Wydajne wytwarzanie komórek iPS z krwi przy użyciu episomów i inhibitorów HDAC

Summary

Tutaj opisujemy protokół generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu strategii przeprogramowania opartej na episomach i inhibitorów deacetylazy histonowej.

Abstract

Ten manuskrypt ilustruje protokół efektywnego tworzenia bezintegracyjnych ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z krwi obwodowej przy użyciu plazmidów epizodycznych i inhibitorów deacetylazy histonowej (HDAC). Do zalet tego podejścia należą: (1) wykorzystanie minimalnej ilości krwi obwodowej jako materiału źródłowego; (2) niecałkujące wektory przeprogramowania; 3) opłacalną metodę wytwarzania bezwektorowych iPSC; 4) pojedyncza transfekcja; oraz (5) wykorzystanie małych cząsteczek w celu ułatwienia przeprogramowania epigenetycznego. Krótko mówiąc, komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) są izolowane z rutynowych próbek flebotomii, a następnie hodowane w określonych czynnikach wzrostu, aby uzyskać wysoce proliferacyjną populację komórek progenitorowych erytrocytów, która jest niezwykle podatna na przeprogramowanie. Nieintegrujące, niezakaźne plazmidy episomalne eksprymujące OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A i krótki spinka do włosów (sh) RNA p53 są wprowadzane do pochodnych erytroblastów za pomocą pojedynczego nukleofekcji. Kotransfekcja episomu wyrażającego wzmocnione białko zielonej fluorescencji (eGFP) pozwala na łatwą identyfikację transfekowanych komórek. Do mieszaniny reakcyjnej dodaje się również oddzielny plazmid z niedoborem replikacji eksprymujący antygen jądrowy Epsteina-Barr 1 (EBNA1) w celu zwiększenia ekspresji białek episomalnych. Transfekowane komórki są następnie umieszczane na warstwie napromieniowanych mysich fibroblastów embrionalnych (iMEF) w celu dalszego przeprogramowania. Gdy tylko kolonie podobne do iPSC pojawią się po około dwunastu dniach od nukleofekcji, inhibitory HDAC są dodawane do pożywki, aby ułatwić przebudowę epigenetyczną. Odkryliśmy, że włączenie inhibitorów HDAC rutynowo zwiększa wytwarzanie w pełni przeprogramowanych kolonii iPSC 2-krotnie. Gdy kolonie iPSC wykazują typową morfologię ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC), są delikatnie przenoszone na indywidualne płytki do hodowli tkankowych pokrytych iMEF w celu dalszego wzrostu i ekspansji.

Introduction

iPSC pochodzą z tkanek somatycznych poprzez ektopową ekspresję minimalnego zestawu genów pluripotencji. Technika ta została początkowo zademonstrowana przez transdukcję retrowirusową ludzkich fibroblastów z OCT4, SOX2, KLF4 i cMYC, które ulegają silnej ekspresji w stanie pluripotencjalnym¹. Te przejściowo ulegające ekspresji "czynniki przeprogramowujące" zmieniają krajobraz epigenetyczny komórki docelowej i profil ekspresji genów analogicznie do ludzkich embrionalnych komórek macierzystych². Po utworzeniu, iPSC można potencjalnie różnicować w dowolny typ tkanki w celu dalszych badań. W związku z tym są obiecujące do wykorzystania w medycynie regeneracyjnej, modelowaniu chorób i zastosowaniach terapii genowej. Jednak zakłócenie genomu poprzez integrację wirusów może potencjalnie zmienić endogenną ekspresję genów, wpłynąć na fenotyp komórkowy i ostatecznie zniekształcić wyniki naukowe. Co więcej, losowe integracje wirusowe mogą prowadzić do szkodliwych skutków komórkowych, w tym możliwości złośliwej^{transformacji3} lub ponownej ekspresji onkogennych transgenów4. Przyszłe zastosowania kliniczne będą wymagały generowania nieintegrujących iPSC.

Episomy, które są dodatkowymi chromosomalnymi kolistymi cząsteczkami DNA, oferują strategię generowania efektywnych kosztowo, bezintegracyjnych iPSC⁵. Kombinacja wektorów epizodycznych przedstawiona w tabeli 1 wyraża czynniki przeprogramowania OCT4, SOX2, KLF4, MYCL i LIN28A. Plazmid pCXLE_hOCT3/4-shp53-F zawiera również shRNA p53 do tymczasowej supresji TP53 w celu usprawnienia przeprogramowania komórkowego⁶. Wektor pCXWB-EBNA1 z niedoborem replikacji sprzyja amplifikacji czynników przeprogramowywania i zwiększa wydajność przeprogramowywania, zapewniając przejściowy wzrost ekspresji EBNA1 ⁷. Plazmid pCXLE_EGFP można dodać do mieszaniny nukleofekcji w celu określenia wydajności transfekcji lub do zastosowań związanych z sortowaniem komórek. Z wyjątkiem pCXWB-EBNA1, plazmidy episomalne stosowane w tym protokole zawierają wirus Epsteina-Barr pochodzący z replikacji wirusa i gen EBNA1, które pośredniczą w replikacji i podziale episomu podczas podziału komórki gospodarza⁸. Episomy są spontanicznie tracone wraz z kolejną ekspansją iPSC⁷. Subklonowanie i charakterystyka iPSC z utratą wektora episomalnego, którą można wywnioskować z utraty ekspresji eGFP, może prowadzić do całkowicie wolnych od integracji iPSC do przyszłych zastosowań klinicznych.

Nieodłącznym elementem procesu generowania iPSC jest tłumienie genów specyficznych dla danej linii i reaktywacja genów związanych z pluripotencją. Regulacja ekspresji genów zachodzi na wielu poziomach w jądrze, w tym modyfikacje DNA i chromatyny, aby umożliwić czynniki transkrypcyjne, regulatorowe elementy DNA i dostęp polimerazy RNA do genów docelowych. Przemodelowanie krajobrazu epigenetycznego poprzez globalne modyfikacje chromatyny jest kluczowym elementem reekspresji programu genetycznego pluripotencji. Specyficzną modyfikacją chromatyny, która jest istotna w regulacji ekspresji genów, jest acetylacja histonów przy określonych resztach lizyny, co umożliwia dostęp do docelowych genów poprzez zmniejszenie napięcia cewki histon-DNA. Inhibitory HDAC to małe cząsteczki, które, jak wykazano, usprawniają przeprogramowanie iPSC i samoodnawianie się hESC^9,10, prawdopodobnie ze względu na wspieranie stanu acetylowanego¹¹. Opisany poniżej protokół, zaadaptowany z wcześniejszej publikacji z wykorzystaniem integracji lentiwirusów¹², zapewnia metodę krok po kroku do zoptymalizowanego generowania iPSC z krwi obwodowej przy użyciu episomów i inhibitorów HDAC. Zastosowane tutaj stężenia inhibitorów HDAC są o połowę mniejsze niż opisane przez Ware'a i wsp.⁹ i rutynowo doprowadziły do 2-krotnego wzrostu w pełni przeprogramowanych kolonii iPSC w porównaniu ze standardowymi protokołami przeprogramowania episomalnego bez inhibitorów HDAC. Ten poziom przeprogramowania jest na równi ze skutecznością, którą obserwujemy w przypadku metod lentiwirusowych. Korzystając z tego protokołu, skutecznie wygenerowaliśmy iPSC od osób w wieku nawet 87 lat.

Protocol

Pisemna świadoma zgoda, zatwierdzona przez Instytucjonalne Komisje Rewizyjne Fred Hutchinson Cancer Research Center i Children's Hospital of Philadelphia, została uzyskana od pacjentów przed pobraniem próbek krwi obwodowej. Przestrzegano wszystkich wytycznych instytucjonalnych. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach, w tym generowanie MEF i tworzenie potworniaków, zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt.

1. Oddzielenie PBMCS metodą Ficoll i ekspansja erytroblastów – Dzień 0

1. Rozcieńczyć krew obwodową w stosunku 1:1 roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco. W okrągłodennej probówce z polistyrenu o pojemności 15 ml ostrożnie nanieść 7 ml rozcieńczonej krwi na 3 ml Ficoll-Hypaque o temperaturze pokojowej.
2. Odwirować próbkę o masie 400 x g przez 30 minut.
3. PBMC osiądą na granicy faz pomiędzy plazmą a Ficoll-Hypaque, widzianą jako mętna, biała warstwa. Za pomocą sterylnej pipety transferowej zebrać PBMC do jednej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Doprowadzić objętość do 10 ml za pomocą DPBS.
4. Za pomocą hemacytometru policz PBMC.
5. Odpipetować 2 × 10⁶ PBMC do oddzielnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml i wirować przy 300 x g przez 5 minut. Pozostałe komórki odwirować i zamrozić w stężeniu 2 × 10⁶ PBMC/ml w 90% płodowej surowicy bydlęcej (FBS)/10% dimetylosulfotlenku (DMSO).
6. Przygotuj podłoże ekspandacyjne: pożywka wolna od surowicy QBSF-60 (chronić przed światłem) + penicylina/streptomycyna (1%) + kwas askorbinowy (50 ng/ml) + czynnik komórek macierzystych (SCF, 50 ng/ml) + interleukina 3 (IL-3, 10 ng/ml) + erytropoetyna (EPO, 2 U/ml) + insulinopodobny czynnik wzrostu 1 (IGF-1, 40 ng/ml) + deksametazon (1 μM; chronić przed światłem; rozmrażać świeżą porcję przy każdej zmianie podłoża).
7. Zawiesić 2 × 10⁶ PBMC w 2 ml świeżo przygotowanej pożywki ekspansyjnej i umieścić w jednym dołku na 12-dołkowej płytce do hodowli tkankowej i inkubować w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C w atmosferze 5%_O2, 5% CO₂ i 90% N₂ .
8. W dniu 3 i 6 wymień nośnik.
   1. Zebrać komórki i umyć studzienkę 2 ml QBSF-60, aby zebrać pozostałe komórki.
   2. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 300 x g przez 5 minut i odessać supernatant.
   3. Ponownie zawiesić komórki w 2 ml nowej pożywki rozprężającej i umieścić je z powrotem na tej samej płytce 12-dołkowej.

2. Przeprogramowanie komórek przez nukleofekcję – Dzień 9

1. Odpipetować plazmidy przeprogramowujące do sterylnej probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 ml (Tabela 1).
2. Wymieszać roztwór nukleofekcji z suplementem (dostarczonym przez producenta) i odpipetować do sterylnej probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 ml.
3. Odpipetować 2 ml pożywki ekspandacyjnej do jednego dołka na płytce 12-dołkowej i umieścić w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C (5%_O2, 5% CO₂ i 90% N₂) w celu zrównoważenia przed dodaniem komórek.
4. Zebrać wyhodowane komórki i przemyć studzienkę 2 ml QBSF-60 w celu zebrania pozostałych komórek.
5. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut i odessać supernatant.
6. Przemyć komórki poprzez ponowne zamieszanie w 5 ml DPBS i odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut.
7. Odessać supernatant.
8. Zawiesić osad komórkowy w 100 μl roztworu nukleofekcji + suplementu, uważając, aby nie powstawać pęcherzyków.
9. Odpipetować zawiesinę komórek do probówki zawierającej plazmidy przeprogramowujące, raz pipetować w górę i w dół, a następnie pipetować próbkę na dno kuwety nukleofekcji.
10. Umieść kuwetę w maszynie do nukleofekcji i uruchom program T-019.
11. Przenieść 100 μl wstępnie podgrzanego podłoża ekspandacyjnego (z płytki równoważącej w kroku 2.3) do kuwety nukleofekcji.
12. Natychmiast zebrać całą próbkę i umieścić ją w studzience z podgrzanym podłożem eksplatamentacyjnym. Unikaj zbierania białych, unoszących się na wodzie resztek martwych komórek.
13. Umieść płytkę w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C (5%_O2, 5% CO₂ i 90% N₂) do wzrostu.

3. Ogniwa poszycia - Dzień 10 lub 11

1. W dniu 10, komórki podajnika płytek.
   1. Pokryj jedną 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej żelatyną.
      1. Odpipetować 1 m 0,1% żelatyny w buforowanym roztworze soli fizjologicznej Hanka (HBSS) do każdego dołka płytki.
      2. Umieścić płytkę w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C na co najmniej 5 minut.
      3. Bezpośrednio przed użyciem należy odessać roztwór żelatyny z płytki.
   2. Rozmrozić jedną fiolkę zawierającą 2 × 10⁶ mysich fibroblastów embrionalnych napromieniowanych w temperaturze 3000 cGy w 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki MEF (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) + FBS (10%) + penicylina/streptomycyna (1%)).
   3. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut i odessać supernatant. Zawiesić komórki w 12 ml pożywki MEF i odpipetować 2 ml do każdego dołka 6-dołkowej płytki pokrytej żelatyną. Umieścić płytkę w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C (5%_O2, 5% CO₂ i 90% N₂) do 12 dnia.

4. Posiewanie komórek na komórkach zasilających i zmiana podłoża – Dzień 12

1. Zebrać komórki nukleofektyczne do jednej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i zebrać wszelkie pozostałe komórki, przemłukując studzienkę 2 ml QBSF-60. Odwirować próbkę o masie 300 x g przez 5 minut.
2. Przygotuj pożywkę do przeprogramowywania: Zmodyfikowana pożywka Dulbecco firmy Iscove (IMDM) + FBS (10%) + L-glutamina pochodzenia niezwierzęcego (1 mM) + aminokwasy endogenne (NEAA, 1%) + penicylina/streptomycyna (1%) + β-merkaptoetanol (0,1 mM) + zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF, dodawany świeży podczas karmienia, 10 ng / ml) + kwas askorbinowy (dodawany na świeżo podczas karmienia, 50 μg / ml).
3. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 12 ml pożywki do przeprogramowywania. Odpipetować pipetą 2 ml zawiesiny komórek na każdą studzienkę do 6-dołkowej płytki komórek zasilających (jak przygotowano w sekcji 3). Odwirować płytkę o masie 50 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
4. Umieść płytkę w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C (5%_O2, 5% CO₂ i 90% N₂) do wzrostu. Zmieniaj pożywkę przeprogramowującą co drugi dzień, aż zaczną pojawiać się kolonie iPSC (1-2 tygodnie).
5. Przygotowanie pożywki hESC: DMEM/F12 1:1 + wymiana surowicy nokautującej (20%) + penicylina/streptomycyna (1%) + NEAA (1%) + L-glutamina pochodzenia niezwierzęcego (1 mM) + pirogronian sodu (1%) + wodorowęglan sodu (0,12%) + β-merkaptoetanol (0,1 mM) + bFGF (dodawany świeży przy karmieniu, 10 ng/ml)
6. Przygotować inhibitory HDAC: maślan sodu (dodany świeży podczas karmienia, 100 μM), kwas suberanilohydroksaminowy (SAHA, dodany świeży podczas karmienia, 200 nM). Po pojawieniu się kolonii iPSC zacznij karmić komórki pożywką hESC + inhibitorami HDAC, zmieniając pożywkę każdego dnia.
   UWAGA: Maślan sodu to mała cząsteczka, która jest adsorbowana w plastikowych rurkach, dlatego należy ją przechowywać w probówce ze szkła borokrzemianowego w temperaturze 4 °C.

5. Izolowanie klonów iPSC

1. Gdy kolonie iPSC są wystarczająco duże, aby można je było wyizolować (20-25 komórek), należy je pobrać za pomocą pipety P20.
2. Przygotowanie inhibitorów HDAC: maślan sodu (dodawany świeży przy karmieniu, 100 μM), SAHA (dodawany świeży podczas karmienia, 200 nM)
3. Umieść izolowane kolonie na iMEF w indywidualnych szalkach o średnicy 35 mm zawierających pożywkę hESC + inhibitory HDAC + suplement do klonowania i odzyskiwania.
4. Dzień po zerwaniu rodzin należy zmienić pożywkę na pożywkę na pożywkę hESC + inhibitory HDAC.
5. Zmieniaj pożywkę codziennie, aż kolonie iPSC będą gotowe do pasażowania.
6. Usunąć inhibitory HDAC z pożywki, gdy kolonie ustabilizują się w pasażu 2-3.

Results

Trzy dni po nukleofekcji i przed posiewem komórek nukleofekcji na iMEF, skuteczność udanej nukleofekcji powinna być oszacowana za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej dla eGFP. Rycina 1 przedstawia typowy eksperyment z nukleofekcją, w którym około 5-10% całej populacji komórek wykazuje ekspresję eGFP.

Przeprogramowane kolonie iPSC zaczną pojawiać się około dwa tygodnie po nukleofekcji. Kolonie są na ogół okrągłe z dobrze zdefiniowanymi granicami i można je zidentyfikować na pod...

Discussion

Aby pomyślnie wygenerować iPSC podczas korzystania z tego protokołu, należy wziąć pod uwagę kilka ważnych zastrzeżeń. Na etapie ekspansji erytroblastów należy ściśle przestrzegać harmonogramu wymiany pożywki, ponieważ odchylenia mogą prowadzić do nieefektywnej stymulacji docelowej populacji komórek progenitorowych i niższej efektywności wytwarzania iPSC. Ważne jest, aby przy każdej zmianie podłoża wytwarzać nową pożywkę ekspansywną ze świeżym deksametazonem; a podłoże bazowe QBSF-60 i deksametazon należy chronić przed św...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque PLUS	Fisher Scientific	45-001-750	Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Przed użyciem ogrzać do temperatury pokojowej.
DPBS	Life Technologies	14190-250	Przechowywać pod adresem 4 & st. C.
RPMI 1640	Life Technologies	11875-093	Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
płodowa surowica bydlęca (FBS)	Life Technologies	10437028	Sklep w temperaturze -20 & deg; C, dopóki nie będzie potrzebny. Rozmrozić, podwielokrotność, przechowywać w temperaturze 4 °C.
dimetylosulfotlenek (DMSO)	Sigma-Aldrich	154938	Przechowywać w temperaturze pokojowej.
QBSF-60 podłoże bez surowicy	Fisher Scientific	50-983-234	Przechowywać w temperaturze 4 stopni C.
penicylina/streptomycyna	Life Technologies	15140122	Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Zestaw nukleofektorów linii komórkowej V	Lonza	VCA-1003	Przechowywać w temperaturze 4 & st. C.
2% roztwór żelatyny	Sigma-Aldrich	G1393	Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C, upłynnić w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem.
Hank's Balanced Saline Solution (HBSS)	Life Technologies	14175-103	Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11965-092	Sklep pod adresem 4 °C.
Zmodyfikowany Iscove's Dulbecco's Medium (IMDM)	Life Technologies	12440-061	Sklep pod adresem 4 & st. C.
L-glutamina, 200 mM	Life Technologies	25030-081	Aliquot, zamrażać w temperaturze -20 & C.
aminokwasy endogenne (NEAA), 100X	Life Technologies	11140-050	Przechowywać w 4 & stopni; C, z dala od światła.
DMEM/Ham's F12, 1:1	Fisher Scientific	SH30023.02	Przechowywać w temperaturze 4 & stopni C.
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	Podwielokrotność, zamrażać w temperaturze -20 stopni C.
pirogronian sodu, 100 mM	Life Technologies	11360-070	Przechowywać w temperaturze 4 stopni C.
Wodorowęglan sodu, 7,5%	Life Technologies	25080094	Przechowywać w temperaturze 4 stopni C.
podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)	Life Technologies	PHG0263	Wytwarzać 10 mg/ml zapasu w DPBS, podwielokrotnie, zamrażać w temperaturze -20 & stopni C. Po rozmrożeniu przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Maślan sodu	Sigma-Aldrich	B5887-1G	Wytwarzaj 2000x zapas (400 mM) w DPBS, podwielokrotność, zamrażanie w temperaturze -20 & st. C. Po rozmrożeniu przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Klonowanie komórek hES i Suplement regeneracyjny	Stemgent	01-0014-500	Przechowywać w temperaturze -20 ° C, dopóki nie będzie potrzebny. Po rozmrożeniu przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Certyfikat ESC BD matrigel	BD Biosciences	35-4277	Rozmrozić przez noc na lodzie w temperaturze 4 & stopni; C, podwielokrotność do wstępnie schłodzonych probówek za pomocą wstępnie schłodzonych końcówek pipet. Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C, dopóki nie będzie potrzebny. Rozmrażanie w 4 & stopni; C, zużyć natychmiast.
Rozpiętość łodygi SFEM	STEMCELL Technologies	9650	Podwielokrotność, zamrażać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
kwas askorbinowy, sproszkowany	Sigma-Aldrich	A4403-100MG	Zrobić 5 mg/ml bulionu w DPBS, sterylny filtr, przechowywać w temperaturze 4 stopni C.
rekombinowany czynnik ludzkich komórek macierzystych (SCF)	R & D Systems	255-SC-010	Marka 100 μ g/m zapas w SFEM, podwielokrotność, zamrażanie w temperaturze -20 °C. Po rozmrożeniu przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
rekombinowana ludzka interleukina 3 (IL-3)	R & D Systems	203-IL-010	Produkcja 100 μ g/ml zapasu w SFEM, podwielokrotność, zamrażać w temperaturze -20 °C. Po rozmrożeniu przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
erytropoetyna (EPO)	R & D Systems	287-TC-500	Zrobić 1000 U/ml zapasu w SFEM, podwielokrotność, zamrozić w temperaturze -20 & deg;C. Po rozmrożeniu przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
rekombinowany ludzki insulinopodobny czynnik wzrostu 1 (IGF-1)	R & D Systems	291-G1-200	Marka 100 μ g/ml zapasu w SFEM, podwielokrotność, zamrażać w temperaturze -20 °C. Po rozmrożeniu przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
β-merkaptoetanol	Sigma-Aldrich	M7522	Wyprodukuj 1000x zapas (100 mM) w DPBS.
deksametazon	Sigma-Aldrich	D4902-25MG	Make 50x kolba (50 μ M) w DPBS, sterylny filtr, przechowywać w temperaturze 4 °C.
SAHA (vorinostat)	Cayman Chemical	149647-78-9	Zrobić 2,000x zapas (400 mM) w DPBS, podwielokrotność, zamrozić w temperaturze -20 & stopni C. Po rozmrożeniu przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
12-dołkowa płytka do hodowli tkankowej	Fisher Scientific	08-772-29
15 ml probówka stożkowa	Sarstedt	62553002
1,5 ml Probówka Eppendorfa	Fisher Scientific	05-408-129
6-dołkowa płytka do hodowli tkankowej	Fisher Scientific	08-772-1B
Płytki hodowlane tisue 35 mm	BD Biosciences	353001
Jednorazowe pipety serologiczne 10 ml	Fisher Scientific	13-675-20
Jednorazowe pipety serologiczne 5 ml	Fisher Scientific	13-675-22
Jednorazowe pipety serologiczne 2 ml	Fisher Scientific	13-675-17
20 μ l końcówki do pipet, końcówki barierowe	Genessee	24-404
szklane pipety Pasteura	Fisher Scientific	13-678-20D
pipet	Fisher Scientific	13-681-15
pCXLE-hOCT3/4-shp53-F	Addgene	27077
pCXLE-hSK	Addgene	27078
pCXLE-hUL	Addgene	27080
pCXLE-EGFP	Addgene	27082
pCXWB-EBNA1	Addgene	37624