zależności od czasu i służy jako odczyt aktywności migracyjnej komórek10. Jednakże, aby rozróżnić między proliferacją komórek (która może również prowadzić do wypełnienia/zagojenia się zadrapania/rany) a migracją komórek, zaleca się połączenie testu z mikroskopią wideo poklatkową i śledzeniem pojedynczych komórek10.

Jednakże, zarówno test komory Boydena/transwell, jak i test zadrapań/test gojenia się ran, są raczej niedoskonałe pod względem fizjologicznego środowiska komórkowego. W teście komory Boydena/transwellu komórki muszą migrować przez plastikowy por, podczas gdy w teście zadrapania/gojeniu się ran komórki są wysiewane na dwuwymiarowej, wstępnie powlekanej płytce z tworzywa sztucznego. Podobnie, dobrze wiadomo, że zachowania migracyjne różnią się znacznie między środowiskiem dwuwymiarowym a trójwymiarowym3. Na przykład trójwymiarowe adhezje matrycowe fibroblastów różnią się od zrostów ogniskowych i fibrylarnych charakteryzowanych na dwuwymiarowych podłożach zawartością integryn α5β1 i αvβ3, paxilliny, innych składników cytoszkieletu oraz fosforylacją tyrozyny ogniskowej kinazy adhezyjnej14. Podobnie, komórki osadzone w środowisku 3D również wykazywały zmienione zachowanie migracyjne15. W związku z tym, aby dokładniej analizować migrację komórek, zaleca się test migracji, który pozwala zmierzyć migrację pojedynczych komórek w środowisku fizjologicznym 3D lub podobnym do fizjologicznego.

Obrazowanie/mikroskopia przyżyciowych to złoty standard pomiaru migracji komórek w kontekście fizjologicznym 3D. Dotyczy to nie tylko interakcji macierz zewnątrzkomórkowa-komórka, ale także interakcji między różnymi typami komórek, takimi jak komórki nowotworowe i komórki śródbłonka podczas wynaczynienia16 lub transport limfocytów w obrębie węzła chłonnego17, co do tej pory było możliwe dzięki ulepszonym technikom mikroskopii fluorescencyjnej, takim jak 2-fotonowa konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa, zastosowanie ważnych barwników fluorescencyjnych i transgenicznych szczepów myszy eksprymujących białka fluorescencyjne Instrumenty pochodne12,16,17. Dodatkowo, obrazowanie/mikroskopia przyżyciowe może być połączone z ręcznym i automatycznym śledzeniem komórek18. Jednak ze względu na potrzebę 2-fotonowej konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej, a także zwierząt (i odpowiednich transgenicznych modeli zwierzęcych), obrazowanie/mikroskopia przyżyciowa jest dość kosztowną techniką.

Aby przezwyciężyć ograniczenia testu komory Boydena/transwella i testu zadrapań/testu gojenia się ran oraz przeanalizować migrację różnych typów komórek w środowisku 3D, opracowano test migracji macierzy kolagenowej 3D11,19. W ten sposób migrujące komórki są osadzone w sieci włókien kolagenowych 3D, która bardziej przypomina sytuację in vivo. Jednocześnie, dzięki mikroskopii poklatkowej, mierzona jest rzeczywista migracja komórek, co pozwala na określenie kilku parametrów migracji, a także ich zmian w odpowiedzi na czynniki promigracyjne lub inhibitory. Za pomocą tej techniki można analizować różne typy komórek, w tym limfocyty i leukocyty11,20, hematopoetyczne komórki macierzyste/progenitorowe21-24 oraz komórki nowotworowe5,25-29. Oprócz pojedynczych komórek w macierzy kolagenowej mogą być osadzone również klastry komórkowe lub sferoidy, co wiąże się z analizą emigracji pojedynczych komórek z klastra komórkowego/sferoidy do sieci kolagenowej30,31.

Ten protokół przedstawia przegląd prostej, ale potężnej techniki analizy zachowań migracyjnych różnych typów komórek w środowisku 3D - metoda in vitro dająca wyniki zbliżone do sytuacji in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie komór migracyjnych

  1. Przygotuj mieszankę wosku parafinowego i wazeliny (1:1) i podgrzewaj, aż mieszanina się rozpuści. Za pomocą pędzla narysować 2-3 warstwy wosku parafinowego/wazeliny (1:1) wymieszać na środku szkiełka zgodnie z rysunkami 1B-1D.
    UWAGA: Używamy zwykłych szkiełek szkiełkowych (76 x 26 x 1,0-1,5 mm (szer./gł./wys.))
  2. Szybko nałóż stopioną mieszankę wosku parafinowego i wazeliny na szkiełko podstawowe, aby uniknąć zestalenia podczas ciągnięcia. Upewnij się, że warstwa wosku parafinowego/wazeliny ma około 2-2.5 cm długości i 0.3-0.5 cm szerokości. Grubość warstwy wosku parafinowego/wazeliny powinna wynosić około 0,1-0,15 cm.
  3. Dodaj szkiełko nakrywkowe do zestalonej mieszanki wosku parafinowego i wazeliny i uszczelnij ją dwiema do trzech warstw mieszanki wosku parafinowego i wazeliny (rysunki 1E,1F). Użyj 4-8 komór migracyjnych do wspólnego eksperymentu migracji komórek. Umieść komory migracyjne w pozycji pionowej w stojaku.

2. Przygotowanie mieszanki komórek zawiesiny kolagenu

  1. Zbierz (np. z 0,25% trypsyny/EDTA) i policz interesujące Cię komórki. Ponownie zawiesić komórki w kompletnych pożywkach zawierających płodową surowicę cielęcą (FCS), antybiotyki i zalecane suplementy. Przygotować 4-8 probówek reakcyjnych po 1,5 ml i zawiesinę komórek o objętości 20 μl zawierającą 4-6 x 104 komórek (całkowita liczba komórek zależy od typu komórek, które mają być analizowane) i wypełnić do 50 μl kompletnymi pożywkami.
    UWAGA: Do zawiesiny komórkowej dodaje się dodatkowe związki (np. czynniki wzrostu, chemokiny, inhibitory itp.). Stosować odpowiednie roztwory podstawowe, tak aby końcowa objętość zawiesiny komórek nie przekraczała 50 μl.
  2. Przygotuj całkowitą ilość 452 μl końcowej zawiesiny kolagenu do czterech eksperymentów migracji komórek. Dodać 50 μl 10x MEM (pH 5,1-5,5) i 27 μl 7,5% roztworu wodorowęglanu sodu (pH 9,0-9,5) do 1,5 ml probówki reakcyjnej i dokładnie wymieszać. Obserwuj, jak kolor roztworu zmienia się z żółto-pomarańczowego na intensywnie fioletowy (pH 9,0-9,5). Dodaj 375 μl płynnej zawiesiny kolagenu do 10x roztworu MEM/wodorowęglanu sodu i dokładnie wymieszaj. pH końcowej zawiesiny kolagenu powinno wynosić około 7,5 (wskazane jasnofioletowym kolorem).
    UWAGA: Sprawdź pH 7.5% roztworu wodorowęglanu sodu. Jeśli pH wynosi około 7,5, umieścić roztwór wodorowęglanu sodu z otwartą pokrywą w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ) w celu nasycenia CO2 i zwiększyć pH (około 9,0 - 9,5). pH mieszanki komórek zawiesiny kolagenu ma kluczowe znaczenie dla stabilności sieci kolagenowej. Jeśli jest zbyt niska, siatka kolagenowa zapadnie się podczas eksperymentu migracji komórek.
    UWAGA: W tym protokole użyj płynnego kolagenu (pH 1,9-2,2) z tylnego bydła (2,9-3,3 mg / ml kolagenu; 95% kolagenu typu I, 5% kolagenu typu IV). Przykłady dalszych protokołów przygotowania sieci kolagenowej z wykorzystaniem kolagenu typu I z innych źródeł, takich jak świnie lub szczury, podano w 32,33. Nie należy zmieniać objętości użytych roztworów, ponieważ zmieni to ostateczne stężenie kolagenu wynoszące 1,67 mg/ml siatki. Wyższe lub niższe stężenie kolagenu ma wpływ na gęstość włókien kolagenowych i średnią odległość między nimi, co towarzyszy zachowaniom migracyjnym komórek34.
  3. Dodaj 100 μl końcowej zawiesiny kolagenu do 50 μl zawiesiny komórkowej i dokładnie wymieszaj. Ostateczna zawiesina kolagenu (1,67 mg/ml kolagenu) jest lekko lepka. Aby przenieść odpowiednią ilość (100 μl), należy raz pipetować końcowy roztwór kolagenu w górę i w dół przed przeniesieniem go do zawiesiny komórek.
    UWAGA: Gdy mieszanina komórek zawiesiny kolagenu zostanie połączona z 10-krotnym roztworem MEM / wodorowęglanu sodu, a wartość pH zmieni się na 7,5, włókna kolagenowe natychmiast zaczynają polimeryzować.
  4. Przenieś końcową mieszaninę komórek zawiesiny kolagenu z probówek reakcyjnych do komór migracyjnych. Delikatnie postukaj w komorę migracyjną, aby równomiernie rozprowadzić mieszankę komórek zawiesiny kolagenu na dnie komory migracyjnej (rysunek 1H). Umieść komory migracyjne w pozycji pionowej na stojaku i inkubuj przez około 30 minut (37 °C, 5% CO2 ), aby umożliwić polimeryzację włókien kolagenowych.
  5. Zauważ, że spolimeryzowana siatka kolagenowa jest lekko mętna, ale nadal ma jasnofioletowy kolor. Napełnić komory migracyjne kompletną pożywką lub kompletną pożywką z interesującymi dodatkami i uszczelnić komorę migracyjną mieszanką wosku parafinowego i wazeliny (rysunki 1I,1J).

3. Rejestrowanie i analiza migracji komórek

Ta sekcja opisuje rejestrowanie migracji komórek za pomocą poklatkowej mikroskopii wideo oraz analizę migracji komórek za pomocą ręcznego śledzenia komórek.

  1. Włączyć mikroskop i grzałkę stolika mikroskopu. Ustaw temperaturę na 37 °C. Użyj obiektywu 10X. Umieść komorę migracyjną pod mikroskopem i skup się na około 50 lub więcej komórkach w polu view.
  2. Nagrywaj migrację komórek w trybie poklatkowym za pomocą aplikacji do nadzoru wideo z wieloma kamerami. Zapisz filmy z migracją komórek w odpowiednim formacie, np. "*.avi" lub "*.mov". Połącz pliki filmowe migracji komórek z bazą danych zawierającą informacje pomocnicze, takie jak typ komórki i warunki eksperymentalne.
    UWAGA: Rejestrujemy limfocyty i HSPC przez maksymalnie 2 godziny przy użyciu współczynnika poklatkowego 1:80, co oznacza, że 0,75 sekundy w trybie poklatkowym jest równe 1 minutzie w czasie rzeczywistym. Komórki nowotworowe są komórkami wolno poruszającymi się i dlatego są rejestrowane przez co najmniej 16 godzin przy użyciu współczynnika poklatkowego 1:1,800 (0,5 sekundy w czasie poklatkowym jest równe 15 minutom w czasie rzeczywistym).
  3. Analizuj filmy z migracją komórek za pomocą odpowiedniej aplikacji do śledzenia komórek, takiej jak wtyczki oprogramowania ImageJ (przegląd znajduje się w 18). Dla bezstronnej analizy kluczowe znaczenie ma to, że komórki będą wybierane losowo bez wiedzy o tym, czy komórki są aktywne migrująco, czy nie.
    UWAGA: Używamy samodzielnie opracowanej aplikacji do ręcznego śledzenia ścieżek co najmniej 30 komórek na eksperyment poprzez dokładne podążanie za poruszającymi się komórkami za pomocą kursora myszy (który jest umieszczony na jądrze). Podczas śledzenia współrzędne xy śledzonych komórek są automatycznie określane zgodnie z używanym trybem poklatkowym. Dla limfocytów/HSPC współrzędne xy są określane co 0,75 sekundy (co odpowiada 1 minutie w czasie rzeczywistym), podczas gdy dla komórek nowotworowych współrzędne xy są określane co 0,5 sekundy (równe 15 minutom czasu rzeczywistego).
  4. Określ łącznie 60 współrzędnych xy na komórkę dla typowego eksperymentu migracji komórek. Jest to równe 1 godzinie w czasie rzeczywistym dla limfocytów/HSPC i 15 godzinom w czasie rzeczywistym dla komórek nowotworowych. Znak "," oznacza, że komórka nie przemieściła się między dwoma punktami czasowymi, natomiast "wartość liczbowa" wskazuje odległość w "pikselach", na jaką komórka przemieściła się między 2 punktami czasowymi (Rysunek 2A).
    UWAGA: Ręczne śledzenie komórek wymaga doświadczenia. Szczególnie szybko migrujące komórki są trudne do śledzenia, a każdy typ komórki wykazuje odrębne zachowanie migracyjne, które może być wywołane przez czynniki uzupełniające. W przypadku podziału komórki podczas śledzenia, losowo wybierz jedną komórkę potomną do kontynuowania śledzenia. Komórki, które migrują poza pole widzenia lub giną podczas śledzenia, nie są zaniedbywane, ale są brane pod uwagę do analizy.

4. Analiza danych

  1. Analizuj dane śledzenia komórek za pomocą odpowiedniej aplikacji, np. arkusza kalkulacyjnego.
    1. Analizuj dane śledzenia komórek, kopiując nieprzetworzone dane śledzenia komórek (Rysunek 2A) do samodzielnie zaprojektowanego szablonu arkusza kalkulacyjnego. Pomnóż sumę "wartości liczbowych", reprezentujących całkowitą odległość, jaką przebyła komórka, za pomocą współczynnika korekcyjnego w celu przekształcenia "piksela" na "μm".
    2. Określ dwa parametry migracji komórek: aktywność lokomotoryczną (która jest równoważna szybkości migracji) i czas aktywnego ruchu (ryc. 2C,2D).
    3. Zidentyfikuj komórki, które migrowały poniżej 25 μm (poziom progowy w celu zmniejszenia liczby komórek fałszywie dodatnich) jako komórki nieruchome. Zamień "wartości liczbowe" tych komórek na ",".
      UWAGA: Parametr "aktywność lokomotoryczna" (lub szybkość migracji) reprezentuje procent komórek w śledzonej populacji komórek, które przemieszczały się między dwoma punktami czasowymi (Rysunek 2D). "Wartość liczbowa" jest zdefiniowana jako ruchoma komórka, podczas gdy "," jest zdefiniowana jako nieruchoma komórka. Parametr "czas aktywnego ruchu" (czas aktywności) reprezentuje procent całkowitego czasu, w jakim komórka migrowała w stosunku do ram czasowych okresu obserwacji (rysunek 2C). "Wartość liczbowa" oznacza, że komórka się przeniosła, natomiast "," oznacza, że komórka się nie przeniosła. Ten parametr jest dalej używany do określania liczby komórek, które się nie przesunęły.
  2. Obliczanie istotności statystycznej i wyświetlanie danych migracji komórek.
    1. Obliczyć istotność statystyczną średniej aktywności lokomotorycznej komórek (szybkości migracji) za pomocą testu U Manna-Whitneya. Uznaj, że wartość p < 0,05 jest znacząca.
    2. Wyświetlaj średnią aktywność lokomotoryczną komórek jako diagram xy, diagram BoxPlot lub jako diagram wykresu słupkowego. Wyświetlanie danych opartych na pojedynczych komórkach, takich jak czas aktywnego ruchu lub prędkość, jako diagramu słupkowego lub histogramu.
      UWAGA: Jeśli wybrana aplikacja do obsługi arkuszy kalkulacyjnych nie zawiera wykresu BoxPlot ani narzędzia do tworzenia wykresów histogramu, należy przeprowadzić wyszukiwanie w Internecie w poszukiwaniu odpowiednich samouczków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystany test migracji macierzy kolagenowej 3D w połączeniu z wideomikroskopią poklatkową i wspomaganym komputerowo śledzeniem komórek pozwala na określenie różnych parametrów migracji komórek, w tym zarówno parametrów populacyjnych (np. średnia aktywność lokomotoryczna), jak i parametrów opartych na pojedynczej komórce (np. czas aktywnego ruchu, prędkość, migrowana odległość). Przykład uzyskanych zestawów danych śledzenia komórek, przetwarzania danych i prezentacji danych przedstawiono na r...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność do migracji jest cechą charakterystyczną komórek nowotworowych4. Bez zdolności do odłączenia się od guza pierwotnego i migracji przez otaczającą tkankę łączną, komórki nowotworowe nie będą w stanie zasiać wtórnych zmian, które są główną przyczyną śmierci prawie wszystkich pacjentów z rakiem. Ze względu na ten związek, wiele badań koncentruje się na migracji komórek rakowych. Celem tych badań jest identyfikacja nowych cząsteczek docelowych i szlaków docelowych, które skutecznie blokują migrację komórek...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Fundację Fritz-Bender, Monachium, Niemcy

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroskop odwrócony Leica DM ILLeica, Wetzlar, Niemcy
Grzałka sceniczna mikroskopuDistelkamp Electronic, Kaiserslautern, Niemcy
Kamera wideo JVC C1431JVC, Bad Vilbel, Niemcy
Serwer wideo Axis 241QAxis communication GmbH, Ismaning, Niemcy
Komputer Mac G5 AppleMacintosh
iMacApple Macintosh
FileMaker ProFileMaker GmbH, Unterschleiß heim, Niemcy
Oprogramowanie do nadzoru wideo z wieloma kamerami (Security Spy)Bensoftware, Londyn, Wielka Brytania
Runtime Revolution Media 2.9.0RunRev Ltd., Edynburg, Wielka Brytania
ParaffinApplichem GmbH, Darmstadt, NiemcyA4264
WazelinaLokalna apteka
Purecol (płynny kolagen)Nutacon BV, Leimuiden, Holandiazawiera 2,9 - 3,3 mg/ml kolagenu bydlęcego (95% kolagenu typu I, 5% kolagenu typu IV)
10x MEMSigma Aldrich, Taufkirchen, NiemcyM0275
7,5% roztwór wodorowęglanu soduSigma Aldrich, Taufkirchen, NiemcyS8761
EGFSigma Aldrich, Taufkirchen, NiemcyE9644
U73122Merck Millipore, Darmstadt, Niemcy662035najpierw rozpuścić w CHCl3; rozpuścić w DMSO tuż przed użyciem

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dittmar, T., Zänker, K. S. Cell Fusion in Health and Disease. 1, Springer. (2011).
  2. Dittmar, T., Zänker, K. S. Cell Fusion in Health and Disease. 2, Springer. (2011).
  3. Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  5. Heyder, C., et al. Role of the beta1-integrin subunit in the adhesion, extravasation and migration of T24 human bladder carcinoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 22, 99-106 (2005).
  6. Mitra, S. K., Hanson, D. A., Schlaepfer, D. D. Focal adhesion kinase: in command and control of cell motility. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 56-68 (2005).
  7. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  8. Haudenschild, C. C., Schwartz, S. M. Endothelial regeneration. II. Restitution of endothelial continuity. Lab. Invest. 41, 407-418 (1979).
  9. Todaro, G. J., Lazar, G. K., Green, H. The initiation of cell division in a contact-inhibited mammalian cell line. J. Cell. Physiol. 66, 325-333 (1965).
  10. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).
  11. Friedl, P., Noble, P. B., Zänker, K. S. Lymphocyte locomotion in three-dimensional collagen gels. Comparison of three quantitative methods for analysing cell trajectories. J. Immunol. Methods. 165, 157-165 (1993).
  12. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
  13. Akedo, H., Shinkai, K., Mukai, M., Komatsu, K. Establishment of an experimental model for tumor cell invasion and potentiation and inhibition of the invasive capacity. Gan To Kagaku Ryoho. 14, 2048-2055 (1987).
  14. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
  15. Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matrix. Cell. Mol. Life Sci. 57, 41-64 (2000).
  16. Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nat. Med. 16, 116-122 (2010).
  17. Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2604-2609 (2003).
  18. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
  19. Shields, E. D., Noble, P. B. Methodology for detection of heterogeneity of cell locomotory phenotypes in three-dimensional gels. Exp. Cell Biol. 55, 250-256 (1987).
  20. Entschladen, F., Gunzer, M., Scheuffele, C. M., Niggemann, B., Zanker, K. S. T lymphocytes and neutrophil granulocytes differ in regulatory signaling and migratory dynamics with regard to spontaneous locomotion and chemotaxis. Cell. Immunol. 199, 104-114 (2000).
  21. Kasenda, B., et al. The stromal cell-derived factor-1alpha dependent migration of human cord blood CD34 haematopoietic stem and progenitor cells switches from protein kinase C (PKC)-alpha dependence to PKC-alpha independence upon prolonged culture in the presence of Flt3-ligand and interleukin-6. Br. J. Haematol. 142, 831-845 (2008).
  22. Kassmer, S. H., et al. Cytokine combinations differentially influence the SDF-1alpha-dependent migratory activity of cultivated murine hematopoietic stem and progenitor cells. Biol. Chem. 389, 863-872 (2008).
  23. Seidel, J., et al. The neurotransmitter gamma-aminobutyric-acid (GABA) is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1. Stem Cells Dev. 16, 827-836 (2007).
  24. Weidt, C., Niggemann, B., Hatzmann, W., Zanker, K. S., Dittmar, T. Differential effects of culture conditions on the migration pattern of stromal cell-derived factor-stimulated hematopoietic stem cells. Stem Cells. 22, 890-896 (2004).
  25. Balz, L. M., et al. The interplay of HER2/HER3/PI3K and EGFR/HER2/PLC-gamma1 signalling in breast cancer cell migration and dissemination. J. Pathol. 227, 234-244 (2012).
  26. Berndt, B., et al. Fusion of CCL21 non-migratory active breast epithelial and breast cancer cells give rise to CCL21 migratory active tumor hybrid cell lines. PLoS ONE. 8, e63711(2013).
  27. Dittmar, T., et al. Induction of cancer cell migration by epidermal growth factor is initiated by specific phosphorylation of tyrosine 1248 of c-erbB-2 receptor via EGFR. FASEB J. 16, 1823-1825 (2002).
  28. Ozel, C., et al. Hybrid cells derived from breast epithelial cell/breast cancer cell fusion events show a differential RAF-AKT crosstalk. Cell Commun Signal. 10, (2012).
  29. Katterle, Y., et al. Antitumour effects of PLC-gamma1-(SH2)2-TAT fusion proteins on EGFR/c-erbB-2-positive breast cancer cells. Br. J. Cancer. 90, 230-235 (2004).
  30. Friedl, P., et al. Migration of Coordinated Cell Clusters in Mesenchymal and Epithelial Cancer Explants in Vitro. Cancer Res. 55, 4557-4560 (1995).
  31. Keeve, P. L., et al. Characterization and analysis of migration patterns of dentospheres derived from periodontal tissue and the palate. J. Periodontal Res. 48, 276-285 (2013).
  32. Kreger, S. T., et al. Polymerization and matrix physical properties as important design considerations for soluble collagen formulations. Biopolymers. 93, 690-707 (2010).
  33. Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1, 2753-2758 (2006).
  34. Friedl, P., et al. Migration of Highly Aggressive MV3 Melanoma Cells in 3-Dimensional Collagen Lattices Results in Local matrix Reorganization and Shedding of alpha2 and alpha1 Integrins and CD44. Cancer Res. 57, 2061-2070 (1997).
  35. Falasca, M., et al. Activation of phospholipase C gamma by PI 3-kinase-induced PH domain-mediated membrane targeting. EMBO J. 17, 414-422 (1998).
  36. Palm, D., et al. The norepinephrine-driven metastasis development of PC-3 human prostate cancer cells in BALB/c nude mice is inhibited by beta-blockers. Int. J. Cancer. 118, 2744-2749 (2006).
  37. Melhem-Bertrandt, A., et al. Beta-blocker use is associated with improved relapse-free survival in patients with triple-negative breast cancer. J. Clin. Oncol. 29, 2645-2652 (2011).
  38. Dittmar, T., Heyder, C., Gloria-Maercker, E., Hatzmann, W., Zanker, K. S. Adhesion molecules and chemokines: the navigation system for circulating tumor (stem) cells to metastasize in an organ-specific manner. Clin. Exp. Metastasis. 25, 11-32 (2008).
  39. Berndt, B., Zanker, K. S., Dittmar, T. Cell Fusion is a Potent Inducer of Aneuploidy and Drug Resistance in Tumor Cell/ Normal Cell Hybrids. Crit. Rev. Oncog. 18, 97-113 (2013).
  40. Dittmar, T., Nagler, C., Niggemann, B., Zänker, K. S. The dark side of stem cells: triggering cancer progression by cell fusion. Curr.Mol. Med. 13, 735-750 (2013).
  41. Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 11115-11120 (2011).
  42. Haessler, U., Teo, J. C., Foretay, D., Renaud, P., Swartz, M. A. Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber. Integr. Biol. 4, 401-409 (2012).
  43. Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 13515-13520 (2012).
  44. Alberts, B., et al. The extracellular matrix of animals. , 4th, Garland Science. (2002).
  45. Humphries, J. D., Byron, A., Humphries, M. J. Integrin ligands at a glance. J. Cell Sci. 119, 3901-3903 (2006).
  46. Reyes-Reyes, M., Mora, N., Gonzalez, G., Rosales, C. beta1 and beta2 integrins activate different signalling pathways in monocytes. Biochem. J. 363, 273-280 (2002).
  47. Di Lullo, G. A., Sweeney, S. M., Korkko, J., Ala-Kokko, L., San Antonio, J. D. Mapping the ligand-binding sites and disease-associated mutations on the most abundant protein in the human, type I collagen. J. Biol. Chem. 277, 4223-4231 (2002).
  48. Mempel, T. R., et al. Regulatory T cells reversibly suppress cytotoxic T cell function independent of effector differentiation. Immunity. 25, 129-141 (2006).
  49. Reiner, T., Earley, S., Turetsky, A., Weissleder, R. Bioorthogonal small-molecule ligands for PARP1 imaging in living cells. Chembiochem. 11, 2374-2377 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia time lapseledzenie kom rekrodowisko 3Dkom rki nowotworoweleukocytykom rki macierzystestymulacja EGFanaliza statystyczna

Powiązane artykuły