Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Strategie śledzenia anastazy, zjawiska przeżycia komórek, które odwraca apoptozę

18.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51964

⸱

16 lutego 2015

 ,  ,  , 
1W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong, 3Center for Cell Dynamics, Department of Biological Chemistry, Johns Hopkins University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Termin anastasis odnosi się do zjawiska, w którym umierające komórki odwracają proces samobójstwa komórki na późnym etapie, naprawiają się i ostatecznie przeżywają. Tutaj pokazujemy protokoły wykrywania i śledzenia komórek, które przechodzą anastazę.

Streszczenie

Anastasis (po grecku "wskrzeszenie do życia") odnosi się do odzyskiwania umierających komórek. Zanim komórki te wyzdrowieją, przeszły przez ważne punkty kontrolne apoptozy, w tym fragmentację mitochondriów, uwalnianie mitochondrialnego cytochromu c do cytozolu, aktywację kaspaz, kondensację chromatyny, uszkodzenie DNA, fragmentację jądra, pęcherzenie błony plazmatycznej, kurczenie się komórek, ekspozycję powierzchni komórki na fosfatydyloserynę i tworzenie ciał apoptotycznych. Anastaza może wystąpić, gdy bodźce apoptotyczne są usuwane przed śmiercią, umożliwiając w ten sposób umierającym komórkom odwrócenie apoptozy i potencjalnie innych mechanizmów śmierci. Dlatego wydaje się, że anastaza obejmuje fizjologiczne procesy gojenia, które mogą również niewłaściwie podtrzymywać uszkodzone komórki. Funkcje i mechanizmy anastazy są nadal niejasne, częściowo utrudnione przez ograniczone narzędzia do wykrywania przeszłych zdarzeń po odzyskaniu pozornie zdrowych komórek. Strategie wykrywania anastazy umożliwią badania mechanizmów fizjologicznych, zagrożeń związanych z nieumarłymi komórkami w patologii choroby oraz potencjalnych środków terapeutycznych modulujących zespolenie. W tym miejscu opisujemy skuteczne strategie wykorzystujące mikroskopię żywych komórek i bioczujnik kaspazy ssaków do identyfikacji i śledzenia anastazy w komórkach ssaków.

Wprowadzenie

Apoptoza (po grecku "upadek na śmierć") jest ogólnie uważana za jednokierunkowy proces kończący się samobójstwem komórki1-7. Genetyczne zakłócenie genów pro-śmierci powoduje przeżycie dodatkowych komórek, które w przeciwnym razie umarłyby u całych zwierząt, w tym komórek, które już zainicjowały szlak apoptozy8,9. Podobnie, manipulacje genetyczne pozwalają zdrowym komórkom ssaków, które sztucznie wyświetlają sygnały "zjedz mnie" lub które tracą przyczepność do swojej macierzy zewnątrzkomórkowej, uniknąć śmierci odpowiednio przez fagocytozę lub entozę całych komórek. Jednak my i inni wykazaliśmy, że bez manipulacji genetycznej normalne, zdrowe komórki i linie komórkowe ssaków mogą również odzyskać siły po wczesnych stadiach apoptozy12-15. Korzystając z narzędzi do śledzenia pojedynczych komórek, wykazaliśmy ponadto powrót do zdrowia po późnych stadiach apoptozy12,13, po tym, jak komórki przeszły ważne punkty kontrolne, które zwykle wyznaczają "punkt bez powrotu"2-6. Te punkty kontrolne późnego stadium apoptozy obejmują mitochondrialne uwalnianie cytochromu c, aktywację kaspaz, fragmentację jądrową i tworzenie ciał apoptotycznych. Przyjęliśmy greckie słowo złożone "anastasis", które oznacza "powstanie do życia", aby opisać to odwrócenie apoptozy na skraju śmierci komórki2-6.

Dopóki cały proces odzyskiwania do umierania nie jest obserwowany przez obrazowanie żywych komórek, trudno jest odróżnić komórki, które przeszły anastazę, od komórek, które nigdy nie doświadczyły zdarzeń apoptozy. Dziesięciolecia prac ujawniły, że cechy morfologiczne samobójstwa komórek przez apoptozę są napędzane przez ewolucyjnie zachowane zdarzenia biochemiczne i molekularne16-19. Zdarzenia te sprzyjają samoniszczeniu komórek w celu regulacji procesów rozwojowych i homeostatycznych w organizmach jednokomórkowych i wielokomórkowych poprzez eliminację uszkodzonych lub niebezpiecznych komórek16-19. Podczas gdy komórki apoptotyczne można łatwo odróżnić za pomocą standaryzowanych morfologicznych, biochemicznych i molekularnych objawów apoptozy1,5,6,16,20, obecnie nie jest znany marker specyficzny dla anastazy12,13. Co ważne, komórki, które przeszły anastazę, wydają się być normalnymi, zdrowymi komórkami, a komórki, które właśnie zaczynają odwracać apoptozę, wyglądają jak apoptotyczne umierające komórki12,13. W związku z tym potrzebne są nowe narzędzia, aby stwierdzić z całą pewnością, że dana komórka, która przeżyła, doświadczyła wcześniej aktywnych procesów apoptotycznych.

Apoptoza jest ogólnie uważana za nieodwracalną kaskadę, ponieważ jest to szybki i masowy proces niszczenia. Chociaż może minąć od kilku minut do kilku dni, aby zainicjować apoptozę, gdy mitochondria uwolnią czynniki apoptogenne, takie jak cytochrom c do cytozolu 21,22, kaspazy mogą zostać aktywowane w ciągu 5 minut23,24, a następnie kondensacja cytoplazmatyczna i jądrowa w ciągu 10 minut25-27, a wkrótce potem śmierć komórki25-27. Aktywowane kaspazy koordynują apoptozę poprzez rozszczepianie i inaktywację kluczowych składników strukturalnych i funkcjonalnych w celu rozbiórki komórek2,28, takich jak inhibitor endonukleazy DFF45 / ICAD29,30. Kaspazy aktywują również czynniki proapoptotyczne, takie jak członek rodziny BCL-2 BID, który translokuje się do mitochondriów, aby promować mitochondrialne uwalnianie cytochromu c31,32. Aktywność kaspazy powoduje również ekspozycję powierzchni komórek na fosfatydyloserynę jako sygnał "zjedz mnie" w celu promowania pochłaniania umierających komórek przez makrofagi lub sąsiednie komórki poprzez fagocytozę33. Co więcej, zdarzenia apoptotyczne sprawiają, że mitochondria są dysfunkcyjne, zaburzając bioenergetykę komórkową i metabolizm34,35,36. W związku z tym wyzdrowienie z takiego zniszczenia wydaje się intuicyjnie mało prawdopodobne.

Wbrew pierwotnym oczekiwaniom, komórki mogą odwrócić proces apoptotycznej śmierci komórki nawet na późnym etapie. Poprzez ciągłe monitorowanie losu umierających komórek w hodowli, zaobserwowaliśmy odwracalność apoptozy w późnym stadium w szeregu pierwotnych komórek i linii komórkowych12,13. Usunięcie bodźca śmierci pozwoliło na powrót do zdrowia po jawnych cechach apoptozy, takich jak fragmentacja mitochondriów, kondensacja chromatyny, uszkodzenie DNA, pęcherzenie błony plazmatycznej, ekspozycja powierzchni komórki na fosfatydyloserynę, uwalnianie mitochondrialnego cytochromu c, aktywacja kaspazy, fragmentacja jądrowa, kurczenie się komórek i tworzenie ciał apoptotycznych. Obserwacje te rodzą pytania bez odpowiedzi dotyczące funkcji, konsekwencji i mechanizmów anastazy. Aby odpowiedzieć na te pytania, warunkiem wstępnym jest wiarygodna identyfikacja komórek, które przeszły anastazę. W tym miejscu opisujemy metody mikroskopii na żywo i bioczujnik kaspazy do wykrywania komórek, które wcześniej odwróciły późne stadium apoptozy, a następnie przeżyły.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie komórek do obrazowania żywych komórek

  1. Aby ułatwić wykrycie zmian morfologicznych, wybierz komórki przylegające, takie jak komórki HeLa (ludzki rak szyjki macicy), które są płaskie na podłożu, aby lepiej uwidocznić zmiany błony komórkowej i organelli wewnątrzkomórkowych.
    Uwaga: Odwrócenie apoptozy zaobserwowano w różnych komórkach ssaków12,13, w tym w pierwotnych komórkach wątroby myszy, pierwotnych makrofagach myszy, pierwotnych kardiomiocytach szczurów, a także w liniach komórkowych, takich jak ludzkie embrionalne komórki nerkowe HEK-293T, komórki nabłonka nerkowego afrykańskiej zielonej małpy COS-7, komórki HL-1 mięśnia sercowego myszy, mysie fibroblasty NIH 3T3, fretka (Mustela putoris furo) komórki CRL1656 mózgu, ludzkie komórki raka skóry A375, komórki CRL1973 ludzkiego raka jąder, komórki ludzkiego drobnokomórkowego raka płuc H446, komórki ludzkiego raka wątroby HepG2, ludzkie komórki raka piersi MCF7, ludzkie komórki PC3 raka prostaty i ludzkie komórki nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y.
  2. Szkiełka nakrywkowe ze szklanych naczyń do hodowli komórek szklanych należy umyć absolutnym etanolem do czyszczenia i sterylizacji.
    Uwaga 1: Stosowanie naczyń ze szklanym dnem jest zalecane do wysokiej jakości mikroskopii z kontrastem interferencyjnym różnicowym (DIC) oraz mikroskopii konfokalnej lub epifluorescencyjnej o dużym powiększeniu (patrz dyskusja).
    Uwaga 2: W przypadku dużych powiększeń (obiektywy 40x, 60/63x lub 100x i duże apertury numeryczne 1,3 lub 1,4), zastosowanie szalek do hodowli komórkowych z cieńszym dnem szklanym (grubość 0,085-0,16 mm) zapewnia większe odległości robocze do obrazowania (patrz protokół 3).
  3. W zależności od typu komórki, szalki do hodowli ze szklanym dnem mogą wymagać pokrycia poli-d-lizyną (0,1 mg/ml), kolagenem (0,01% roztwór w 0,01 M kwasie octowym) i/lub fibronektyną (5 μg/ml) przed wysiewem komórek.
    Uwaga: Optymalizacja rodzaju i stężenia środka powlekającego jest wymagana dla różnych linii komórkowych. Ogniwa HeLa mogą przylegać bezpośrednio do szkła bez powłoki. Jednak niektóre komórki, takie jak komórki HL-1 mięśnia sercowego myszy, nie mogą przylegać bezpośrednio do powierzchni szklanych, ale wymagają określonych protokołów hodowli i powlekania37.
  4. Wysiewaj ~ 2-3 x 105 komórek na 35 mm wstępnie powlekanych szklanych naczyniach hodowlanych komórek i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza (°C) z 5% CO2 przez dzień, aby osiągnąć 80% konfluencji.
    Uwaga 1: Optymalne warunki gęstości komórek, czasu inkubacji i warunków hodowli mogą się różnić w zależności od typu komórki. Zbieganie się komórek może wpływać na odpowiedź apoptotyczną komórek (patrz Protokół 2). Przy dużej konfluencji komórki mogą być mniej wrażliwe na te same stężenia bodźców apoptotycznych.
    Uwaga 2: Unikaj nadmiernej konfluencji komórek, ponieważ duża gęstość komórek może przesłaniać zmiany morfologiczne poszczególnych komórek i ich organelli.

2. Stosowanie i usuwanie bodźców apoptotycznych komórek

  1. Na krótko przed użyciem należy wstępnie wymieszać środek indukujący apoptozę z pożywką do hodowli komórkowych o temperaturze 37 °C. Etanol (3,6-4,5% obj./obj.) służył jako induktor apoptozy w niniejszej demonstracji.
    Uwaga 1: Nasze opublikowane i niepublikowane dane pokazują, że komórki mogą również odwrócić apoptozę, która jest wywoływana przez inne bodźce apoptotyczne12,13, takie jak dimetylosulfotlenek (DMSO, 8% obj./obj. przez 24 godziny), staurosporyna (STS, 0,5 μM przez 1 godz.) i taksol (1 μM przez 12 godzin). Optymalizacja dawki w celu wywołania apoptozy jest wymagana dla różnych rodzajów komórek, aby osiągnąć minimalną dawkę, która może wywołać apoptozę u większości komórek w populacji.
    Uwaga 2: Wstępne mieszanie środków indukujących apoptozę z pożywką do hodowli komórkowych jest ważne, aby uniknąć nierównomiernej ekspozycji komórek na bodźce apoptotyczne.
  2. Zobrazuj grupę zdrowych komórek w naczyniu do hodowli komórkowej przed zastosowaniem środka indukującego apoptozę w celu ustalenia morfologii wyjściowej.
  3. Usuń oryginalną pożywkę z naczynia do hodowli komórek, a następnie nałóż 2 ml wstępnie zmieszanego środka indukującego apoptozę na naczynie, aby wywołać apoptozę komórek. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 (lub w innych normalnych warunkach hodowli).
  4. Po inkubacji obserwuj komórki za pomocą światła, epifluorescencji lub mikroskopii konfokalnej, aby monitorować postęp cech apoptotycznych.
    Uwaga 1: Komórki poddawane apoptozie będą wykazywać morfologiczne, biochemiczne i molekularne cechy apoptozy, które mogą być wykryte przez mikroskopię i biosensory oparte na fluorescencji (patrz Protokoły 3 i 4).
    Uwaga 2: Czas inkubacji komórek z różnymi induktorami apoptozy będzie się różnił, w zależności od typu komórki, warunków komórkowych (takich jak konfluencja i stan odżywienia) oraz dawki zastosowanego bodźca śmierci. Może być konieczne staranne miareczkowanie.
  5. Gdy komórki wykazują cechy apoptozy, należy usunąć czynnik indukujący apoptozę, myjąc komórki raz ciepłym (37 °C lub inna normalna temperatura) świeżym pożywką do hodowli komórek.
    Uwaga 1: Ponieważ komórki apoptotyczne są luźniej przyczepione do płytki hodowlanej, ważne jest, aby delikatnie nakładać i usuwać pożywkę, aby komórki nie zostały wypłukane.
    Uwaga 2: Żywe zawieszone komórki można odzyskać z supernatantu przez delikatne odwirowanie (160 x g przez 1 minutę) i dodać z powrotem do szalki hodowlanej.
  6. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C na naczyniu o pojemności 2 ml/35 mm ze świeżą pożywką komórkową w 5% CO2 . Alternatywnie, użyj kondycjonowanej pożywki (bezkomórkowej pożywki hodowlanej pobranej ze zdrowych komórek), aby jeszcze bardziej zwiększyć przeżywalność komórek apoptotycznych.
    Uwaga: Mycie i inkubacja komórek ze świeżą pożywką pozwala większości komórek na odwrócenie apoptozy wywołanej etanolem po ekspozycji na etanol12,13. Jednak powtórzenie tego kroku mycia może być wymagane, gdy komórki są wystawione na inne bodźce apoptotyczne (patrz Dyskusja).

3. Mikroskopia żywych komórek

  1. Zalecamy użycie odwróconego mikroskopu konfokalnego lub epifluorescencyjnego z kontrolą warunków środowiskowych (37 °C, 5% CO2) do mikroskopii żywych komórek.
    Uwaga: Możliwe jest również obrazowanie komórek za pomocą mikroskopów pionowych z obiektywem zanurzającym w wodzie. Zanurz obiektyw bezpośrednio w pożywce hodowlanej, aby zobrazować komórki. Jednak komórki mogą zostać zmiażdżone przez obiektyw zanurzający podczas ustawiania ostrości.
  2. Rozgrzej wstępnie mikroskop (taki jak komora kontroli środowiska, inkubator stage i grzałka obiektywowa) co najmniej 2 godziny przed obrazowaniem.
    Uwaga: Dzięki temu elementy mikroskopu osiągają równowagę termiczną, dzięki czemu można uniknąć dryfu ostrości i przesunięcia płaszczyzny x-y z powodu rozszerzalności cieplnej i kurczenia się elementów.
  3. Umieścić 35-milimetrową szklaną pokrywę z hodowanymi komórkami (patrz Protokół 1) na stoliku mikroskopu odwróconego i uchwycić obrazy komórek za pomocą obiektywu planapochromatycznego 40X lub 63X z aperturą numeryczną (N.A.) 1.3 lub 1.4 do obrazowania komórek od dna szalki przez szklane szkiełka nakrywkowe.
    Uwaga: Unikaj nakładania ponad 2 ml szklanego dna na pożywkę o średnicy 35 mm, ponieważ waga pożywki może spowodować krzywiznę szklanego dna, co utrudni obrazowanie pola komórek w tej samej płaszczyźnie ogniskowej.
  4. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C lub odpowiedniej normalnej temperaturze podczas całego procesu obrazowania.
    Uwaga: Proces apoptozy i prawdopodobnie odwrócenie apoptozy zależy od aktywności enzymatycznej wrażliwej na temperaturę. Dlatego ważne jest utrzymanie komórek w temperaturze 37 °C (np. za pomocą inkubatora z mikroskopem) przez cały czas trwania eksperymentu. Obniżona temperatura może spowolnić odpowiedź apoptotyczną i odpowiedź regeneracyjną po usunięciu bodźca apoptotycznego.
  5. Użyj urządzenia do pomiaru wilgotności lub połóż przezroczystą folię (patrz materiały) na naczyniu hodowlanym, aby zmniejszyć utratę wody przez odparowanie z pożywki.
    Uwaga: folia może zakłócać polaryzację światła w mikroskopii DIC. Przywróć polaryzację, regulując polaryzator na ścieżce światła.
  6. Utrzymać pH w pożywce do hodowli komórkowej (pH 6,8 -7,3) poprzez inkubację w 5% CO2 z komorą kontroli środowiska pod mikroskopem.
    Uwaga: Utrzymanie pH w pożywce hodowlanej można również osiągnąć poprzez dodanie buforu HEPES lub użycie komercyjnej pożywki niezależnej od CO2 (patrz Materiały). Optymalne warunki mogą się różnić w zależności od typu ogniwa.
  7. Zminimalizuj ekspozycję na fluorescencję/laser (natężenie światła wzbudzającego) na komórki podczas procesu obrazowania, aby uniknąć fototoksyczności, zmniejszając intensywność fluorescencji do najniższego wymaganego do uzyskania wysokiej jakości obrazów struktur komórkowych/subkomórkowych lub ekspresji biosensorów (szczegóły w Protokole 4).

4. Strategie wykrywania i śledzenia anastazy w trakcie i po zdarzeniach apoptotycznych

  1. Pęcherzenie błony plazmatycznej, kondensacja cytoplazmatyczna, kurczenie się komórek i tworzenie ciał apoptotycznych (patrz ryc. 1A-C, E).
    1. Wykonaj poklatkową mikroskopię kontrastu interferencji różnicowej żywych komórek (DIC) lub mikroskopii z kontrastem fazowym, aby śledzić grupę zdrowych komórek i obserwować ich morfologię komórek (patrz Protokół 3 dla mikroskopii żywych komórek i patrz dyskusja).
      Uwaga 1: Zmniejsz intensywność źródła światła do obrazowania DIC/kontraktu fazowego, aby uniknąć fototoksyczności dla komórek.
      Uwaga 2: Jeśli mikroskopia DIC i mikroskopia z kontrastem fazowym nie są dostępne, użyj CellTracker do barwienia cytozolu, aby nakreślić morfologię żywych komórek do mikroskopii konfokalnej lub epifluorescencyjnej i monitorować morfologię komórek.
    2. Zastosuj bodziec śmierci komórki, aby skłonić komórki do poddania się apoptozie (patrz Protokół 2 w celu zastosowania i usunięcia bodźców apoptotycznych).
    3. Obserwuj leczone komórki pod kątem morfologicznych cech apoptozy, takich jak pęcherzenie błony plazmatycznej, kondensacja cytoplazmatyczna, kurczenie się komórek i tworzenie ciał apoptotycznych (ryc. 1A, 1B, 1C, 1E).
    4. Zmyj bodźce śmierci i ponownie zaopatrz komórki w świeżą pożywkę, gdy komórki wykazują morfologiczne cechy apoptozy.
      Uwaga 1: Zastosowanie bodźca śmierci komórki lub zmiana pożywki do hodowli komórkowej na stoliku mikroskopu podczas poklatkowego obrazowania żywych komórek można uzyskać za pomocą komory do hodowli komórek perfuzyjnych lub można je wykonać bezpośrednio na naczyniu do hodowli komórkowej, ostrożnie pipetując bez dotykania naczynia, w przerwach między obrazowaniem.
      Uwaga 2: Należy stosować systemy kompensacji dryftu ostrości, aby uniknąć nieostrości komórek z powodu utraty równowagi termicznej systemu mikroskopu po zmianie pożywki do hodowli komórkowej (patrz Dyskusja).
    5. Ciągłe obrazowanie poklatkowe w celu śledzenia losu komórek, które wykazują cechy apoptozy. Komórki, które odwracają apoptozę, mogą naprawiać uszkodzenia i odzyskiwać normalną płaską morfologię (ryc. 1A, 1B, 1C, 1E).
  2. Fragmentacja mitochondriów, kondensacja DNA/chromatyny i fragmentacja jądrowa (patrz rysunki 1D, 1F, 1G).
    1. Aby uwidocznić mitochondria, należy wybarwić komórki barwnikiem 50 nM MitoTracker czerwonym/ciemnoczerwonym/zielono-fluorescencyjnym i jednocześnie wybarwić jądro 10 μg/ml niebieskiego barwnika jądrowego Hoechst 33342 w pożywce hodowlanej przez 20 minut w temperaturze 37 °C 5% CO2,
      Uwaga 1: Zmniejsz stężenie barwników i czas inkubacji, aby uniknąć cytotoksyczności i w razie potrzeby zmniejszyć fluorescencję tła. Zoptymalizuj warunki barwienia, aby uzyskać dobry stosunek sygnału do szumu przy minimalnej ilości barwnika i czasie inkubacji do barwienia.
      Uwaga 2: Używaj barwników fluorescencyjnych dla mitochondriów, takich jak MitoTracker Red CMXRos, MitoTracker Deep Red FM lub MitoTracker Green FM, które nie wyciekają z mitochondriów podczas apoptozy. Pozwala to na wizualizację morfologii mitochondriów podczas apoptozy i zespolenia. Szczegółowe informacje na temat tych plam można znaleźć w tabeli materiałów i sprzętu.
    2. Trzymaj poplamione komórki w ciemności, aby uniknąć fotowybielania.
    3. Usunąć nadmiar barwnika, myjąc komórki 3 razy roztworem soli fizjologicznej (PBS) o temperaturze 37 °C lub roztworem świeżej pożywki do hodowli komórkowych, z 1-minutową inkubacją w świeżej pożywce między każdym myciem, a następnie dalej inkubować w świeżej pożywce przez 20 minut przed ostatnim płukaniem, aby umożliwić opuszczenie komórek przez nadmierne plamy w celu zmniejszenia niespecyficznego tła sygnału do obrazowania.
      Uwaga: Skrócenie czasu inkubacji za pomocą pożywki komórkowej po barwieniu może skutkować wysokim tłem do obrazowania.
    4. Wykonaj mikroskopię konfokalną lub epifluorescencyjną żywych komórek w czasie rzeczywistym, aby zobrazować zdrowe komórki przed zastosowaniem indukcji apoptotycznej (patrz Protokół 3 dla mikroskopii żywych komórek).
      Uwaga: Zdrowe komórki mają mitochondria rurkowe i okrągłe jądra w większości typów komórek (ryc. 1D, 1F, 1G).
    5. Wyzwalają komórki do apoptozy (patrz Protokół 2 w celu zastosowania i usunięcia bodźców apoptotycznych do komórek).
    6. Kontynuuj mikroskopię poklatkową żywych komórek, aby zaobserwować zmiany w morfologii mitochondriów i jąder natychmiast po zastosowaniu bodźca śmierci do komórek. Obserwuj komórki, które wykazują cechy apoptozy, takie jak fragmentacja i obrzęk mitochondriów, kondensacja chromatyny i fragmentacja jądrowa, w przeciwieństwie do zdrowych komórek wykazujących mitochondria rurkowe i okrągłe jądra.
    7. Gdy komórki wykazują cechy apoptozy, umyj je i zaopatrz je w świeżą pożywkę, a następnie kontynuuj obrazowanie poklatkowe, aby śledzić los komórek. Komórki, które odwracają apoptozę, odzyskują normalną morfologię mitochondriów i jąder (ryc. 1D, 1F, 1G).
      Uwaga: Jeśli to możliwe, należy wykonywać mikroskopię DIC równolegle, aby uzyskać dodatkowe informacje umożliwiające dostęp do etapów apoptozy poprzez obserwację zmian w morfologii komórek w tej samej grupie komórek (patrz Protokół 4.1 dla mikroskopii DIC).
  3. Wykrywanie mitochondrialnego uwalniania cytochromu c przy użyciu komórek stabilnie eksprymujących białko fuzyjne cytochromu c-GFP (patrz ryc. 2).
    1. Komórki barwiące stabilną ekspresję cytochromu c-GFP 23,24 za pomocą MitoTracker Red w celu oznaczenia mitochondriów spolaryzowanych komórek (patrz kroki 4.2.1 do 4.2.3 w przypadku barwienia mitochondriów żywych komórek).
    2. Wykonaj w czasie rzeczywistym mikroskopię konfokalną lub epifluorescencyjną żywych komórek, aby śledzić zdrowe komórki (szczegóły w Protokole 3 dla obrazowania żywych komórek).
      Uwaga: Sygnał cytochromu c-GFP lokalizuje się głównie w mitochondriach zdrowych komórek (ryc. 2Ai, 2B).
    3. Wyzwalają komórki do apoptozy (patrz Protokół 2 w celu zastosowania i usunięcia bodźców apoptotycznych do komórek). Kontynuuj mikroskopię poklatkową, aby zaobserwować translokację cytochromu c-GFP z mitochondriów do cytozolu (ryc. 2Aii-iii, 2B).
      Uwaga: Mitochondrialne uwalnianie cytochromu c do cytozolu jest markerem przepuszczalności mitochondrialnej błony zewnętrznej (MOMP)4, krytycznego etapu apoptozy zależnej od mitochondriów21,22
    4. Kiedy komórki wyświetlają sygnał cytochromu c-GFP w cytoplazmie, usuń bodziec śmierci komórki i zaopatrz komórki w świeżą pożywkę (patrz Protokół 2). Kontynuuj obrazowanie poklatkowe, aby śledzić los komórek za pomocą cytozolowego GFP.
      Uwaga: Komórki, które odwracają apoptozę, odzyskują normalną morfologię komórek i zmniejszają swój cytozolowy sygnał cytochromu c-GFP, prawdopodobnie poprzez degradację lub translokację z powrotem do mitochondriów (ryc. 2Aiv-vii, 2B).
    5. Przechwytywanie obrazów DIC równolegle w celu uzyskania dodatkowych informacji umożliwiających dostęp do etapów apoptozy poprzez obserwację zmian w morfologii komórek w pojedynczych komórkach lub grupie komórek (patrz Protokół 4.1 dla mikroskopii DIC).
  4. Wykrywanie aktywności kaspazy za pomocą biosensora kaspazy (patrz rysunek 3)
    1. Transfekcję komórek za pomocą biosensora kaspazy NES-DEVD-YFP-NLS przez 16 do 24 godzin przed poddaniem ich bodźcowi apoptotycznemu13.
    2. Wybarwić transfekowane kultury preparatem Hoechst 33342 w celu oznaczenia jąder komórkowych (patrz kroki 4.2.1 do 4.2.3 dla barwienia jądra żywej komórki).
    3. Wykonaj w czasie rzeczywistym mikroskopię konfokalną lub epifluorescencyjną żywych komórek, aby śledzić zdrowe komórki (szczegóły w Protokole 3 dla obrazowania żywych komórek).
      Uwaga: Sygnał biosensora NES-DEVD-YFP-NLS lokalizuje się przede wszystkim w cytozolu zdrowych komórek ze względu na jego jądrowy sygnał eksportowy (NES) (Rysunki 3A, 3Bi i 3C, patrz Dyskusja).
    4. Wyzwalają komórki do apoptozy (patrz Protokół 2 w celu zastosowania i usunięcia bodźców apoptotycznych do komórek). Kontynuuj mikroskopię poklatkową, aby obserwować translokację jądrową YFP.
      Uwaga: Aktywacja kaspaz rozszczepia motyw DEVD w biosensorze kaspazy NES-DEVD-YFP-NLS, powodując translokację YFP-NLS z cytozolu do jądra (ryc. 3A, 3Bii-iv, patrz Dyskusja).
    5. Kiedy komórki wykazują jądrowy YFP, usuń bodziec apoptotyczny i zaopatruj komórki w świeżą pożywkę (patrz Protokół 2).
      Uwaga: Komórki, które odwracają apoptozę, odzyskują normalną morfologię komórki, ale zachowują jądrowy sygnał YFP (ryc. 3Bv-x, komórki 1 i 2 oraz 3D).
    6. Kontynuuj obrazowanie poklatkowe, aby śledzić los komórek, które wykazują jądrowy YFP.
      Uwaga: Jądrowy sygnał YFP ulegnie degradacji kilka godzin po tym, jak komórki odwrócą apoptozę (ryc. 3B, vi-x, komórka 1, patrz wyniki i dyskusja), przypuszczalnie poprzez normalne mechanizmy usuwania komórek, takie jak degradacja proteasomu.
    7. Przechwytuj obrazy DIC równolegle, aby uzyskać dodatkowe informacje potrzebne do uzyskania dostępu do etapów apoptozy poprzez obserwację zmian w morfologii komórek w pojedynczych komórkach lub grupie komórek. (Patrz Protokół 4.1 dla mikroskopii DIC).
  5. Ekspozycja powierzchni komórki na fosfatydyloserynę (patrz rysunek 4)
    1. Komórki nasienne na szklanych szkiełkach nakrywkowych w celu osiągnięcia 80% zbieżności komórek (patrz Protokół 1).
    2. Wybarwić komórki za pomocą czerwono-fluorescencyjnego MitoTrackera i niebieskiego barwnika Hoechst 33342 odpowiednio dla mitochondriów i jąder (patrz kroki 4.2.1 do 4.2.3 dla barwienia mitochondrialnego i jądrowego żywych komórek).
    3. Wywołaj komórki do apoptozy za pomocą induktora apoptozy (patrz Protokół 2).
    4. Zastosować znakowaną fluorescencyjnie anektynę V (patrz materiały) do barwienia komórek apoptotycznych przez 10 minut w temperaturze 37 °C przed usunięciem induktora apoptozy, aby wykryć ekspozycję fosfatydyloseryny na powierzchni komórek apoptotycznych.
      Uwaga 1: Zdrowe komórki nie są barwione aneksyną V, ponieważ fosfatydyloseryna jest zwykle sekwestrowana na wewnętrznej płeczku błony komórkowej38. Komórki apoptotyczne są barwione anektyną V, która wiąże się z fosfatydyloseryną na powierzchni komórki (ryc. 4A i 4B).
      Uwaga 2: znakowana fluorescencyjnie aneksyna V może być również stosowana do barwienia komórek apoptotycznych natychmiast po usunięciu induktora apoptozy, po 10 minutach inkubacji.
    5. Usunąć bodziec śmierci komórki, umyć wybarwione komórki ciepłym PBS lub świeżą pożywką raz, a następnie dostarczyć komórkom świeżą pożywkę przez 2 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO 2 (patrz Protokół 2).
      Uwaga 1: Komórki, które odwróciły apoptozę, odzyskują normalną morfologię i zachowują znakowany fluorescencyjnie sygnał aneksyny V po odzyskaniu normalnej morfologii (ryc. 4A i 4B).
      Uwaga 2: Sygnał aneksyny V zmniejsza się z czasem na odzyskanych komórkach (patrz Dyskusja).
    6. Utrwalić komórki w wybranych punktach czasowych za pomocą 4% paraformaldehydu zawierającego 8% sacharozy w 1x PBS przez 20 minut w ciemności w temperaturze pokojowej i umyć utrwalone komórki PBS 3 razy, aby usunąć paraformaldehyd przed zamontowaniem komórek na szkiełkach nakrywkowych z mocowaniem zapobiegającym blaknięciu (patrz Materiały) do mikroskopii konfokalnej lub epifluorescencyjnej i obserwować aneksynę V na komórkach po usunięciu induktora apoptozy.
      Uwaga 1: Sacharoza w utrwalaczu zachowuje strukturę błony komórkowej podczas utrwalania.
      Uwaga 2: Przechowywać roztwór paraformaldehydu w ciemności w temperaturze 4°C, aby zapobiec degradacji.
      Uwaga 3: Podgrzej roztwór paraformaldehydu do temperatury pokojowej przed nałożeniem go na komórki w celu utrwalenia, aby uniknąć szoku zimna dla komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zbadać odwracalność apoptozy, komórki hodowli tkankowej są najpierw poddawane działaniu bodźca śmierci w celu wywołania apoptozy. Gdy komórki wykazują cechy charakterystyczne dla apoptozy, stosuje się świeżą pożywkę hodowlaną, aby wypłukać bodziec, a następnie inkubuje się obumierające komórki, aby umożliwić ich regenerację (Rysunek 1A). Kluczowym pytaniem badawczym jest tutaj to, jak daleko poszczególne obumierające komórki w hodowli mogą zaawansować w procesie apoptozy, by wciąż móc przejść anastaz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Anastaza odnosi się do zjawiska, w którym komórki, które aktywowały szlak śmierci komórki, następnie odwracają proces umierania i przeżywają. Tutaj wykazaliśmy, że obrazowanie żywych komórek może być wykorzystane do potwierdzenia, że te same pojedyncze komórki w rzeczywistości mogą odwrócić proces apoptotycznej śmierci komórki na późnym etapie, a następnie kontynuować przeżywanie i rozmnażanie. Nasze protokoły opisują kilka zoptymalizowanych warunków leczenia specyficznych dla typu komórki w celu wywołania apoptozy i umo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Wielebnemu Dr. Ralphowi Bohlmannowi i Wielebnemu Dr. Jamesowi Voelzowi za zasugerowanie słowa "anastasis" do opisania odwrócenia apoptozy; Douglas R. Green dla komórek HeLa stabilnie eksprymujących cytochrom c-GFP; Charlesa M. Rudina i Erica E. Gardnera za komórki H446; Heather Lamb za pomoc w rysowaniu kreskówek w filmie; Yee Hui Yeo za cenne omówienie tego manuskryptu. Praca ta była wspierana przez stypendium Sir Edward Youde Memorial Fellowship (H.L.T.), Dr. Walter Szeto Memorial Scholarship (H.L.T.), stypendium Fulbrighta 007-2009 (H.L.T.), stypendium Fundacji Badań nad Naukami Przyrodniczymi (H.L.T.), granty NIH NS037402 (J.M.H.) i NS083373 (J.M.H.) oraz University Grants Committee of the Hong Kong AoE/B-07/99 (M.C.F.). Ho Lam Tang jest stypendystką Fundacji Nauk Przyrodniczych (Life Sciences Research Foundation) i Kay Curci.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroskopia konfokalna LSM780Carl Zeiss
ze szklanym dnemMatTek CorporationP35G-0-14-C
Przezroczyste CultFoiCarl Zeiss000000-1116-084
CO2 niezależne mediumLife Technologies18045-088
CellTrackerLife TechnologiesC34552
Mitotracker Czerwony CMXRosLife TechnologiesM-7512
Hoechst 33342Life TechnologiesH1399
Fluorescencyjnie oznakowany aneksyn VBiovisionK201
Naczynie do hodowli

Bibliografia

  1. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239-257 (1972).
  2. Riedl, S. J., Shi, Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 897-907 (2004).
  3. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
  4. Chipuk, J. E., Bouchier-Hayes, L., Green, D. R. Mitochondrial outer membrane permeabilization during apoptosis: the innocent bystander scenario. Cell Death and Differentiation. 13, 1396-1402 (2006).
  5. Kroemer, G., et al. Classification of cell death recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009. Cell Death and Differentiation. 16, 3-11 (2009).
  6. Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death and Differentiation. 19, 107-120 (2012).
  7. Holland, A. J., Cleveland, D. W. Chromoanagenesis and cancer: mechanisms and consequences of localized, complex chromosomal rearrangements. Nature Medicine. 18, 1630-1638 (2012).
  8. Reddien, P. W., Cameron, S., Horvitz, H. R. Phagocytosis promotes programmed cell death in C. elegans. Nature. 412, (2001).
  9. Hoeppner, D. J., Hengartner, M. O., Schnabel, R. Engulfment genes cooperate with ced-3 to promote cell death in Caenorhabditis elegans. Nature. 412, 202-206 (2001).
  10. Segawa, K., et al. Caspase-mediated cleavage of phospholipid flippase for apoptotic phosphatidylserine exposure. Science. 344, 1164-1168 (2014).
  11. Overholtzer, M., et al. A nonapoptotic cell death process, entosis, that occurs by cell-in-cell invasion. Cell. 131, 966-979 (2007).
  12. Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. British Journal of Cancer. 100, (2009).
  13. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Molecular Biology of the Cell. 23, 2240-2252 (2012).
  14. Hammill, A. K., Uhr, J. W., Scheuermann, R. H. Annexin V staining due to loss of membrane asymmetry can be reversible and precede commitment to apoptotic death. Experimental Cell Research. 251, (1999).
  15. Geske, F. J., Lieberman, R., Strange, R., Gerschenson, L. E. Early stages of p53-induced apoptosis are reversible. Cell Death and Differentiation. 8, 182-191 (2001).
  16. Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. Programmed cell death in animal development. Cell. 88, 347-354 (1997).
  17. Hardwick, J. M., Cheng, W. C. Mitochondrial programmed cell death pathways in yeast. Developmental Cell. 7, 630-632 (2004).
  18. Frohlich, K. U., Fussi, H., Ruckenstuhl, C. Yeast apoptosis-from genes to pathways. Seminars in Cancer Biology. 17, 112-121 (2007).
  19. Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147, 742-758 (2011).
  20. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 231-241 (2008).
  21. Wang, X. The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes & Development. 15, 2922-2933 (2001).
  22. Galluzzi, L., Kepp, O., Kroemer, G. Mitochondria: master regulators of danger signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 13, 780-788 (2012).
  23. Goldstein, J. C., Waterhouse, N. J., Juin, P., Evan, G. I., Green, D. R. The coordinate release of cytochrome c during apoptosis is rapid, complete and kinetically invariant. Nature Cell Biology. 2, 156-162 (2000).
  24. Goldstein, J. C., et al. Cytochrome c is released in a single step during apoptosis. Cell Death and Differentiation. 12, 453-462 (2005).
  25. Tyas, L., Brophy, V. A., Pope, A., Rivett, A. J., Tavare, J. M. Rapid caspase-3 activation during apoptosis revealed using fluorescence-resonance energy transfer. EMBO Reports. 1, 266-270 (2000).
  26. Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. The Journal of Cell Biology. 160, 235-243 (2003).
  27. Albeck, J. G., et al. Quantitative analysis of pathways controlling extrinsic apoptosis in single cells. Molecular Cell. 30, 11-25 (2008).
  28. Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death and Differentiation. 14, 641-650 (2007).
  29. Liu, X., Zou, H., Slaughter, C., Wang, X. DFF, a heterodimeric protein that functions downstream of caspase-3 to trigger DNA fragmentation during apoptosis. Cell. 89, 175-184 (1997).
  30. Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391, 43-50 (1998).
  31. Li, H., Zhu, H., Xu, C. J., Yuan, J. Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis. Cell. 94, 491-501 (1998).
  32. Slee, E. A., Keogh, S. A., Martin, S. J. Cleavage of BID during cytotoxic drug and UV radiation-induced apoptosis occurs downstream of the point of Bcl-2 action and is catalysed by caspase-3: a potential feedback loop for amplification of apoptosis-associated mitochondrial cytochrome c release. Cell Death and Differentiation. 7, 556-565 (2000).
  33. Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341, 403-406 (2013).
  34. Kroemer, G., Martin, S. J. Caspase-independent cell death. Nature Medicine. 11, 725-730 (2005).
  35. Chipuk, J. E., Green, D. R. Do inducers of apoptosis trigger caspase-independent cell death. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 6, 268-275 (2005).
  36. Tait, S. W., Green, D. R. Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 621-632 (2010).
  37. Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 2979-2984 (1998).
  38. Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R., Yan, G. Early detection of apoptosis using a fluorescent conjugate of annexin V. BioTechniques. 23, 525-531 (1997).
  39. Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).
  40. Fenech, M., et al. Molecular mechanisms of micronucleus, nucleoplasmic bridge and nuclear bud formation in mammalian and human cells. Mutagenesis. 26, 125-132 (2011).
  41. Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. Causes and consequences of aneuploidy in cancer. Nature Reviews Genetics. 13, (2012).
  42. Poreba, M., Strozyk, A., Salvesen, G. S., Drag, M. Caspase substrates and inhibitors. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a008680(2013).
  43. Talanian, R. V., et al. Substrate specificities of caspase family proteases. The Journal of Biological Chemistry. 272, 9677-9682 (1997).
  44. Logue, S. E., Elgendy, M., Martin, S. J. Expression, purification and use of recombinant annexin V for the detection of apoptotic cells. Nature Protocols. 4, 1383-1395 (2009).
  45. Kenis, H., et al. Annexin A5 uptake in ischemic myocardium: demonstration of reversible phosphatidylserine externalization and feasibility of radionuclide imaging. Journal of Nuclear Medicine. 51, 259-267 (2010).
  46. Ruegg, U. T., Staurosporine Burgess, G. M. K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases. Trends in Pharmacological Sciences. 10, 218-220 (1989).
  47. Bertrand, R., Solary, E., O'Connor, P., Kohn, K. W., Pommier, Y. Induction of a common pathway of apoptosis by staurosporine. Experimental Cell Research. 211, 314-321 (1994).
  48. Chae, H. J., et al. Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts. Pharmacological Research. 42, 373-381 (2000).
  49. Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13367-13372 (2007).
  50. Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13901-13905 (2008).
  51. Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. The Journal of Cell Biology. 196, 513-527 (2012).
  52. Chihara, T., et al. Caspase inhibition in select olfactory neurons restores innate attraction behavior in aged Drosophila. PLoS Genetics. 10, e1004437(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Odwracanie apoptozymikroskopia żywych komórekbiosensor kaspazybarwienie mitochondriówbarwienie jąder komórkowychobrazowanie time-lapsebodziec śmierci komórkowejregeneracja morfologicznauwalnianie cytochromu C
Strategie śledzenia anastazy, zjawiska przeżycia komórek, które odwraca apoptozę
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.