Artykuł metodologiczny

Od szybkiego obrazowania fluorescencyjnego do prawa dyfuzji molekularnej na żywych błonach komórkowych w komercyjnym mikroskopie

DOI:

10.3791/51994

⸱

9 października 2014

 ,  ,  , 
1NEST Laboratory, Scuola Normale Superiore, 2Center for Nanotechnology Innovation, Instituto Italiano di Tecnologia, 3Laboratory for Fluorescence Dynamics, Department of Biomedical Engineering, University of California, Irvine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przestrzenny rozkład i czasowa dynamika białek błony komórkowej i lipidów to gorący temat w biologii. W tym przypadku problem ten został rozwiązany za pomocą czasoprzestrzennej analizy fluktuacji obrazu, która zapewnia koncepcyjnie te same fizyczne wielkości śledzenia pojedynczych cząstek, ale wykorzystuje małe znaczniki molekularne i standardowe konfiguracje mikroskopowe.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Staje się coraz bardziej oczywiste, że rozkład przestrzenny i ruch składników błony, takich jak lipidy i białka, są kluczowymi czynnikami w regulacji wielu funkcji komórkowych. Jednak ze względu na szybką dynamikę i zaangażowane w nią maleńkie struktury, wymagana jest bardzo wysoka rozdzielczość czasoprzestrzenna, aby uchwycić rzeczywiste zachowanie molekuł. W tym miejscu przedstawiamy eksperymentalny protokół badania dynamiki znakowanych fluorescencyjnie białek błony plazmatycznej i lipidów w żywych komórkach z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną. Warto zauważyć, że to podejście nie musi śledzić każdej cząsteczki, ale oblicza zachowanie populacji przy użyciu wszystkich cząsteczek w danym regionie błony. Punktem wyjścia jest szybkie zobrazowanie danego obszaru na membranie. Następnie obliczana jest pełna funkcja autokorelacji czasoprzestrzennej, korelująca pozyskane obrazy z rosnącymi opóźnieniami czasowymi, na przykład co 2, 3, n powtórzeń. Możliwe jest wykazanie, że szerokość piku funkcji autokorelacji przestrzennej zwiększa się wraz ze wzrostem opóźnienia czasowego w funkcji ruchu cząstek spowodowanego dyfuzją. W związku z tym dopasowanie szeregu funkcji autokorelacji umożliwia wyodrębnienie rzeczywistego średniego kwadratu przemieszczenia białka z obrazowania (iMSD), tutaj przedstawionego w postaci dyfuzyjności pozornej w funkcji przemieszczenia średniego. W ten sposób uzyskuje się ilościowy wgląd w średnią dynamikę pojedynczych cząsteczek z dokładnością nanometrową. Stosując wariant receptora transferyny (TfR) znakowany GFP i znakowaną ATTO488 1-palmitoilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminą (PPE) można zaobserwować czasoprzestrzenną regulację dyfuzji białek i lipidów w regionach błony o wielkości μm w zakresie czasu od mikro do milisekundy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wychodząc od oryginalnego modelu „mozaiki płynnej” opracowanego przez Singera i Nicolsona, obraz błony plazmatycznej komórki był stale aktualizowany w ciągu ostatnich dziesięcioleci, aby uwzględnić nowo odkrytą rolę cytoszkieletu oraz domen lipidowych1,2.

Pierwsze obserwacje uzyskano za pomocą techniki fluorescencyjnego odzyskiwania po fotoblaknięciu (FRAP), która ujawniła, że znaczna frakcja białek błonowych jest nieruchoma3-5. Badania pionierskie te, choć bardzo informacyjne, cechowały się stosunkowo niską rozdzielczością przestrzenną (mikrony) i czasową (sekundy) układów FRAP. Ponadto, jako metoda pomiaru uśredniającego zespół cząsteczek, FRAP nie dostarcza informacji na temat zachowania pojedynczych cząsteczek.

W tym kontekście bardzo skuteczne okazało się zastosowanie możliwości specyficznego znakowania pojedynczej cząsteczki bardzo jasnymi znacznikami (co pozwala na badanie procesu dyfuzji jedna cząsteczka po drugiej). W szczególności, poprzez zwiększenie rozdzielczości czasowej podejścia Single Particle Tracking (SPT) do skali mikrosekundowej, Kusumi, et al. uzyskali dostęp do nieznanych wcześniej cech dynamiki lipidów i białek, co w znacznym stopniu przyczyniło się do uznania roli szkieletu błonowego opartego na aktynie w fizjologii błon6,7. Odkrycia te doprowadziły do stworzenia tzw. modelu „płotów i palisad” (picket and fence), w którym dyfuzja lipidów i białek jest regulowana przez szkielet oparty na aktynie. Jednakże, aby móc w pełni wykorzystać ogromną ilość informacji dostarczanych przez SPT, należy rozwiązać wiele problemów eksperymentalnych. W szczególności procedura znakowania składa się zazwyczaj z wielu etapów, takich jak produkcja, oczyszczanie i wprowadzanie znakowanych gatunków do systemu. Co więcej, aby osiągnąć skalę czasową poniżej milisekundy, często wymagane są duże znaczniki, takie jak kropki kwantowe lub nanocząsteczki metali, a w wielu przypadkach nie można uniknąć sieciowania cząsteczek docelowych przez znacznik. Na koniec, aby spełnić kryteria statystyczne, należy zarejestrować wiele trajektorii, co jednocześnie wymaga zastosowania niskiego zagęszczenia znacznika, aby umożliwić śledzenie.

W porównaniu z SPT, spektroskopia korelacyjna fluorescencji (FCS), eliminując wiele z tych wad, stanowi bardzo obiecujące podejście do badania dynamiki molekularnej. W rzeczywistości FCS sprawdza się również w przypadku słabych i gęstych znaczników, umożliwiając badanie dynamiki molekuł znakowanych białkami fluorescencyjnymi w komórkach przejściowo transfekowanych. Pozwala ona również na uzyskanie wysokiej statystyki w ograniczonym czasie. Wreszcie, pomimo „wysokiej” gęstości znaczników, FCS dostarcza informacji o pojedynczych cząsteczkach. Dzięki wszystkim tym właściwościom FCS stanowi bardzo bezpośrednie podejście i była szeroko stosowana do badania dynamiki lipidów i białek zarówno w membranach modelowych, jak i w żywych komórkach8-10. Zaproponowano wiele różnych podejść w celu zwiększenia zdolności FCS do ujawniania szczegółów dyfuzji molekularnej. Na przykład wykazano, że przeprowadzając FCS na obszarach obserwacji o różnych rozmiarach, można zdefiniować „prawo dyfuzji FCS”, ujawniające ukryte cechy ruchu molekularnego11,12. Oprócz zmiany rozmiaru, obszar ogniskowania był również powielany13, przesuwany w przestrzeni wzdłuż linii14-20 lub łączony z szybkimi kamerami21,22. Wykorzystując te „spatially-temporal” podejścia korelacyjne, ilościowo opisano istotne parametry biologiczne kilku komponentów błonowych zarówno w membranach modelowych, jak i rzeczywistych błonach biologicznych, co pozwoliło na uzyskanie wglądu w przestrzenną organizację błony.

Jednakże we wszystkich opisanych do tej pory zastosowaniach FRAP i FCS rozmiar obszaru ogniskowania stanowi limit rozdzielczości przestrzennej, którego nie można przekroczyć. W celu obejścia tego ograniczenia opracowano niedawno kilka metod obrazowania w superrozdzielczości. Niektóre z nich opierają się na precyzji lokalizacji, takie jak stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (STORM)23,24, mikroskopia lokalizacji z fotoaktywacją (PALM)25, fluorescencyjna mikroskopia PALM (FPALM)26 oraz mikroskopia PALM z śledzeniem pojedynczych cząsteczek (sptPALM)27: jednak stosunkowo duża liczba fotonów wymagana przy każdym ujęciu ogranicza rozdzielczość czasową tych metod do co najmniej kilku milisekund, co utrudnia ich zastosowanie in vivo.

Z drugiej strony, obiecującą alternatywę dla obrazowania w superrozdzielczości otworzyło przestrzenne modulowanie emisji fluorescencji za pomocą metod deplecji emisji stymulowanej (STED lub odwracalnych nasycalnych przejść fluorescencji optycznej (RESOLFT))28,29. Podejścia te łączą kształtowanie objętości obserwacji znacznie poniżej granicy dyfrakcyjnej z możliwością wykorzystania szybkich mikroskopów skanujących i systemów detekcji. W połączeniu z analizą fluktuacji fluorescencji, mikroskopia STED pozwoliła na bezpośrednie badanie nanoskalowej dynamiki czasowo-przestrzennej lipidów i białek w błonach żywych komórek30,31.

Te same wielkości fizyczne w mikroskopii opartej na technice STED można uzyskać za pomocą zmodyfikowanej spektroskopii korelacyjnej obrazów w przestrzeni i czasie (STICS)32,33metoda ta nadaje się do badania dynamiki białek błonowych i/lub lipidów znakowanych fluorescencyjnie w żywych komórkach przy użyciu komercyjnego mikroskopu. Przedstawiony tutaj protokół eksperymentalny składa się z kilku kroków. Pierwszy z nich wymaga szybkiego obrazowania obszaru zainteresowania na błonie. Następnie wynikający z tego stos obrazów jest wykorzystywany do obliczenia średnich funkcji korelacji czasowo-przestrzennych. Poprzez dopasowanie serii funkcji korelacji, „prawo dyfuzji” cząsteczek można uzyskać bezpośrednio z obrazowania w formie pozornej dyfuzyjności (Daplikacja)-kontra-wykres średniego przemieszczenia. Wykres ten w krytyczny sposób zależy od środowiska badanego przez cząsteczki i pozwala na bezpośrednie rozpoznanie rzeczywistych trybów dyfuzji analizowanego lipidu lub białka.

Szczegółowo, jak wykazano wcześniej34, czasowo-przestrzenna funkcja autokorelacji pozyskanej serii obrazów zależy w sposób krytyczny od dynamiki cząsteczek poruszających się w analizowanej serii obrazów (należy zauważyć, że to samo rozumowanie można zastosować w przypadku akwizycji liniowej, gdzie uwzględnia się tylko jeden wymiar przestrzenny). W szczególności definiujemy funkcję korelacji jako:

Równanie funkcji korelacji czasowo-przestrzennej, metoda analizy statystycznej, korelacja intensywności.(1)

gdzie Wzór funkcji intensywności I(x,y,t), analiza przestrzenno-czasowa, schemat, badania naukowe. oznacza zmierzoną intensywność fluorescencji w pozycji x, y i w czasie t, Schemat równowagi statycznej, ΣFx=0, ΣFy=0; ilustracja wektorowego bilansu sił, treść edukacyjna. oraz Schemat chromatografii; proces rozdziału DNA; obejmuje system chromatograficzny do analizy. oznaczają odpowiednio odległość w kierunkach x oraz y, Symbol tau, używany w równaniach i wzorach, istotny w badaniach z zakresu fizyki i inżynierii. oznacza opóźnienie czasowe, a Symbol notacji bra-ket; obliczenia mechaniki kwantowej; koncepcja równowagi statycznej. oznacza średnią. Funkcję tę można zapisać jako:

Równanie procesu splotu G(ξ,χ,τ), reprezentacja symboliczna.(2)

gdzie „N” oznacza średnią liczbę cząsteczek w obszarze obserwacji, Schemat równania równowagi statycznej ΣFx=0; badanie z fizyki; analiza równowagi; koncepcja edukacyjna. reprezentuje operację splotu w przestrzeni, a Równanie funkcji matematycznej, W(ξ,χ), stosowane w analizie statystycznej lub modelowaniu matematycznym. reprezentuje autokorelację pasma instrumentalnego. To ostatnie można interpretować jako miarę rozproszenia w przestrzeni fotonów pojedynczego emitera wynikającego z układu optycznego/rejestrującego (tzw. funkcja rozmycia punktu, PSF, zazwyczaj dobrze przybliżana funkcją Gaussa). Wreszcie, Równanie rozkładu prawdopodobieństwa p(ξ, χ, τ), analiza statystyczna, reprezentacja wzoru. reprezentuje prawdopodobieństwo znalezienia cząsteczki w odległości Schemat równowagi statycznej, ΣFx=0, ΣFy=0; ilustracja wektorowej równowagi sił, treść edukacyjna. i Schemat chromatografii; proces separacji DNA; obejmuje system chromatograficzny do analizy. po opóźnieniu czasowym Symbol tau, stosowany w równaniach i wzorach, istotny w badaniach z fizyki i inżynierii.. Jeśli rozważymy dynamikę dyfuzyjną, w której cząsteczki poruszają się losowo we wszystkich kierunkach i nie występują strumienie wypadkowe, funkcja ta jest również dobrze przybliżana funkcją Gaussa, w której wariancję można utożsamiać ze średnim kwadratem przemieszczenia (MSD) poruszającej się cząsteczki. Zatem szerokość funkcji korelacji (oznaczana również jako Równanie symbolu wariancji \( \sigma^2(\tau) \); metoda analizy statystycznej; zwięzły opis alt) może być zdefiniowana jako suma MSD cząsteczek i pasma instrumentalnego i może być mierzona poprzez dopasowanie funkcji Gaussa do funkcji korelacji dla każdego opóźnienia czasowego. Zmierzone iMSD może zostać wykorzystane do obliczenia pozornej dyfuzyjności poruszających się cząsteczek Wzór na współczynnik dyfuzji \((D_{app}(\tau))\); schemat do badań z chemii analitycznej. oraz średniego przemieszczenia Wzór matematyczny R(τ) wskazujący zależną od czasu funkcję odpowiedzi. w następujący sposób:

Równanie współczynnika dyfuzji, formuła D_app(τ), symbol, analiza naukowa, zastosowanie edukacyjne.(3)

Równanie metody pomiaru opartej na wariancji, R(τ)=√[σ²(τ)-σ²(0)]; analiza statystyczna.(4)

Kilka uwag dotyczących zastosowanego układu eksperymentalnego może być pomocne dla czytelnika w kolejnych sekcjach. Aby selektywnie wzbudzić fluorofory na błonie podstawnej żywych komórek, zastosujemy oświetlenie całkowitego wewnętrznego odbicia (TIR), używając komercyjnego mikroskopu fluorescencyjnego TIR (TIRF) (szczegóły znajdują się w sekcji materiałów). Ponadto, w celu detekcji fluorescencji wykorzystamy obiektyw o dużym powiększeniu (100X NA 1.47, wysoka apertura numeryczna jest niezbędna do oświetlenia TIRF) oraz kamerę EMCCD (fizyczna wielkość piksela na matrycy 16 μm). Aby osiągnąć wielkość piksela wynoszącą 100 nm, stosujemy dodatkową soczewkę powiększającą 1.6X. Jak omówiono poniżej, rozdzielczość czasowa poniżej 1 msec byłaby wymagana do prawidłowego opisania dynamiki szybkich lipidów błonowych poniżej 100 nm. Aby osiągnąć taką rozdzielczość czasową, musimy wybrać obszar zainteresowania (ROI) mniejszy niż cała matryca kamery (512 x 512). W ten sposób kamera odczyta mniejszą liczbę linii, co zwiększy rozdzielczość czasową. Jednak w tym trybie odczytu czas klatki byłby ograniczony przez czas wymagany do przesunięcia ładunków z obszaru ekspozycji do układu odczytu w kamerze i zazwyczaj wynosi on rzędu milisekund dla EMCCD 512 x 512 pikseli. Aby przekroczyć to ograniczenie, nowa technologia umożliwia przesuwanie tylko linii ROI zamiast całej klatki, co prowadzi do praktycznej efektywnej redukcji rozmiaru naświetlanej matrycy (nazwane w naszej kamerze EMCCD trybem Cropped Sensor Mode). Aby ta konfiguracja była skuteczna, obszar matrycy poza ROI musi być zasłonięty za pomocą kilku szczelin zamontowanych w torze optycznym. Dzięki temu układowi można osiągnąć rozdzielczość czasową rzędu 10-4 sekund. Należy jednak zauważyć, że podejście to może być łączone z wieloma różnymi układami eksperymentalnymi, co wyjaśniono w sekcji „dyskusja”.

Demonstracja metody zostanie przeprowadzona na żywych komórkach, z wykorzystaniem zarówno 1-palmitylo-2-hydroksy-sn-glycero-3-fosfoetanolaminy znakowanej ATTO488 (ATTO488-PPE), jak i wariantu receptora transferyny znakowanego GFP (GFP-TfR). W przypadku ATTO488-PPE podejście to pozwala na uzyskanie niemal stałej wartości Dapp w funkcji średniego przesunięcia, co wskazuje na dyfuzję w przeważającej mierze swobodną, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami30,35. W przeciwieństwie do tego, TfR-GFP wykazuje malejącą wartość Dapp w funkcji średniego przesunięcia, co sugeruje dyfuzję częściowo ograniczoną6. Ponadto, w tym drugim przypadku możliwe jest określenie ilościowe lokalnej stałej dyfuzji oraz średniego obszaru ograniczenia na wielu mikronach w płaszczyźnie błony.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Kalibracja systemu

  1. Kalibracja funkcji rozproszenia punktowego (PSF)
    1. Rozcieńczyć 10 μl roztworu kulek fluorescencyjnych o długości fali 30 nm (około 5 μM) w 90 μl wody destylowanej, a następnie sonikować roztwór przez 20 minut. Wyciąć kwadratowy (1 cm x 1 cm) kawałek żelu agarozowego (3%) i nanieść 10 μl roztworu na wierzch żelu. Odwróć kawałek żelu na dolnej szklance 2-centymetrowej szalki Petriego i wyciśnij kroplę na szklankę.
    2. Włącz konfigurację akwizycji, umieść próbkę w uchwycie, ustaw ekspozycję kamery i EMgain (100 ms i 1,000 to dobre parametry, ale optymalizuj zgodnie z systemem) i poczekaj, aż kamera ostygnie.
    3. Ustaw ekspozycję aparatu na 100 ms, EMgain aparatu na 1,000, tryb akwizycji na transfer klatek, 100 powtórzeń i ustawienie automatycznego zapisywania.
    4. Za pomocą okularu i światła przechodzącego skup się na granicy żelu, a następnie przesuń obiektyw na środek żelu, wyreguluj ostrość i rozpocznij procedurę ustawiania lasera (w LAS AF wybierz "Konfiguracja TIRF" i postępuj zgodnie z procedurą automatycznego wyrównywania).
    5. Znajdź pole widzenia z izolowanymi pojedynczymi punktami, dokładnie skoncentruj się na jaśniejszym punkcie (który zwykle reprezentuje agregację koralików) jako odniesienie, uzyskaj 100 klatek i powtórz krok 5-6 razy, aby uzyskać kilka pojedynczych punktów.
    6. Zaimportuj pozyskane serie do programu do przetwarzania danych i uśrednij stos w czasie (Rysunek 1A) i wybierz pojedynczy izolowany ścieg. Zwróć uwagę, aby wybrać najmniejsze, aby uniknąć agregatów cząstek.
    7. Dopasuj wybrany rozkład intensywności (przykład profilu pojedynczego ściegu przedstawiono na rysunku 1B) za pomocą funkcji Gaussa za pomocą polecenia "gaussfit" (w narzędziach ICS-Matlab w Materiałach w Matlabie). Sprawdź dobroć pasowania, sprawdzając uzyskane reszty (przykład dopasowanego profilu Gaussa z odpowiadającymi mu resztkami przedstawiono na rysunku 1B).
  2. Kalibracja kamery
    1. Włącz aparat i poczekaj, aż aparat ostygnie. Ustawiamy ustawienia akwizycji kamery, (tzn. dla używanej kamery ustawiamy ekspozycję na 0,5 ms, EMgain kamery na 1,000, tryb akwizycji na tryb przycięty, rozmiar ROI na 32 x 128, 10,000 powtórzeń) i rozpoczynamy akwizycję sygnału tła kamery.
    2. Importowanie pozyskanych serii ramek do programu do przetwarzania danych. Oblicz i sprawdź średnią intensywność w każdym pikselu, aby sprawdzić, czy tło kamery jest w przybliżeniu płaskie w wybranym obszarze chipa. W trybie kadrowania usuń kilka pierwszych i ostatnich linii poziomych (od 3 do 10 w zależności od rozmiaru ROI) dla każdej klatki, ponieważ tło kamery jest zwykle stronnicze w liniach obramowania.
    3. Utwórz histogram wartości (zdefiniowanych również na poziomie cyfrowym, DL) w stosie pozyskanych obrazów (za pomocą polecenia "hist" w Matlabie) i wykreśl logarytm wynikowej częstotliwości (za pomocą polecenia semilogy w Matlabie). Przykładowy rozkład DL dla tła kamery przedstawiono na rysunku 2.
      UWAGA: Jeśli kamera działa prawidłowo, wykres pokaże w przybliżeniu pik Gaussa (profil paraboliczny w skali logarytmicznej) reprezentujący rozkład wartości związanych z fotonem zerowym, po którym następuje rozpad wykładniczy (linia o ujemnym nachyleniu w skali logarytmicznej), która reprezentuje rozkład wartości związanych z 1 fotonem (Rysunek 2). W szczególności środek i wariancja funkcji Gaussa reprezentują odpowiednio przesunięcie i błąd kamery, podczas gdy stała zaniku części wykładniczej reprezentuje oszacowanie DL przypisanego przez kamerę do każdego pojedynczego fotonu. W Matlabie skorzystaj z sekcji "CalibrateCamera" skryptu w materiałach pomocniczych.
    4. Powtórz operację dla wszystkich wybranych opcji EMGain i Gain (Wzmocnienie) kamery.

2. Przygotowanie komórek oznaczonych

  1. W celu przygotowania liposomów wymaganych do włączenia lipidów 36 należy rozpuścić oddzielnie 1 mg DOPE (1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminy), 1 mg DOTAP (1,2-dioleoilo-3-trimetyloamoniowo-propan) i 1 mg PPE-ATTO488 w 1 ml chloroformu. Zmieszać ze sobą 0,5 ml roztworu DOPE, 0,5 ml roztworu DOTAP i 25 μl roztworu PPE-ATTO488 i suszyć w próżni przez 24 godziny. Dodać 0,5 ml buforu HEPES 20 mM, wirować przez 15 minut i sonikować przez 15 minut w temperaturze 40 °C.
  2. Aby przygotować komórkę, przemyć 3 razy PBS naczynie p100 z konfluentnym CHO-K1 (jajnik chomika chińskiego), dodać 1 ml trypsyny i przechowywać w inkubatorze przez 5 minut. Zawiesić oderwane komórki, dodając 9 ml pożywki DMEM/F12 uzupełnionej 10% FBS i zasiać 150 μl roztworu komórkowego na szalce Petriego zawierającej 800 μl tej samej pożywki.
  3. Przechowywać w inkubatorze przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . W celu włączenia lipidów zastąp pożywkę komórkową 500 μl pożywki wolnej od surowicy; po 30 minutach dodać 2 μl roztworu liposomów; po 15 minutach przemyć PSB i dodać nową pożywkę DMEM/F12 do obrazowania.
  4. W celu transfekcji należy przetransfekować komórki zgodnie z protokołem lipofekcaminy (instrukcje producenta) przy użyciu plazmidu TfR-GFP i przechowywać 24 godziny w inkubatorze przed obrazowaniem.

3. Akwizycja danych

  1. Przygotowanie do konfiguracji
    1. W celu termostatowania mikroskopu, na 24 godziny przed eksperymentem włącz inkubator.
    2. Aby zastosować jak najszybszy osiągalny czas akwizycji, pracuj w trybie przyciętego czujnika (patrz wprowadzenie) i użyj pierwszej kamery do obrazowania (kamera 1) i drugiej kamery do wybrania komórki (kamera 2). Schemat konfiguracji przedstawiono na rysunku uzupełniającym S1. Następnie, aby wyrównać dwie kamery, włącz mikroskop i poczekaj, aż kamery ostygną.
    3. Ustaw w obu kamerach parametry obrazowania w świetle przechodzącym (tj. 20 ms dla czasu ekspozycji, 1 dla wzmocnienia EM) i przełącz mikroskop w tryb jasnego pola.
    4. Umieść próbki w uchwycie i ustaw ostrość za pomocą okularu, wyślij światło do kamery 1 i delikatnie popchnij szczeliny, pozwalając na światło tylko na ROI używany do obrazowania komórek (tutaj ROI 32 x 32 piksele).
    5. Przesuń komórkę w wybranym regionie i wyślij światło do kamery 2, a następnie narysuj ROI w oprogramowaniu sterującym kamerą 2, aby mieć odniesienie.
  2. Obrazowanie (ryc. 3A)
    1. Przede wszystkim ustaw laser TIRF zgodnie z procedurą konfiguracji. W naszej konfiguracji wybierz "Konfiguracja TIRF" i rozpocznij procedurę automatycznego wyrównywania. Gdy laser jest ustawiony, ustaw głębokość penetracji 70 nm (około 70°).
    2. Ustaw czas ekspozycji na 70 ms, a EMGain na 100 zarówno w kamerze 1, jak i w kamerze 2; następnie wybierz komórkę za pomocą kamery 1, a następnie wyślij światło na kamerę 2 i dokładnie ustaw ostrość błony komórkowej. Ustaw minimalną ekspozycję w aparacie 2, 1,000 EMGain, tryb przyciętej matrycy, 105 powtórzeń i ustaw automatyczne zapisywanie jako dopasowania plików (Flexible Image Transport System, format, którym można łatwo zarządzać).
    3. Rozpocznij akwizycję, aby nagrać serię obrazów. Zwolnij wzmocnienie i tryb przycięcia, aby umożliwić stabilizację temperatury przed uzyskaniem nowego ogniwa, a następnie powtórz dwa ostatnie kroki, aby uzyskać 8-10 komórek.

4. Obliczanie średniego kwadratu przemieszczenia z obrazowania (iMSD)

UWAGA: Następujący protokół może być bezpośrednio zastosowany do surowych danych. Jednocześnie cały protokół jest ważny dla akwizycji danych symulowanych zarówno w Matlabie, jak i w SimFCS. Link do odpowiednich samouczków można znaleźć w sekcji "Materiały".

  1. Obliczenia przez Matlab
    1. Zaimportuj pozyskane serie do Matlaba za pomocą skryptu ImportImageSeries. Oblicz średnią intensywność każdego obrazu w czasie za pomocą polecenia średnia dla pierwszych 2 wymiarów i użyj wykresu, aby zobaczyć wynikowy wektor.
    2. Jeśli obecnych jest więcej niż 10% fotowybielania, wyrzuć serię lub usuń pierwszą ich część. Jeśli jest niższa, spróbuj skorygować wpływ na funkcję korelacji, odejmując od każdego obrazu jej średnią intensywność, jak pokazano wcześniej37.
    3. Oblicz średnią intensywność każdego piksela, używając średniej dla trzeciego wymiaru i zobacz wynikowy obraz.
      UWAGA: Szczególną uwagę należy zwrócić w celu uniknięcia sztucznych korelacji. W rzeczywistości, jak wykazano wcześniej dla podobnych technik38, granice komórek, a także nieostre pęcherzyki mogą wprowadzać silną korelację. Jeśli inspekcja przeciętnego obrazu ujawni granice komórek lub nieostre pęcherzyki, spróbuj wykluczyć zaangażowany obszar, w przeciwnym razie odrzuć akwizycję. Aby skorygować efekt tego nieruchomego struktury, odejmij średnią intensywność czasową od każdego piksela39.
    4. Oblicz korelację czasoprzestrzenną (G(ξ,χ,τ)) za pomocą funkcji CalculateSTICScorrfunc. Usuń G(ξ,χ,0), ponieważ korelacja wynikająca z szumu strzału w trybie słabego oświetlenia dominuje G(0,0,0); korelacja wynikająca z detektora dominuje G(±1,0,0), a ruch cząstek w czasie ekspozycji może zdeformować G(ξ,χ,τ) dla τ=0 poprzez zwiększenie mierzonej talii (efekt ten znika dla τ>0)34.
    5. Średnia G(ξ,χ,τ>0) przy użyciu logarytmicznego przedziału czasowego w celu zmniejszenia szumu za pomocą funkcji "LogBinStack" w materiale nośnym, a następnie dopasuj wynikowe G(ξ,χ,τ) za pomocą funkcji "gaussfit" narzędzi ICS-Matlab w Materiałach, aby odzyskać iMSD (druga kolumna wynikowej tablicy).
    6. Wykreślić otrzymaną wartość talii σ(τ)2 (iMSD) w funkcji czasu. Jeśli dane są zbyt zaszumione, spróbuj zwiększyć liczbę pozyskanych klatek, zwiększ moc lasera, uśrednij razem więcej G(ξ,χ,τ).
  2. Obliczenia za pomocą SimFCS
    1. Otwórz pozyskane pliki za pomocą ImageJ za pomocą wtyczki importera BioFormat i zapisz nabyte serie jako sekwencję Tiff.
    2. Otwórz SimFCS i wybierz narzędzie RICS, a następnie wybierz Plik>Importuj wiele obrazów (Rysunek uzupełniający S2).
    3. Wybierz opcję Dopasuj, wprowadź poprawne parametry akwizycji i zamknij okno dopasowania (rysunek uzupełniający S3).
    4. Wybierz Display>Average Intensity (WyświetlanieŚrednia intensywność>CH1 i sprawdź obecność fotowybielania (rysunek uzupełniający S4).
    5. Jeśli występuje więcej niż 10% fotowybielania, odrzuć serię lub, jeśli to możliwe, załaduj ponownie sekwencję obrazu, usuwając pierwszą część serii.
    6. Jeśli bielenie jest niższe niż 10%, wybierz Narzędzia>iMSD>Ustaw parametry, zaznacz 'Użyj średniej ruchomej', ustaw w panelu ROI po lewej stronie liczbę ramek dla średniej ruchomej, zwracając uwagę, że odpowiadający jej czas jest wyższy niż charakterystyczny czas dyfuzji (dla cząstek poruszających się z prędkością 1 μm2 sek-1 czas 10 sekund jest dobrą średnią ruchomą)
    7. Wybierz Tools>iMSD>Calculate iMSD (Rysunek uzupełniający S5), a następnie dopasuj iwyeksportuj i MSD z notatnika (Rysunek uzupełniający S6).

5. Obliczanie prawa dyfuzji na podstawie iMSD

  1. Dopasuj kilka pierwszych punktów, aby ekstrapolować punkt przecięcia (σ0, 2) (zwykle wystarcza 5 punktów, ale można zmieścić więcej punktów, jeśli wykazują zachowanie liniowe) i porównaj tę wartość z poprzednio zmierzonymi PSF2. Jeśli są one porównywalne, obserwuje się dynamikę izolowanych fluoroforów. Z drugiej strony, jeśli σ02 >> PSF2 staraj się zdobywać szybciej, aby upewnić się, że nie ma ukrytej dynamiki34.
  2. Obliczyć dyfuzyjność pozorną (D app) i średnie przemieszczenie (R) za pomocą równań 3 i 4 (patrz Wprowadzenie).
  3. Wykres Djako funkcja R w celu uzyskania prawa dyfuzji porównywalnego z tym, co jest mierzone za pomocą FCS12 opartego na zmienności plamki (rysunek 3D).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W celu skalibrowania pasu wiązki przyrządu można zmierzyć obraz pojedynczego fluorescencyjnego nanikulek, zgodnie z opisem w kroku 1.1 protokołu. Typowy obraz fluorescencyjny tych kulek przedstawiono na Rysunku 1. Dopasowanie rozkładu intensywności za pomocą funkcji Gaussa 2D daje niskie reszty i pozwala na zmierzenie pasu wiązki przyrządu na poziomie 270 nm. Wartość ta jest zgodna z oczekiwaną granicą dyfrakcyjną szacowaną za pomocą równania Rayleigha. Kalibracja ta nie jest konieczna do pomiaru dynamik...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Śledzenie pojedynczych cząstek (SPT) stanowi jedną z najczęstszych strategii badania dynamiki molekularnej i ma tę wielką zaletę, że mierzy trajektorie cząstek. To z kolei pozwala na sondowanie zachowania nawet kilku znakowanych cząstek w złożonym układzie. Jednak, aby osiągnąć tę przewagę, SPT zazwyczaj potrzebuje sondy o niskiej gęstości i bardzo jasnych etykiet. W szczególności, aby uzyskać wysoką rozdzielczość czasową (zakres μs), zwykle wymagane są sondy nieorganiczne (np. kropki kwantowe lub nanocząstki me...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest częściowo wspierana przez NIH-P41 P41-RRO3155 i NIH P50-GM076516 (grant dla EG) oraz Fondazione Monte dei Paschi di Siena (grant dla FB).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
iXon Ultra 897AndorDU-897U-CS0
SolisAndor
CHO-K1ATCCCCL-61
ATTO 488 oznaczone PPEATTO-TEC GmbHAD 488-151
DOPEAvanti Polar Lipids, Inc.
DOTAPAvanti Polar Lipids, Inc.890890
100x Penicylina-Streptomycyna-GlutaminaGibco10378-016
DMEM/F-12Gibco21331
FBSGibco10082147
HEPESGibco15630-106 
PBSGibco10010-023
SimFCS 3.0Globals Softwareoprogramowanie można pobrać tutaj: http://www.lfd.uci.edu/globals/
DMI6000 z modułem TIRFLeica
Lipofectamine 2000Lipofectamine11668019
MatlabMathWork
ImageJNIH
[nagłówek]
C-końcowy GFP oznaczone Receptor tranferynyOriGeneRG200980
AgarSigma AldrichA5306
ChloroformSigma Aldrich528730
Koraliki lateksowe, fluorescencyjne żółto-zielone, 30 nmSigma AldrichL5155
Myjki ultradźwiękowe SONICASOLTECETH S3
Szalki PetriegoWillcoGWSt-3522
Importer Bio-Format do Matlabhttp://www.openmicroscopy.org/site/support/bio-formats5/users/matlab/
ICS-MatLab Toolshttps://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zipSymulacja
według samouczkahttps://www.cellmigration.org/resource/imaging/icsmatlab/ICSTutorial.html
Symulacja według samouczkaSimFCShttps://www.cellmigration.org/resource/imaging/ppt-pdf/RICS%20Simulations.ppt
850725 LAS AF Leica Matlab

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Engelman, D. M. Membranes are more mosaic than fluid. Nature. 438 (7068), 578-580 (2005).
  2. Vereb, G., et al. yet structured: The cell membrane three decades after the Singer-Nicolson model. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (14), 8053-8058 (1073).
  3. Ishihara, A., Hou, Y., Jacobson, K. The Thy-1 antigen exhibits rapid lateral diffusion in the plasma membrane of rodent lymphoid cells and fibroblasts. 84 (5), 1290-1293 (1987).
  4. Axelrod, D., et al. Lateral motion of fluorescently labeled acetylcholine receptors in membranes of developing muscle fibers. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73 (12), 4594-4598 (1976).
  5. Jacobson, K., Derzko, Z., Wu, E. S., Hou, Y., Poste, G. Measurement of the lateral mobility of cell surface components in single, living cells by fluorescence recovery after photobleaching. J. Supramol. Struct. 5 (4), 10-1002 (1976).
  6. Kusumi, A., et al. Paradigm shift of the plasma membrane concept from the two-dimensional continuum fluid to the partitioned fluid: high-speed single-molecule tracking of membrane molecules. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 34, 351-378 (2005).
  7. Kusumi, A., Ike, H., Nakada, C., Murase, K., Fujiwara, T. Single-molecule tracking of membrane molecules: plasma membrane compartmentalization and dynamic assembly of raft-philic signaling molecules. Semin. Immunol. 17 (1), 3-21 (2005).
  8. Schwille, P., Korlach, J., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy with single-molecule sensitivity on cell and model membranes. Cytometry. 36, 176-182 (1999).
  9. Gielen, E., et al. Diffusion of sphingomyelin and myelin oligodendrocyte glycoprotein in the membrane of OLN-93 oligodendroglial cells studied by fluorescence correlation spectroscopy. C. R. Biol. 328 (12), 1057-1064 (2005).
  10. Weiss, M., Hashimoto, H., Nilsson, T. Anomalous protein diffusion in living cells as seen by fluorescence correlation spectroscopy. Biophys. J. 84, 4043-4052 (2003).
  11. Wawrezinieck, L., Rigneault, H., Marguet, D., Lenne, P. F. Fluorescence correlation spectroscopy diffusion laws to probe the submicron cell membrane organization. Biophys. J. 89 (6), 4029-4042 (2005).
  12. Lenne, P. F., et al. Dynamic molecular confinement in the plasma membrane by microdomains and the cytoskeleton meshwork. EMBO J. 25 (14), 3245-3256 (2006).
  13. Ries, J., Schwille, P. Studying slow membrane dynamics with continuous wave scanning fluorescence correlation spectroscopy. Biophys. J. 91 (5), 1915-1924 (2006).
  14. Ruan, Q., Cheng, M. A., Levi, M., Gratton, E., Mantulin, W. W. Spatial-temporal studies of membrane dynamics: scanning fluorescence correlation spectroscopy (SFCS). Biophys. J. 87 (2), 1260-1267 (2004).
  15. Berland, K. M., So, P. T., Chen, Y., Mantulin, W. W., Gratton, E. Scanning two-photon fluctuation correlation spectroscopy: particle counting measurements for detection of molecular aggregation. Biophys. J. 71, 410-420 (1996).
  16. Heinemann, F., Betaneli, V., Thomas, F. A., Schwille, P. Quantifying lipid diffusion by fluorescence correlation spectroscopy: a critical treatise. Langmuir. 28 (37), 13395-13404 (2012).
  17. Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. Capturing directed molecular motion in the nuclear pore complex of live cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (25), 9863-9868 (2012).
  18. Sanchez, S. A., Tricerri, M. A., Gratton, E. Laurdan generalized polarization fluctuations measures membrane packing micro-heterogeneity in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (19), 7314-7319 (2012).
  19. Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. Fluorescence correlation spectroscopy of intact nuclear pore complexes. Biophys. J. 101 (4), 27-29 (2012).
  20. Di Rienzo, C., et al. Unveiling LOX-1 receptor interplay with nanotopography: mechanotransduction and atherosclerosis onset. Sci. Rep. 3, 10-1038 (2013).
  21. Unruh, J. R., Gratton, E. Analysis of molecular concentration and brightness from fluorescence fluctuation data with an electron multiplied CCD camera. Biophys. J. 95 (11), 5385-5398 (2008).
  22. Kannan, B., et al. Electron multiplying charge-coupled device camera based fluorescence correlation spectroscopy. Anal. Chem. 78 (10), 3444-3451 (2006).
  23. Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Fast Zhuang, X. three-dimensional super-resolution imaging of live cells. Nat. Methods. 8 (6), 499-508 (2011).
  24. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. 3 (10), 793-795 (2006).
  25. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  26. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  27. Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nat. Methods. 5 (2), 155-157 (2008).
  28. Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  29. Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Opt. Lett. 24 (14), 954-956 (1999).
  30. Eggeling, C., et al. Direct observation of the nanoscale dynamics of membrane lipids in a living cell. Nature. 457 (7233), 1159-1162 (2009).
  31. Hedde, P. N., et al. Stimulated emission depletion-based raster image correlation spectroscopy reveals biomolecular dynamics in live cells. Nat. Commun. 4, Forthcoming.
  32. Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophys. J. 88 (5), 3601-3614 (2005).
  33. Brown, C. M., et al. Probing the integrin-actin linkage using high-resolution protein velocity mapping. J. Cell Sci. 119, 5204-5214 (2006).
  34. Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. Fast spatiotemporal correlation spectroscopy to determine protein lateral diffusion laws in live cell membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (30), 12307-12312 (2013).
  35. Mueller, V., et al. STED nanoscopy reveals molecular details of cholesterol- and cytoskeleton-modulated lipid interactions in living cells. Biophys. J. 101 (7), 1651-1660 (2011).
  36. Kleusch, C., Hersch, N., Hoffmann, B., Merkel, R., Csiszar, A. Fluorescent lipids: functional parts of fusogenic liposomes and tools for cell membrane labeling and visualization. Molecules. 17 (1), 1055-1073 (2012).
  37. Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS. Biophys. J. 96 (5), 1999-2008 (2009).
  38. Kolin, D. L., Wiseman, P. W. Advances in image correlation spectroscopy: measuring number densities, aggregation states, and dynamics of fluorescently labeled macromolecules in cells. Cell Biochem. Biophys. 49 (3), 141-164 (2007).
  39. Digman, M. A., et al. Measuring fast dynamics in solutions and cells with a laser scanning microscope. Biophys. J. 89 (2), 1317-1327 (2005).
  40. Ritchie, K., et al. Detection of non-Brownian diffusion in the cell membrane in single molecule tracking. Biophys. J. 88 (3), 2266-2277 (2005).
  41. Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J. Microsc. 170, 229-236 (1993).
  42. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene,, Wittbrodt, F., J,, Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  43. Wohland, T., Shi, X., Sankaran, J., Stelzer, E. H. Single plane illumination fluorescence correlation spectroscopy (SPIM-FCS) probes inhomogeneous three-dimensional environments. Opt. Express. 18 (10), 10627-10641 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia fluorescencyjna z ca kowitym wewn trznym odbiciemkalibracja funkcji rozproszonego punktuobrazowanie fluorescencyjnych kuleksp jno czasoprzestrzennaredni kwadrat przemieszczeniapozorna dyfuzyjnoreceptor transferyny z etykiet GFP

Powiązane artykuły