Hodowla komórek ssaków przy użyciu systemu jednorazowego bioreaktora pneumatycznego

Podsumowanie

Korzystając z bioreaktora pneumatycznego, demonstrujemy montaż, działanie i wydajność tego jednorazowego systemu bioreaktorów do wzrostu komórek ssaków.

Streszczenie

Ostatnie postępy w hodowli ssaków, owadów i komórek macierzystych oraz ich zwiększaniu skutków, stworzyły ogromne możliwości dla nowych terapii i innowacji w medycynie spersonalizowanej. Jednak przełożenie tych postępów na zastosowania terapeutyczne będzie wymagało systemów in vitro, które pozwolą na stworzenie solidnych, elastycznych i opłacalnych systemów bioreaktorów. Istnieje kilka systemów bioreaktorów wykorzystywanych obecnie w warunkach badawczych i komercyjnych; Jednak wiele z tych systemów nie jest optymalnych do ustanawiania, rozszerzania i monitorowania wzrostu różnych typów komórek. Parametry hodowli najtrudniejsze do kontrolowania w tych systemach obejmują minimalizację ścinania hydrodynamicznego, zapobieganie tworzeniu się gradientu składników odżywczych, ustanowienie jednolitego napowietrzania pożywki hodowlanej, zapobieganie zanieczyszczeniu mikrobiologicznemu oraz monitorowanie i dostosowywanie warunków hodowli w czasie rzeczywistym. Korzystając z pneumatycznego systemu bioreaktorów jednorazowego użytku, demonstrujemy montaż i działanie tego nowatorskiego bioreaktora dla komórek ssaków hodowanych na mikronośnikach. Ten system bioreaktorów eliminuje wiele wyzwań związanych z obecnie dostępnymi systemami, minimalizując ścinanie hydrodynamiczne i tworzenie gradientu składników odżywczych oraz umożliwiając równomierne napowietrzanie pożywki hodowlanej. Co więcej, oprogramowanie bioreaktora pozwala na zdalne monitorowanie w czasie rzeczywistym i dostosowywanie parametrów pracy bioreaktora. Ten system bioreaktorów ma również ogromny potencjał w zakresie zwiększania skali komórek ssaków przylegających i zawiesinowych do produkcji różnych białek terapeutycznych, przeciwciał monoklonalnych, komórek macierzystych, leków biopodobnych i szczepionek.

Wprowadzenie

Linie komórek ssaków można zaklasyfikować do jednej z trzech kategorii na podstawie ich cech wzrostu: komórki, które rosną w zawiesinie, komórki, które rosną jako agregaty, oraz komórki, które rosną zakotwiczone w substracie. Chociaż bioreaktor z kołem powietrznym pokazany w tym filmie jest w stanie wyhodować wszystkie trzy typy komórek, ten film zademonstruje wykorzystanie bioreaktora do hodowli komórek zależnych od zakotwiczenia na mikronośnikach. Komórki ssaków zależne od zakotwiczenia mogą być hodowane w celu wytworzenia większej liczby komórek - gdzie same komórki są produktem. Na przykład ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące ze szpiku kostnego są obecnie hodowane w celu pobrania komórek i wstrzyknięcia ich do chorej tkanki. Bioreaktor pneumatyczny pokazany na tym filmie okazał się odpowiedni do produkcji takich mezenchymalnych komórek macierzystych do tego zastosowania (Serra i in., komunikacja osobista, 2013).

Zależne od zakotwiczenia komórki ssaków są zazwyczaj hodowane na małą skalę w naczyniach hodowlanych 2D, takich jak płytki do hodowli komórkowych, kolby do hodowli komórkowych lub butelki rolkowe, gdzie przylegają do specjalnie przygotowanej powierzchni wzrostu¹. Gdy pożądanych jest więcej komórek, płytki lub kolby można rozszerzyć za pomocą większej liczby lub większych naczyń. Jednakże, aby uzyskać bardziej opłacalną hodowlę dużych ilości komórek zależnych od zakotwiczenia, zwiększenie powierzchni do przyczepiania komórek można osiągnąć za pomocą małych stałych kulek zwanych mikronośnikami. W zależności od charakterystyki przyczepu komórki, na rynku dostępnych jest kilka różnych rodzajów mikronośników, takich jak dekstran, peptyd lub pokryty kolagenem. Mikronośniki mają duży stosunek powierzchni do objętości, zapewniając większą powierzchnię do wzrostu komórek; Mikronośniki mogą być utrzymywane w zawiesinie z mieszaniem, co pozwala na hodowlę komórek do dużych gęstości w systemach bioreaktorów². Obecnie typy bioreaktorów, w których przylegające komórki są hodowane na mikronośnikach, obejmują kolby obrotowe i systemy zbiorników z mieszadłem, które wykorzystują wirniki osiowe do utrzymywania zawieszenia mikronośników pokrytych komórkami.

Kilka czynników jest ważnych dla pomyślnej hodowli komórek, w tym napięcie tlenu, naprężenie ścinające, matryca powierzchniowa oraz stężenia składników odżywczych i metabolitów. Zastosowanie bioreaktorów pozwala na monitorowanie warunków wzrostu w czasie rzeczywistym i potencjału do znacznego obniżenia kosztów produkcji¹. Istnieje kilka popularnych konstrukcji bioreaktorów do hodowli komórek in vitro, w tym zawiesina z mieszadłem, naczynie o obrotowych ściankach, puste światłowody, bioreaktor workowy na platformie kołyskowej i systemy ze złożem fluidalnym³. Wiele z tych systemów stwarza unikalne problemy związane z hodowlą komórek i zwiększaniem skali, takie jak wysokie koszty, gradienty stężeń składników odżywczych, ścinanie hydrodynamiczne, agregacja komórek oraz trudności w pobieraniu próbek, monitorowaniu i kontrolowaniu skalowania komórek.

Różne przylegające linie komórkowe są wykorzystywane do produkcji wirusów, zarówno do produkcji szczepionek wirusowych, jak i do produkcji wektorów wirusowych do zastosowań terapii genowej. W tym filmie, korzystając z systemu jednorazowego bioreaktora pneumatycznego (Air-Wheel), demonstrujemy hodowlę komórek ludzkiego raka płuc (A549) na mikronośnikach do produkcji onkolitycznego adenowirusa. Konstrukcja bioreaktora pneumatycznego wykorzystuje pionowe koło mieszające, które jest napędzane przez wypor gazu rozpryskiwanego na dno bioreaktora. Ta delikatna metoda mieszania ogranicza hydrodynamiczne siły ścinające, ale nadal zapewnia optymalne mieszanie podłoża i komórek⁴. W porównaniu z reaktorem zbiornikowym z mieszadłem, reaktor pneumatyczny charakteryzuje się niskim naprężeniem ścinającym ściankowym nawet w przypadku systemów bioreaktorów pneumatycznych o dużej objętości (ilustracja 1). W przeciwieństwie do bioreaktorów zbiornikowych z mieszadłem, pionowy wirnik tego reaktora jednorazowego użytku jest obracany przez strumień pęcherzyków gazu w zbiorniku, co pozwala na delikatne i równomierne mieszanie medium (rysunek 2).

Protokół

1. Zaloguj się

1. Włącz bioreaktor. Kliknij w dowolnym miejscu, aby otworzyć stronę logowania. Wybierz nazwę użytkownika i wprowadź hasło, a następnie kliknij "Zaloguj się".

2. Kalibracja

1. Skalibruj czujnik pH (2 punkty przed autoklawowaniem).
2. Sprawdź czujnik pH i upewnij się, że końcówka czujnika jest wypełniona roztworem elektrolitu. Przygotować dwie zlewki z roztworami kalibracyjnymi pH (elektrolitem) o pH 4 i pH 7 i mieć pod ręką butelkę do mycia z wodą destylowaną.
3. Podłącz pH do czujnika pH. Przejdź do zakładki "Akcje" w interfejsie Hello i kliknij "kalibruj". Wprowadź temperaturę bufora w polu Temp roztworu kalibracyjnego.
4. Umieść czujnik pH w buforze 1 (pH 4) i wprowadź wartość w polu "zero". Poczekaj, aż wykres się ustabilizuje i kliknij przycisk "kalibruj 1". Wypłucz czujnik pH wodą destylowaną.
5. Umieść czujnik w buforze 2 (pH 7). Wprowadź wartość bufora 2 w polu "span". Poczekaj, aż wykres się ustabilizuje i kliknij przycisk kalibracji 2.
6. Kliknij "Zapisz", a następnie kliknij "Zamknij".
7. Skalibruj czujnik tlenu rozpuszczonego (DO).
8. Upewnij się, że czujnik tlenu rozpuszczonego został spolaryzowany, podłączając go do systemu na kilka godzin. Przejdź do zakładki "Akcje" w interfejsie Hello i kliknij kalibruj. Kliknij przycisk "DO A".
9. Odłącz czujnik tlenu rozpuszczonego i wprowadź 0 w polu "zero". Poczekaj, aż wykres się ustabilizuje i kliknij przycisk "Kalibruj 1".
10. Podłącz ponownie czujnik tlenu rozpuszczonego i wprowadź 100 w polu "Zakres". Poczekaj, aż wykres się ustabilizuje i kliknij przycisk "Kalibruj 2".
11. Kliknij "Zapisz", a następnie kliknij "zamknij".

3. Autoklaw i instalacja czujników i naczyń z odczynnikami

1. Po kalibracji umieścić czujniki i studzienkę termiczną w torebkach autoklawu i autoklawie na 30 minut w temperaturze 121 °C, 15 psi.
2. Zdezynfekuj woreczki autoklawu 70% alkoholem izopropylowym (IPA) i przenieś woreczki do szafy bezpieczeństwa biologicznego (BSC). Usunąć zewnętrzne opakowanie naczynia.
3. Zdezynfekuj opakowanie wewnętrzne za pomocą 70% IPA i przenieś naczynie do szafy bezpieczeństwa biologicznego (BSC). Usuń opakowanie wewnętrzne i sprawdź naczynie i rurki pod kątem uszkodzeń powstałych podczas transportu.
4. Zainstaluj czujniki pH i tlenu rozpuszczonego w dwóch przednich portach. Zamontuj studzienkę termiczną w lewym tylnym porcie. Otwórz nasadkę czujnika.
5. Przeprowadź czujnik przez port czujnika. Mocno wkręć czujnik w port.
6. Statek transferowy z BSC.
7. Zawieś czujnika tlenu rozpuszczonego i pH na zewnątrz tulei naczynia i sprawdź, czy nic nie znajduje się w tulei. Wsuń naczynie do rękawa, stopami do przodu.
8. Ostrożnie włóż czujnik temperatury do studzienki termicznej naczynia. Upewnij się, że dno naczynia opiera się o grzejniki.
9. Wyjmij zestawy wężyków z ich toreb. Dopasuj kody kolorystyczne na rurkach do odpowiednich złączy i pomp na jednostce sterującej bioreaktora.
10. Zamontuj główny przewód gazowy, wciskając złącze do wylotu gazu. Zamontuj mikroprzewód gazowy, przekręcając złącze zgodnie z ruchem wskazówek zegara do wylotu gazu. Zamontuj rurkę filtra wylotowego:
11. Otwórz piekarnik z filtrem. Zamocuj filtr wylotowy na kanale U tak, aby jego rurka przechodziła przez dwa haczyki do filtra i wyjmowała z piekarnika.
12. Zamontuj rurkę za pomocą worka skraplacza w uchwycie na przewody. Zamknij drzwi.
13. Poprowadź linie dodawania A i B, obie linie mediów oraz linię pobierania za czujnikiem tlenu rozpuszczonego i na stół obok jednostki sterującej bioreaktora.
14. Podłącz do czujników tlenu rozpuszczonego i pH.

4. Dodawanie nośników średnich i mikronośników

1. Przejdź do zakładki "akcje" i kliknij "Sterowanie pompami" w interfejsie komputera.
2. Utwórz sterylne połączenie między nieużywaną linią dodawania pożywki (1 pomarańczowa opaska) a źródłem pożywki w butelce/worku, przyspawan rurki lub używając złączek Luer.
3. Kliknij suwak, aby włączyć pompę mediów. Kliknij suwak, aby wyłączyć pompę mediów po dodaniu żądanej ilości medium.
4. Umieść kulki mikronośne w Ca²⁺, Mg²⁺ wolnym PBS na 3 godziny w RT.
5. Umyj koraliki kilkakrotnie za pomocą Ca²⁺, Mg²⁺ free PBS.
6. Autoklaw przez 15 min w temperaturze 115 °C, 15 psi.
   UWAGA: W tym eksperymencie dodaj 3 g/L (suchą masę).
7. Wpompować do reaktora mikronośniki, które zostały uwodnione, umyte i autoklawowane w taki sam sposób, w jaki pożywka została dodana w kroku 4.1.

5. Równoważenie i jednopunktowa kalibracja DO

1. Ustaw sterowniki w pozycji Auto i wprowadź żądane wartości zadane. W tym przypadku należy użyć nastawy mieszania (SP) = 15 obr./min, temperatury SP = 37,0 °C, pH = 7,2, DO = 100%. Poczekaj, aż parametry się zrównoważą.
2. Upewnij się, że czujnik jest w pełni spolaryzowany. Upewnij się, że obecna wartość DO ustabilizowała się.
3. Przejdź do zakładki "Akcje" i kliknij "kalibruj". Kliknij "DO A", kliknij "Jeden punkt".
4. Wpisz "100" w polu "Rozpiętość". Kliknij przycisk "Kalibruj 1", kliknij "Zapisz" i kliknij "Zamknij":

6. Rozpoczynanie biegu

1. Przejdź do zakładki Akcje. Kliknij "Partia". Użyj klawiatury ekranowej lub klawiatury zewnętrznej, aby wprowadzić nazwę partii o długości do 16 znaków.
2. Kliknij przycisk "Ukryj" na klawiaturze ekranowej. Kliknij "Rozpocznij partię", potwierdź, klikając "Start" w nakładce.

7. Zaszczepić komórkami

1. Uformuj sterylne połączenie między nieużywaną linią dodawania pożywki (1 pomarańczowa opaska) a źródłem butelki/worka komórkowego, zgrzewając rurki lub używając złączek Luer.
2. Zamontuj silikonową część rurki w pompie mediów tak, aby strzałka była skierowana w stronę rurki między pompą a naczyniem.
3. Sprawdź, czy rurka clamp jest otwarty, a jego rozgałęziony rurka clamp jest zamknięty. Kliknij suwak, aby włączyć pompę mediów i kliknij "Wyłącz" po dodaniu komórek.
4. Przejdź do zakładki "Akcje" i kliknij "Sterowanie pompami".

8. Pobieranie próbek

1. Po zaszczepieniu i tak często, jak jest to pożądane, w celu monitorowania kultury, należy pobrać próbkę z kultury w następujący sposób:
2. Przejdź do zakładki "akcje" i kliknij "pobierz próbkę". Umieścić rurkę do pobierania próbek w pompie do pobierania próbek i manipulować kranem pobierania próbek zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie.
3. Na tych próbkach należy wykonywać co najmniej codzienną obserwację mikroskopową i liczbę komórek.
4. Gdy komórki osiągną pożądaną gęstość, w tym przypadku 1,2 x 10⁶ komórek/ml, należy zainfekować komórki dodatkiem inokulum wirusa.
5. Aseptycznie dodać inokulum do strzykawki o pojemności 20 ml i podłączyć strzykawkę do jednego z zapasowych portów dodawania w reaktorze. Wprowadzić inokulum do reaktora, naciskając tłok strzykawki.
6. Kontynuuj pobieranie próbek i analizowanie kultury pod kątem stężenia wewnątrzkomórkowych cząstek adenowirusa.

Wyniki

Na Rysunku 3 przedstawiono parametry inicjacji pracy bioreaktora. Rysunek ten pokazuje ekran przed ustawieniem parametrów temperatury, rozpuszczonego tlenu, pH oraz mieszania. Po ustawieniu parametrów parametry procesu są stale monitorowane, a korekty mogą być wprowadzane w celu utrzymania wymaganych warunków. Oprogramowanie generuje ciągły odczyt, który pozwala na łatwą identyfikację problemów. W tym eksperymencie, przy użyciu 2,5 L DMEM zawierającego 10% FBS, 250 ppm SAFC Anti-foam C, 2 mm L-glutaminy i 3 g/L mikronośników, system zostaje ustabilizowany tak, aby procent tlenu wynosił 50%, temperatura 37 °C, a pH 7,2. Reaktor zostaje zaszczepiony komórkami A549 w stężeniu 7 x 10⁴ komórek/ml (lub 10 komórek/mikronośnik). Parametry wybrane dla tego procesu spowodowały, że większość komórek przywarła do mikronośników w ciągu 2 h (Rysunek 4). Po 12 h komórki wykazują oznaki spłaszczania się i rozprzestrzeniania na powierzchni mikronośnika (Rysunek 5). Po 24 h mikronośniki mają stosunkowo równomierny rozkład komórek, bez mikronośników pozbawionych komórek oraz bez dużych skupisk komórek na mikronośnikach (Rysunek 6). Procent kolonizacji mikronośników przez komórki A549 wynosi 75% po 24 h i 90% w późniejszym czasie (Rysunek 7). Komórki nadal rosły wykładniczo do poziomu ~1 miliona komórek/ml po 48 h (Rysunek 8). Po infekcji dawką onkolitycznego adenowirusa (2 x 10⁸ wirionów/ml) w 50 h, gęstość wzrosła do 1,2 miliona komórek/ml, a następnie zaczęła spadać w miarę postępu infekcji litycznej. Odnotowano ~10 000-krotną amplifikację inokulum wirusowego.

W poprzednich eksperymentach stwierdziliśmy, że monitorowanie i regulacja przepływu gazów są kluczowe dla maksymalizacji wzrostu komórek (dane niepublikowane). Szybko rosnące komórki mogą doprowadzić do wyczerpania zapasów tlenu w systemie, w wyniku czego poziom DO może spaść do zera. Choć komórki nadal rosły, tempo wzrostu było znacznie wolniejsze. Krytyczne jest monitorowanie i dostosowywanie przepływu tlenu, aby zaspokoić zapotrzebowanie komórek w fazie wzrostu logarytmicznego. Każdy cykl można analizować pod kątem optymalnego wzrostu, porównując pH, DO i temperaturę z codziennymi zliczeniami komórek.

Rycina 1. Dynamika płynów w pneumatycznym systemie bioreaktora (PBS) w porównaniu z bioreaktorem z mieszadłem mechanicznym podczas pomiaru sił ścinania na ściance przy różnych objętościach reaktora.

Rycina 2. Mieszadło pneumatycznego reaktora Air-Wheel.

Rysunek 3. Zrzut ekranu oprogramowania Pneumatic Air Wheel przedstawiający parametry niezbędne do uruchomienia procesu w bioreaktorze.

Rycina 4. Kolonizacja mikronośników przez komórki A549 2 h po inokulacji. (Średnica mikronośnika ok. 180 µm.) Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 5. 12 hr po rozpoczęciu hodowli komórki A549 przyкрепiają się, spłaszczają i rozprzestrzeniają na mikronośnikach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 6. Mikronośniki pokryte komórkami po 24 h hodowli. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 7. Procent kolonizacji mikronośników przez komórki A549 po inokulacji.

Rysunek 8. Liczba żywych komórek A549 w kulturze przed i po infekcji adenowirusem.Należy zauważyć, że etap infekcji wirusowej nastąpił w 50. godzinie.

Dyskusja

Ten jednorazowy system bioreaktora jest stosunkowo prosty w użyciu i zapewnia analizę w czasie rzeczywistym na potrzeby monitorowania i analizy reaktora. Doskonale nadaje się do hodowli komórek ssaków i owadów o gęstości komórek sięgającej ponad 30 milionów komórek/ml. Oprócz komórek A549 opisanych w niniejszym^raporcie11, w bioreaktorze wyhodowaliśmy również komórki owadów SF-9. Delikatne mieszanie zapewniane przez pneumatyczne koło pneumatyczne zmniejsza uszkodzenia komórek. Podczas ustawiania tego reaktora należy wykonać kilka kroków. Po pierwsze, właściwa kalibracja czujników pH i tlenu rozpuszczonego jest ważna dla optymalnego monitorowania kultury i dodawania odczynników w celu dostosowania pH lub tlenu w systemie. Po drugie, butelki z odczynnikiem i nasionami muszą być napełnione, a nasadki typu luer wykonane w sterylnym środowisku, takim jak BSC. Po wyjęciu butelek z odczynnikami ze sterylnego środowiska, połączenia z przewodami zasilającymi bioreaktor muszą być wykonane ostrożnie, aby uniknąć zanieczyszczenia mikrobiologicznego.

Chociaż ten system bioreaktorów działa dobrze w przypadku linii komórkowych ssaków i owadów, nie jest przeznaczony do hodowli bakteryjnych. System nie jest w stanie zapewnić szybkiego mieszania i natleniania, które jest wymagane dla komórek bakteryjnych. Wzrost bakterii najlepiej przeprowadzić w bioreaktorze zbiornikowym z mieszadłem. W porównaniu z innymi bioreaktorami jednorazowego użytku do hodowli komórek ssaków lub owadów, system ten jest łatwy w użyciu, zapewnia wystarczające dane do analizy przebiegów i ma podobny lub lepszy wzrost komórek niż inny oceniany przez nas system jednorazowego użytku.

Jednorazowy system bioreaktora pneumatycznego ma potencjał, aby sprostać wielu zastosowaniom badawczym i klinicznym w dziedzinie bioterapeutyków, szczepionek, komórek macierzystych i medycyny spersonalizowanej⁴. Ponadto elastyczność tego systemu pozwala na zastosowanie bioreaktorów opartych na partiach, partiach zasilających, perfuzji i transfekcji⁵. Wreszcie, systemy bioreaktorów jednorazowego użytku mają potencjał, aby zaspokoić potrzeby produkcji przemysłowej na dużą skalę oraz przestrzegać wytycznych i zaleceń krajowych i międzynarodowych agencji regulacyjnych^6-10.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
PBS 3	PBS Jednorazowy
montaż	PBS
(A549)	ATCC	CCL-185
DMEM Wysoka glukoza Średnia
płodowa surowica
Trypsyna EDTA, 0,25%
mikronośników Cytodex 1	GE	3781
Przeciwpieniący C	Sigma	A8011