Artykuł metodologiczny

Nieinwazyjny model neuropatogennego zakażenia Escherichia coli u nowonarodzonego szczura

13.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52018

⸱

29 października 2014

 ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, University College London, 2Mucin Biology Group, University of Gothenburg

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisana jest procedura przeprowadzania infekcji ogólnoustrojowej u noworodka szczura za pomocą kultur Escherichia coli K1. Ten nieinwazyjny zabieg pozwala na kolonizację przewodu pokarmowego, translokację patogenu do krążenia ogólnoustrojowego oraz inwazję ośrodkowego układu nerwowego w splocie naczyniówkowym.

Streszczenie

Badanie interakcji między zwierzęcym gospodarzem a patogenem bakteryjnym ma sens tylko wtedy, gdy zastosowany model infekcji odtwarza główne cechy naturalnej infekcji. Protokół ten opisuje procedury ustalania i oceny zakażenia ogólnoustrojowego wywołanego neuropatogennym Escherichia coli K1 u nowonarodzonego szczura. Kolonizacja przewodu pokarmowego prowadzi do rozprzestrzeniania się patogenu wzdłuż przebiegu infekcji jelitowo-limfatyczno-krwiowo-mózgowej, a model wykazuje silną zależność od wieku. Szczep E. coli O18:K1 o zwiększonej zjadliwości dla nowonarodzonego szczura wytwarza wyjątkowo wysokie wskaźniki kolonizacji, translokacji do komory krwi i inwazji opon mózgowych po przejściu przez splot naczyniówkowy. Podobnie jak u człowieka, przenikaniu do ośrodkowego układu nerwowego towarzyszy miejscowy stan zapalny i niezmiennie śmiertelny wynik. Model ten okazał się przydatny w badaniach nad mechanizmem patogenezy, w ocenie interwencji terapeutycznych oraz w ocenie zjadliwości bakterii.

Wprowadzenie

Ogólnoustrojowe infekcje bakteryjne są głównym zagrożeniem dla dobrego samopoczucia i przeżycia noworodka; wcześniaki są szczególnie narażone. Bakteryjne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych u noworodków (NBM), często związane z posocznicą bakteryjną, nadal stanowi istotne źródło śmiertelności i zachorowalności w ciągu pierwszych kilku tygodni życia, a problem pogarsza ciągła ewolucja oporności na leki przeciwbakteryjne pierwszego rzutu1,2. Przypadek NBM to nagły przypadek medyczny, który niesie ze sobą duże obciążenie medyczne, społeczne i ekonomiczne3; W związku z tym istnieje pilne zapotrzebowanie na nowe metody leczenia, a w szczególności na nowatorskie strategie profilaktyczne w celu zmniejszenia obciążenia związanego z infekcjami. Niektóre cechy NBM są niezwykłe: w krajach rozwiniętych Escherichia coli i paciorkowce grupy B są odpowiedzialne za zdecydowaną większość przypadków, a zdolność tych szczepów do wywoływania NBM jest prawie zawsze związana z obecnością ochronnej kapsułki polisacharydowej, która umożliwia patogenowi uniknięcie procesów rozpoznawania immunologicznego4. Bardzo wysoki odsetek (80 - 85%) neuroinwazyjnych E. coli ulega ekspresji kapsułkiK1 5,6, polimeru kwasu polisialowego połączonego α-2,8, który jest strukturalnie identyczny z modulatorami plastyczności neuronalnejgospodarza 7.

Ocena nowych terapii i profilaktyki dla NBM oraz związanej z nim bakteriemii i sepsy wyraźnie skorzystałaby z solidnego zwierzęcego modelu infekcji, który naśladuje kluczowe cechy choroby u ludzkiego noworodka, w szczególności silną zależność od wieku i naturalną drogę infekcji. Dostępna jest szeroka gama modeli Gram-dodatniego i Gram-ujemnego bakteryjnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych8,9, które znacznie poszerzyły naszą wiedzę na temat patogenezy, patofizjologii i możliwości leczenia tych zakażeń. W ten sposób eksperymentalne infekcje u szczurów, myszy, królików i małp wykorzystano do badania zapalenia opon mózgowych zarówno u noworodków, jak i dorosłych. Jednak wiele z tych modeli wykorzystuje bezpośrednie wstrzykiwanie bakterii do wnętrza lub podskórnie w celu zainicjowania infekcji, tworząc sztuczną patogenezę poprzez ominięcie naturalnych procesów rozprzestrzeniania się z miejsca kolonizacji. W niektórych przypadkach te metody inokulacji doprowadziły do znaczących zmian w patologii; na przykład podskórne podawanie szczepów E. coli K1 znosiło zależność od wieku związaną z naturalną infekcją, powodując bakteriemię i inwazję ośrodkowego układu nerwowego (OUN) zarówno u noworodków, jaki dorosłych. Predyspozycja do E. coli NBM jest krytycznie zależna od pionowego przenoszenia czynnika sprawczego z matki na dziecko w momencie urodzenia lub wkrótce po urodzeniu11. Bakterie E. coli K1 pochodzenia matczynego kolonizują przewód pokarmowy noworodków11-13, który jest bezpłodny po urodzeniu, ale szybko nabywa złożoną mikrobiotę14. U skolonizowanych noworodków bakterie E. coli K1 mają zdolność przemieszczania się ze światła jelita do krążenia ogólnoustrojowego przed dostaniem się do OUN przez bariery krew-mózg lub krew-płyn mózgowo-rdzeniowy9,15. Projektowanie solidnych modeli eksperymentalnych infekcji powinno uwzględniać te szczegóły.

Chociaż myszy były powszechnie wykorzystywane do badania niektórych form bakteryjnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych8, nie nadają się do badań nad infekcjami noworodków: są przytłoczone infekcją ogólnoustrojową i nie wykazują silnej zależności wiekowej charakterystycznej dla ludzkich niemowląt16. Ponadto α-defensyny, kluczowe peptydy przewodu pokarmowego zapewniające ochronę przed ogólnoustrojową inwazją E. coli K117, są silnie eksprymowane w komórkach Panetha i neutrofilach u ludzi i szczurów, ale nie u myszy18. Istnieje niezwykły stopień duplikacji, redundancji i heterogeniczności w mysich genach defensyny i pokrewnych genów kryptydyny, których nie stwierdzono u innych zwierząt19. Nowonarodzony szczur został początkowo wykorzystany przez Moxona i współpracowników20 do zbadania patogenezy zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych Haemophilus influenzae po inokulacji donosowej, replikując naturalne miejsce kolonizacji tego patogenu noworodka u człowieka, a następnie przystosowany do zależnej od wieku bakteriemii E. coli K1 i zapalenia opon mózgowych. Bortolussi i wsp.21 osób stosowało dootrzewnowe wstrzyknięcie inokulum bakteryjnego w celu zainicjowania infekcji, ale kluczowe badanie Glode i współpracowników22 wykorzystywało doustne karmienie żołądkiem, aby zrównolegle do naturalnej drogi infekcji po kolonizacji przewodu pokarmowego. Ponieważ zgłębnik żołądkowy może uszkodzić powierzchnię błony śluzowej, procedura została udoskonalona tak, aby obejmowała podawanie inokulum noworodkom23. W tym miejscu opisano metodę kolonizacji przewodu pokarmowego i procedury śledzenia infekcji u podatnych szczeniąt szczurów; Dodatkowo omówiono terapeutyczne i profilaktyczne zastosowania modelu.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzone w tym badaniu były zgodne z krajowym i europejskim ustawodawstwem i zostały zatwierdzone przez Komitet Etyczny UCL School of Pharmacy oraz brytyjskie Ministerstwo Spraw Wewnętrznych (HO). Wszystkie prace zwierzęce prowadzone były na podstawie licencji projektowych HO PPL 80/2243 i PPL 70/7773.

1. Przygotowanie szczura

  1. Przeprowadzaj wszystkie eksperymenty in vivo na noworodkach szczurów Wistar wolnych od patogenów.
  2. Trzymaj wszystkie mioty szczurów (12 noworodków na kolonię) w indywidualnych klatkach z ich matkami w okresie laktacji (9-11 tygodniowe samice), w optymalnych warunkach (19 - 21 °C, 45 - 55% wilgotności, 15 - 20 wymian powietrza/godz. i 12 godzin cyklu jasnego/ciemnego).

2. Przygotowanie komórek bakteryjnych

  1. Zapasy E. coli K1 należy przechowywać w 20% (v/v) glicerolu w temperaturze -80 °C. W każdym eksperymencie należy umieścić bakterie wyjściowe na płytkach agarowych Muellera-Hintona (MH) i inkubować w temperaturze 37 °C O/N.
  2. Dzień przed karmieniem zaszczepić 10 ml bulionu MH pojedynczą kolonią E. coli K1 i kulturą O/N w temperaturze 37 °C, 200 obr./min. Jako kontrolę zanieczyszczenia pożywki przygotować 10 ml niezaszczepionego bulionu MH i inkubować w temperaturze 37 °C przy 200 obr./min.
  3. Przenieść 100 μl zawiesiny bakteryjnej O/N do 9,9 ml bulionu MH (1:100 v/v) i inkubować w temperaturze 37 °C, 200 obr./min, aż do osiągnięcia środkowej fazy wykładniczej, odpowiadającej gęstości optycznej 0,6 mierzonej przy długości fali 600 nm (OD600).

3. Karmienie noworodków szczurów E. coli K1

  1. Delikatnie trzymaj zwierzę pionowo jedną ręką od karku, pozwalając na otwarcie pyska. Powoli włożyć sterylną końcówkę pipety do pyska zwierzęcia i odpipetować 20 μl inokulum (~37 °C) do pyska zwierzęcia w ciągu 30 sekund. Zwróć zwierzę matce natychmiast po karmieniu.
  2. Sprawdzić, czy 4 - 8 x 106 bakterii zostało podanych każdemu szczeniakowi poprzez seryjne rozcieńczanie inokulum w PBS i plamienie na płytkach agarowych MH.

4. Ocena kolonizacji przez E. coli K1

  1. Delikatnie trzymaj zwierzę jedną ręką od karku. Zwilż sterylny wacik z bawełnianą końcówką w sterylnym PBS, a następnie delikatnie przetrzyj obszar okołoodbytniczy. Zwierzę należy zwrócić matce natychmiast po pobraniu wymazu.
  2. Umieść końcówkę wacika w probówce zawierającej 300 μl sterylnego PBS i przechowuj na lodzie.
  3. Określ liczbę żywotnych bakterii przez seryjne rozcieńczanie w PBS i posiew na płytkach agarowych MacConkey.
  4. Określ żywotną E. coli K1 za pomocą testu wrażliwości bakteriofagów. Pobrać pojedynczą kolonię za pomocą sterylnej pętli mikrobiologicznej, zanurzyć w 200 μl sterylnego PBS, a następnie poddać mieszaniu wirowemu.
  5. Za pomocą sterylnej pętli mikrobiologicznej należy przeprowadzić subkulturę na agarze MH w linii prostej. Pozostawić płytkę do wyschnięcia na 30 sekund, a następnie odpipetować 10 μl bakteriofaga K1E (109 jednostek tworzących płytkę nazębną/ml (PFU/ml)) na środek linii. Inkubować płytkę O/N w temperaturze 37 °C.
  6. Następnego dnia zbadaj płytkę pod kątem lizy za pośrednictwem bakteriofagów.

5. Ocena ciężkości choroby

  1. Oceniaj stopień zaawansowania choroby każdego zwierzęcia 4-5 razy dziennie, korzystając z siedmiopunktowego systemu punktacji przedstawionego w tabeli 1.
  2. Jeśli zwierzę uzyska ≥3 na 7 punktów, natychmiast je ubój, aby zminimalizować cierpienie. Zapisz zwierzę jako martwe.

6. Eutanazja noworodków szczurów i pobieranie krwi

  1. Delikatnie trzymaj zwierzę w jednej ręce, odsłaniając głowę i szyję. Zdezynfekuj szyję zwierzęcia, przecierając wacikiem nasączonym alkoholem. Zdezynfekuj dużą parę nożyczek przy użyciu 70% etanolu, a następnie spłucz w sterylnym PBS w celu usunięcia śladowych ilości etanolu.
  2. Delikatnie trzymaj zwierzę bezpośrednio nad szalką Petriego. Odetnij głowę noworodkowi za pomocą ostrych nożyczek chirurgicznych, upewniając się, że krew kapie na szalkę Petriego. Unikać kontaktu z głową, aby zapobiec zanieczyszczeniu krwi florą skórną.
  3. Natychmiast pobrać krew za pomocą sterylnej pipety i wymieszać z solą sodową heparyny o stężeniu 20 - 50 jednostek/ml w probówce mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml.
  4. Określ liczbę żywotnych bakterii przez seryjne rozcieńczanie w PBS i posiew na płytkach agarowych MacConkey. Określ liczbę żywotnych E. coli K1, badając podatność żywych bakterii na bakteriofaga K1E.

7. Sekcja

  1. Po ścięciu głowy nowonarodzonemu szczurowi należy zastosować warunki aseptyczne w celu wycięcia i pobrania interesujących go tkanek. Umyj wszystkie narzędzia (pokazane na rysunku 1) w 70% etanolu i sterylnym PBS.
  2. Oczyść deskę sekcyjną i całkowicie zwilż brzuch 70% etanolem. Ułóż zwłoki na plecach i przymocuj do deski sekcyjnej poprzez (i) przypięcie lewej tylnej nogi do stołu operacyjnego sterylną igłą, (ii) rozciągnięcie zwłok i przypięcie prawej przedniej nogi do stołu operacyjnego, (iii) przypięcie prawej tylnej nogi i lewej przedniej nogi do stołu operacyjnego.
  3. Przeciągnij skórę wzdłuż lewej strony podbrzusza za pomocą kleszczy, a następnie przetnij wzdłuż lewej strony zwłok od podbrzusza do mostka za pomocą małych nożyczek preparacyjnych.
  4. Rozciągnij wycięcie w poprzek mostka, a następnie w dół po prawej stronie zwłok od mostka do podbrzusza za pomocą kleszczy i małych nożyczek preparacyjnych, upewniając się, że żadna z leżących poniżej struktur nie jest uszkodzona.
  5. Na koniec delikatnie pociągnij płat skóry od mostka do podbrzusza za pomocą zakrzywionych kleszczy preparacyjnych tęczówki, aby odsłonić otrzewną.
  6. Delikatnie podnieś otrzewną kleszczami i przetnij pionowo, aby odsłonić narządy wewnętrzne, upewniając się, że żaden z leżących poniżej narządów nie jest uszkodzony.

8. Zbieranie przewodu GI

  1. Zidentyfikuj żołądek, jelito cienkie, jelito ślepe, okrężnicę i krezkowy układ limfatyczny.
  2. Wyjmij żołądek, delikatnie przecinając z obu stron, a następnie umieść w biżu zawierającym 1,6 ml sterylnego PBS za pomocą sterylnych kleszczyków.
  3. Przeciąć okrężnicę w odbytnicy. Ostrożnie wyciągnij całą masę jelitową ze zwłok za pomocą kleszczy preparacyjnych i umieść na sterylnej szalce Petriego. Upewnij się, że odbywa się to delikatnie, aby struktura jelitowa i krezkowe struktury limfatyczne nie rozdzielały się.

9. Oddzielenie przewodu pokarmowego od krezkowego układu limfatycznego (Rysunek 2)

  1. Wlać 30 ml sterylnego PBS na szalkę Petriego, upewniając się, że przewód pokarmowy jest całkowicie zanurzony.
  2. Zidentyfikuj centralną masę krezkowego układu limfatycznego i uszczypnij za pomocą drobnych kleszczy preparacyjnych. Zidentyfikuj najbardziej proksymalną część jelita cienkiego i uszczypnij za pomocą cienkich kleszczy preparacyjnych.
  3. Powoli pociągnij centralną masę krezkowego układu limfatycznego i dystalne jelito cienkie w przeciwnych kierunkach, aż obie tkanki zostaną całkowicie oddzielone od siebie. Wykonuj ten proces ostrożnie, aby upewnić się, że jelito cienkie nie jest rozciągnięte, ponieważ uniemożliwia to powtarzalne gromadzenie się obszarów proksymalnych, środkowych i dystalnych. Umieścić krezkowy układ limfatyczny w 300 - 500 μl sterylnego PBS i umieścić na lodzie.

10. Podział przewodu pokarmowego

  1. Przeciąć przewód pokarmowy w jelicie ślepym, aby oddzielić jelito cienkie od okrężnicy.
  2. Umieścić okrężnicę w 300 - 500 μl sterylnego PBS i umieścić na lodzie.
  3. Zbierz reprezentatywne tkanki z bliższych, środkowych i dystalnych obszarów jelita cienkiego. Wyrównaj jelito cienkie od środka.
  4. Następnie (i) zbierz ostatnie 2 cm tkanki przed kątem jako dystalne jelito cienkie, (ii) zbierz tkankę od 5 - 7 cm powyżej punktu środkowego jako bliższe jelito cienkie i (iii) zbierz tkankę od 3 - 5 cm poniżej punktu środkowego jako środkowego jelita cienkiego.

11. Zbieranie wątroby

  1. Zidentyfikuj trzy płaty wątroby szczura po usunięciu żołądka.
  2. Odciągnij płaty od jamy brzusznej za pomocą drobnych kleszczy preparacyjnych.
  3. Usuń wątrobę, przecinając wszelkie przyczepiające się więzadła za pomocą cienkich nożyczek. Umieścić wątrobę w 300 - 500 μl sterylnego PBS i umieścić na lodzie.

12. Zbieranie śledziony

  1. Zidentyfikuj śledzionę.
  2. Odciągnij śledzionę od żołądka i cienkimi nożyczkami przeciąć więzadło żołądkowo-śledzionowe.
  3. Umieść śledzionę w 300 - 500 μl sterylnego PBS i umieść na lodzie.

13. Pobieranie nerek

  1. Zidentyfikuj nerki, które staną się widoczne z tyłu jamy brzusznej po usunięciu przewodu pokarmowego i innych narządów.
  2. Przeciąć moczowody i wszelkie przyczepiające się więzadła za pomocą cienkich nożyczek preparacyjnych i usunąć nerki za pomocą cienkich kleszczy. Usuń nadnercza i wszelki materiał tłuszczowy (jeśli nadal jest przyczepiony) za pomocą cienkich kleszczy i nożyczek preparacyjnych.
  3. Umieścić obie nerki w sterylnym PBS o pojemności 300-500 μl i umieścić na lodzie.

14. Kolekcjonowanie mózgu

  1. Po ścięciu głowy trzymaj głowę w pozycji pionowej za pomocą zakrzywionych kleszczy. Ściśnij skórę na czubku głowy wzdłużnie za pomocą innego zestawu zakrzywionych kleszczy i wykonaj nacięcie za pomocą cienkich nożyczek do preparowania. Odetnij pozostałą skórę w pobliżu szyi, ponownie wzdłuż cienkimi nożyczkami do preparowania.
  2. Pociągnij skórę w kierunku zewnętrznym za pomocą cienkich kleszczy po obu stronach, aby odsłonić czaszkę i usuń płaty skóry za pomocą cienkich nożyczek preparacyjnych. Umieść cienkie nożyczki preparacyjne w otworze kręgosłupa i wykonaj nacięcie wzdłuż czaszki w kierunku mównicy.
  3. Pociągnij obie części czaszki w kierunku zewnętrznym za pomocą cienkich kleszczy. Wytnij, aby usunąć segmenty czaszki.
  4. Usuń mózg za pomocą szerokich kleszczy, wykonując ruch nabierania w górę od otworu kręgosłupa w kierunku mównicy. Umyj mózg w PBS dwa razy, aby usunąć krew z procedury dekapitacji.

15. Przetwarzanie i homogenizacja tkanek

  1. W przypadku eksperymentów wymagających zliczania żywotności lub ekstrakcji DNA, umieść tkanki w probówkach zawierających sterylny PBS. Natychmiast określ liczbę żywotnych bakterii poprzez seryjne rozcieńczanie w PBS i posiew na płytkach agarowych MacConkey lub przechowuj w temperaturze -20 °C z 20% glicerolem przez krótki czas. W celu ekstrakcji DNA należy przechowywać tkanki w temperaturze -20 °C.
  2. W przypadku doświadczeń wymagających ekstrakcji RNA, należy umieścić tkanki w odpowiednich objętościach roztworu RNAlater (10 μl na 1 mg tkanki), a następnie natychmiast przechowywać w temperaturze -20 °C do krótkotrwałego przechowywania lub w temperaturze -80 °C przez długi czas.
  3. W przypadku eksperymentów wymagających obrazowania należy umieścić tkanki w 10 ml roztworu metakarnu (60% metanolu, 30% chloroformu i 10% kwasu octowego), a następnie przechowywać w temperaturze pokojowej (20 - 25 °C) przez okres do 3 tygodni.
  4. Obliczyć masę tkanki przez porównanie masy probówek przed i po dodaniu tkanek. Homogenizuj tkanki za pomocą homogenizatora. Umyć homogenizator raz w 70% etanolu i dwa razy w sterylnym PBS pomiędzy homogenizacją każdej próbki.
    UWAGA: Wiązanie metakarnu jest pożądane do wiązania próbek jelitowych w celu zachowania struktur obronnych błony śluzowej związanych z mucyną; Utrwalanie formaliny może być stosowane w przypadku tkanek ogólnoustrojowych.

Wyniki

Opisany tutaj model infekcji systemowej E. coli K1 odzwierciedla wiele cech naturalnej infekcji u ludzi. Bakterie są przyjmowane do organizmu, kolonizują przewód pokarmowy, a następnie przedostają się do krwi poprzez węzły chłonne krezkowe, zanim wywołają chorobę specyficzną dla konkretnych narządów z towarzyszącym zapaleniem mózgu24. Co istotne, model ten wykazuje silną zależność od wieku; jak pokazano na Rysunku 3, dwudniowe (P2) szczątka szczurze są wysoce podatne na chorobę inwazyjną, jednak w okresie siedmiu dni zwierzęta stają się stopniowo bardziej odporne na infekcję, choć nie na kolonizację przewodu pokarmowego17. Po przedostaniu się z miejsca kolonizacji przewodu pokarmowego do krwi, bakterie można zwizualizować w próbkach krwi za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Rysunek 4) przed ich wniknięciem do ośrodkowego układu nerwowego, głównie poprzez splot naczyniowy25. U niektórych zwierząt obserwuje się rozległą inwazję innych głównych narządów, takich jak płuca, śledziona i nerki25.

Liczba bakterii w tkankach może znacznie różnić się między poszczególnymi szczeniętami25, jednak gdy obciążenie bakteryjne ocenia się w kategoriach obecności lub braku, odnotowuje się wysoki stopień powtarzalności w odniesieniu do inwazji narządowej. Przy miocie 12 szczeniąt jako pojedynczej kohorcie testowej, obliczenia mocy z użyciem oprogramowania G* Power wykazały, że taka wielkość próby odpowiada 98,6% prawdopodobieństwu wykrycia efektu w oparciu o przeżywalność przy użyciu sześciu zwierząt z kohorty i >99% prawdopodobieństwu, jeśli uwzględni się wszystkie dwanaście osobników. Model ten jest zatem odpowiedni do oceny nowych środków specjalnie opracowanych do leczenia noworodkowych zakażeń bakteryjnych i został wykorzystany w procedurze oceny potencjału terapeutycznego depolimerazy kapsułowej EndoE, która selektywnie usuwa kapsułę K1 z powierzchni bakterii24-26. Może on być również stosowany do badania interakcji gospodarz-bakteria, które wpływają na patogenezę neuropatogenów E. coli; w tym kontekście został wykorzystany do badań kolonizacji i rozprzestrzeniania się E. coli A192PP. Wykazano, że komórki E. coli A192PP utrzymują się w przewodzie pokarmowym szczeniąt w dniach P2, P5 i P9 w dużych liczbach; aspekty czasowe kolonizacji w tych trzech grupach były bardzo podobne (Rysunek 5) i odzwierciedlają zdolność bakterii do replikacji oraz utrzymywania gęstości populacji w jelitach.

Zjadliwość izolatu klinicznego A192 została zwiększona poprzez seryjne pasażowanie u noworodków szczurów, aby zapewnić minimalną lub zerową redundancję w wykorzystaniu zwierząt. E. coli A192 kolonizowała noworodki szczurów w wieku P2 ze 100% wydajnością, wywoływała bakteremię u 35% zwierząt i wywierała efekt letalny w 25% przypadków27. Pasażowana pochodna A192PP kolonizuje przewód pokarmowy, wywołuje bakteremię i powoduje letalność u wszystkich szczeniąt P2. Tym samym model ten może być wykorzystany do badania zjadliwości różnych szczepów K1 pod kątem ich zdolności do naciekania OUN i innych układów narządowych z miejsca kolonizacji. W tym kontekście Pluschke i współpracownicy23 wykorzystali model infekcji noworodków szczurów, aby określić zdolność 95 szczepów E. coli K1 pochodzenia ludzkiego do wywoływania bakteremii po kolonizacji jelit; zaobserwowali oni znaczne różnice w wydajności zarówno kolonizacji, jak i zdolności inwazyjnej, co potwierdza klonalny charakter neuropatogenów E. coli K1.

Konfiguracja laboratoryjna do przygotowania próbek; widoczne pipeta, fiolki, szalki Petriego, waga.
Rycina 1. Materiały do pobierania tkanek: (A) waga analityczna, (B) wcześniej odważone probówki zawierające niezbędne media, (C) stół operacyjny, linijka i igły do unieruchomienia zwierzęcia, (D) 70% (v/v) etanol i PBS do sterylizacji sprzętu do pobierania tkanek, (E) zestaw do pobierania tkanek obejmujący duże nożyczki do dekapitacji oraz nożyczki, pęsety i ostrza o różnych rozmiarach i kształtach, (F) lód do konserwacji tkanek, (G) 70% (v/v) etanol do sterylizacji stołu operacyjnego i otoczenia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Disekcja nicienia pasożytniczego; instruktaż laboratoryjny krok po kroku przedstawiający ekstrakcję organów w trzech panelach.
Rycina 2. Oddzielenie przewodu pokarmowego i krezkowego układu limfatycznego. (A) Chwyć centralną masę krezkowego układu limfatycznego za pomocą precyzyjnej pęsety do dyssekcji. (B) Chwyć proksymalną część jelita cienkiego i pociągnij w przeciwnych kierunkach. (C) Przewód pokarmowy i krezkowy układ limfatyczny zostaną całkowicie oddzielone. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres analizy przeżywalności; procent przeżywalności w funkcji dni po inokulacji; wiele grup badawczych.
Rycina 3. Przeżywalność noworodkowych szczurów w wieku od dwóch dni (P2) do dziewięciu dni (P9) po doustnym podaniu E. coli A192PP, ilustrująca silną zależność infekcji systemowej od wieku. Każda grupa obejmuje 24 noworodki.

Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej komórek; analiza wzbudzenia; schemat z paskami skali 2μm.
Rycina 4. Obrazy fluorescencyjne komórek E. coli A192PP w rozmazie krwi z szczeniaka P2 zainfekowanego po doustnym podaniu bakterii. Antygen O lipopolisacharydu na powierzchni bakterii wybarwiono poliklonalnym przeciwciałem króliczym anty-O18 oraz wtórnym przeciwciałem kozim anty-króliczym sprzężonym z Alexa546. Kapsułę K1 zwizualizowano za pomocą odczynnika EndoE-GFP. Praktycznie wszystkie bakterie wykryte w próbkach krwi posiadały ochronną kapsułę K1. Obrazy zostały wykonane przez dr Andreę Zelmer. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres wzrostu bakterii, CFU w funkcji czasu; analiza w skali logarytmicznej godzin po inokulacji, zaznaczono LOD.
Rycina 5. E. coli A192PP kolonizacja jelit po podaniu inokulum bakteryjnego. DNA wyekstrahowano z całego jelita, a liczbę jednostek tworzących kolonie/g (CFU/g) tkanki E. coli K1 określono za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) celującej w gen polysialylotransferazy (neuS), zgodnie z opisem zamieszczonym w innym opracowaniu17. LOD: granica wykrywalności.

CechaZdrowyNiezdrowy
Kolor skóryRóżowyBlady/żółty
Zwinność (odruch prostowania)Szczupień natychmiast zawraca po umieszczeniu go tyłemTrudności w odwracaniu kierunku rozmieszczenia (> 3 s) lub nie jest w stanie osiągnąć
Delikatny ucisk brzuchaBrak dźwiękuDźwięk mieszania
Linia żołądkowo-mlecznaWidoczne i białeNiewidoczny
TemperaturaCiepłyStosunkowo zimny*
MasaPrzyrost masy ciała o 1,5–2 g na dobęBrak przyrostu lub spadku masy ciała
Zachowanie po umieszczeniu w klatceKieruje się w stronę matki i zaczyna żywićNie może poruszać się w stronę matki i wykazuje trudności w karmieniu

Tabela 1. Siedmiopunktowy system oceniania: Pierwsze trzy wymienione oceny to zazwyczaj pierwsze zaobserwowane objawy. *Noworodki z infekcją systemową wykazują podwyższoną temperaturę ciała (> 2 °C). Jednak ze względu na brak sprawności zwierząt umożliwiający dotarcie do matki w celu utrzymania temperatury ciała, chore zwierzęta mogą zostać oddzielone od lęgu i być zimne w dotyku.

Dyskusja

Opisany tutaj model zwierzęcy opiera się na wcześniejszych pracach, które miały na celu odtworzenie istotnych cech naturalnie występujących infekcji u ludzi. Nowonarodzone szczury zostały początkowo wykorzystane do badania zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych niemowląt wywołanego przez H. influenzae typu b, ponieważ gatunek ten spełniał kluczowe kryteria solidnego modelu infekcji. W związku z tym brama wejścia danego czynnika chorobotwórczego powinna odzwierciedlać bramę naturalnego zakażenia człowieka i w sposób powtarzalny powodować podobną patologię trwającą wystarczająco długo, aby umożliwić interwencję terapeutyczną. Zastosowane techniki nie powinny ograniczać możliwości zastosowania procedury i nie powinny przyczyniać się do uzyskania wyniku choroby20. Model zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych H. influenzae u niemowląt szczurów opracowany przez Moxona i współpracowników spełnia te kryteria20; Naturalna infekcja następuje po kolonizacji błon śluzowych górnych dróg oddechowych i ta ważna cecha została odtworzona u młodych szczurów poprzez nietraumatyczne wkroplenie bakterii na błony przewodów nosowych. Co ważne, zależny od wieku charakter infekcji został odtworzony w modelu.

Ta sama grupa była również pierwszą, która opracowała nieinwazyjny model E. coli K1 NBM u nowonarodzonego szczura22. Wolne od patogenów młode Sprague-Dawley zostały skolonizowane przez karmienie 10,8 do 10,10 bakterii przez doustną sondę żołądkową; Inokulum było więc znacznie wyższe niż to, które stosowaliśmy my. Kolonizacja trzema badanymi szczepami K1, C94 (O7:K1:H-), EC3 (O1:K1:H-) i LH (O75:K1:H3), wystąpiła u stosunkowo wysokiego odsetka (48-74%) zwierząt karmionych K1, ale częstość występowania bakteriemii, zapalenia opon mózgowych i śmiertelności była zmienna i znacznie niższa niż wskaźniki kolonizacji. Klonalny charakter eksperymentalnego zakażenia E. coli K1 został ustalony później23 i obecnie jest oczywiste, że tylko serotypy O18:K1 i, w mniejszym stopniu, O7:K1 są w stanie konsekwentnie powodować zakażenie ogólnoustrojowe. Z tego powodu badania patogenezy neuropatogennej E. coli K1 oparto na zastosowaniu szczepu A192PP O192PP wzmocnionego zjadliwością. Porównanie żywienia E. coli K1 noworodków przez sondę żołądkową, stosowanej przez Glode i współpracowników22, z metodą podawania kropelkami zastosowaną przez grupęAchtmana 23 ujawniło nadmierną liczbę zgonów przy użyciu pierwszej metody, prawie na pewno z powodu uszkodzenia powierzchni błony śluzowej przez sondę żołądkową. Ponieważ tempo kolonizacji jest porównywalne z tymi dwiema metodami, zaleca się stosowanie mniej inwazyjnej metody karmienia bakterii za pomocą pipety ze sterylną końcówką, jak opisano w niniejszym komunikacie.

Szczep E. coli A192PP używany w naszych badaniach to O18:K1. Jest to bardziej zjadliwa pochodna klinicznego szczepu E. coli A192, który został pierwotnie odzyskany od pacjenta z posocznicą27. Zwiększoną zjadliwość szczepu uzyskano poprzez seryjne przejście przez nowonarodzone szczury26. Szczep wywołuje zależną od wieku nasilenie choroby, ze 100% bakteriemią i śmiertelnością, gdy jest podawany2-dniowym zwierzętom 28. Natomiast 9-dniowe zwierzęta są całkowicie odporne na choroby. Bakteriofag lityczny specyficzny dla K1 może być stosowany do odróżniania E. coli K1 od innych szczepów E. coli 29. W tym badaniu wrażliwość żywych bakterii na bakteriofaga K1E powinna być wykorzystana do (i) sprawdzenia czystości zawiesin E. coli K1 przygotowanych do karmienia zwierząt oraz (ii) odróżnienia E. coli K1 od innych bakterii z grupy coli w celu obliczenia żywotności w wymazach okołoodbytniczych, próbkach krwi i tkanek. Jeśli kolonia to E. coli K1, będzie podatna na lizę bakteriofaga K1E, a wzrost bakterii zostanie zahamowany w miejscu inokulacji bakteriofagów. Jeśli kolonia nie jest E. coli K1, będzie odporna na lizę bakteriofagów KIE, a w miejscu inokulacji bakteriofagów powinien znajdować się obszar wzrostu bakterii. Należy pamiętać, że modele zwierzęce nie są w stanie odzwierciedlić wszystkich cech naturalnie występującej choroby. Obecny model może być modyfikowany w celu zbadania charakterystyki wirulencji bakterii neuropatogennych innych niż E. coli A192PP i można uwzględnić różnice w wielkości inokulum kolonizującego. Przyszłe zastosowania tej techniki mogą obejmować ocenę bardzo potrzebnych leków do leczenia tego schorzenia oraz odkrycie szczegółów odpowiedzi gospodarza na kolonizację i inwazję tkanek.

Opisana tutaj metoda jest prosta, ale skuteczna. Pojedyncze mioty liczące od 10 do 12 szczeniąt zostały wykorzystane jako grupy testowe lub kontrolne, a to podejście wewnątrzmiotowe zapewnia wysoki stopień powtarzalności i trafności statystycznej. Konieczne jest, aby młode wróciły do swoich biologicznych matek tak szybko, jak to możliwe po każdym zabiegu, a mioty nie powinny zatem składać się ze zwierząt poddawanych różnym interwencjom. Ważne jest, aby karmione inokulum było ogrzane, w przeciwnym razie młode odrzucą oferowaną kulturę. Młode szybko rozwijają złożoną mikrobiotę i w ciągu dwóch dni od urodzenia przewód pokarmowy zostaje skolonizowany przez szeroką gamę bakterii z gromady, które są najliczniejszymi drobnoustrojami w jelitach niemowlęcia i dorosłego człowieka. Młode, które nie były karmione E. coli A192PP, nie są nosicielami E. coli K1 w przewodzie pokarmowym17 , a więc określenie tempa kolonizacji jest stosunkowo proste. Jednak metoda qPCR oparta na neuS do wykrywania kolonizacji E. coli K1 jest znacznie bardziej czuła niż tradycyjne metody hodowli i jest zdecydowanie zalecana17.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty badawcze G0400268 i MR/K018396/1 od Rady Badań Medycznych oraz przez Action Medical Research. Dalszego wsparcia udzielił National Institute for Health Research University College London Hospitals Biomedical Research Centre.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szczury Wistar wolne od patogenów (12 x noworodki, 1 x matka karmiająca)figure-materials-1 Harlan, UK
E. coli K1 A192PPfigure-materials-2 Taylor labMushtaq et al. 2004
Bakteriofag K1Efigure-materials-3 Taylor labMushtaq et al. 2004
Glicerolfigure-materials-4 Sigma, UKG5516
Agar Mueller-Hintonfigure-materials-5 Oxoid, UKCM0037
Bulion Mueller-Hintonfigure-materials-6 Oxoid, UKCM0405
Agar MacConkeyfigure-materials-7 Oxoid, UKCM0007
Bufor fosforanowy (PBS)figure-materials-8 Sigma, UKP4417
Etanol 100%figure-materials-9 Sigma, UKE7023
Sól sodowa heparynyfigure-materials-10 Sigma, UK84020Przygotować 20 - 50 units/ml
Roztwór RNAlaterfigure-materials-11 Sigma, UKR090110 μl/mg tkanki
Kwas octowyfigure-materials-12 Sigma, UK320099
Chloroformfigure-materials-13 Sigma, UKC2432
Metanolfigure-materials-14 Sigma, UK322415
Tampony z bawełnianym końcemfigure-materials-15 Fisher Scientific, UK11542483
Tampony Alcotipfigure-materials-16 Scientific Laboratory Supplies, UKSWA1000
Szalki Petriegofigure-materials-17 Sigma, UKP5856
Uniwersalna probówka 30 mlfigure-materials-18 AlphaLaboratories, UKCW3890
Probówki do mikrocentryfugi 0,5 mlfigure-materials-19 StarLab, UKI1405-1500
Probówki do mikrocentryfugi 1,5 mlfigure-materials-20 StarLab, UKI1415-1000
Kalibrowane pętlaki 0,1 μlfigure-materials-21 StarLab, UKE1412-0112
Rozprowadzacze w kształcie litery Lfigure-materials-22 StarLab, UKE1412-1005
Kuwetyfigure-materials-23 Fisher Scientific, UK10594175
Pinceta prosta z cienkimi końcamifigure-materials-24 Fisher Scientific, UK12780036
Pinceta prosta z tępymi końcamifigure-materials-25 Fisher Scientific, UK12391369
Zakrzywiona pinceta zegarmistrzowska z bardzo cienkimi końcamifigure-materials-26 Fisher Scientific, UK12740926
Nożyczki proste z bardzo cienkimi końcamifigure-materials-27 Fisher Scientific, UK12972055
Nożyczki laboratoryjnefigure-materials-28 VWR, UKUSBE4251
Igły do strzykawek 25 Gfigure-materials-29 Greiner Bio-One LtdN2525
Spektrofotometry UV/Vis LAMBDA 25figure-materials-30 PerkinElmer, UKL60000BB
Inkubator UnitempB&T, UKOP958
Inkubator wytrząsowy Multitronfigure-materials-31 INFORS HT, UKAJ118
Homogenizator Ultra-Turrax T-10figure-materials-32 IKA Werke0003737000

Bibliografia

  1. Harvey, D., Holt, D. E., Bedford, H. Bacterial meningitis in the newborn: a prospective study of mortality and morbidity. 23 (5), 218-225 (1999).
  2. Brouwer, M. C., Tunkel, A. R., van de Beek, D. Epidemiology diagnosis, and antimicrobial treatment of acute bacterial meningitis. Clin. Microbiol. Rev. 23 (3), (2010).
  3. Silva, L. P. A., Cavalheiro, L. G., Queirós, F., Nova, C. V., Lucena, R. Prevalence of newborn bacterial meningitis and sepsis during the pregnancy period for public health care system participants in Salvador, Bahia, Brazil. J. Infect. Dis. 11 (2), 272-276 (2007).
  4. Levy, O. Innate immunity of the newborn: basic mechanisms and clinical correlates. Nat. Rev. Immunol. 7 (5), 379-390 (2007).
  5. Robbins, J. B., et al. Escherichia coli K1 capsular polysaccharide associated with neonatal meningitis. N. Eng. J. Med,, et al. 290 (22), 1216-1220 (1974).
  6. Korhonen, T. K., et al. hemolysin production, and receptor recognition of Escherichia coli strains associated with neonatal sepsis and meningitis. Infect. Immun. 48 (2), 486-491 (1985).
  7. Rutishauser, U. Polysialic acid in the plasticity of the developing and adult vertebrate nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 9 (1), 26-35 (2008).
  8. Koedel, U., Pfister, H. W. Models of experimental bacterial meningitis. Infect. Dis. Clin. North Am. 13 (3), 549-577 (1999).
  9. Tunkel, A. R., Scheld, W. M. Pathogenesis and pathophysiology of bacterial meningiits. Clin. Microbiol. Rev. 6 (2), 118-136 (1993).
  10. Kim, K. S., et al. The K1 capsule is the critical determinant in the development of Escherichia coli meningitis in the rat. J. Clin. Invest. 90 (3), 897-905 (1992).
  11. Obata-Yasuoka, M., Ba-Thein, W., Tsukamoto, T., Yoshikawa, H., Hayashi, H. Vaginal Escherichia coli share common virulence factor profiles, serotypes and phylogeny with other extraintestinal E. coli. Microbiology. 148 (9), 2745-2752 (2002).
  12. Sarff, L. D., et al. Epidemiology of Escherichia coli K1 in healthy and diseased newborns. Lancet. 305 (7916), 1099-1104 (1975).
  13. Schiffer, M. S., et al. A review: relation between invasiveness and the K1 capsular polysaccharide of Escherichia coli. Pediatr. Res. 10 (2), 82-87 (1976).
  14. Palmer, C., Bik, E. M., DiGuilio, D. B., Relman, D. A., Brown, P. O. Development of the human infant intestinal microbiota. PLoS Biol. 5 (7), 1556-1573 (2007).
  15. Nassif, X., Bourdoulous, S., Eugène, E., Couraud, P. O. How do extracellular pathogens cross the blood-brain barrier. Trends Microbiol. 10 (5), 227-232 (2002).
  16. Moxon, E. R., Glode, M. P., Sutton, A., Robbins, J. B. The infant rat as a model of bacterial meningitis. J. Infect. Dis. 136, 186-190 (1977).
  17. Birchenough, G. M. H., et al. Altered innate defenses in the neonatal gastrointestinal tract in response to colonization by neuropathogenic Escherichia coli. Infect. Immun. 81 (9), 3264-3275 (2013).
  18. Ganz, T. Defensins: antimicrobial peptides of innate immunity. Nat. Rev. Immunol. 3 (9), 710-720 (2003).
  19. Bevins, C. L., Salzman, N. H. Paneth cells, antimicrobial peptides and maintenance of intestinal homeostasis. Nat. Rev. Microbiol. 9 (5), 356-368 (2011).
  20. Moxon, E. R., Smith, A. L., Averill, D. R., Smith, D. H. Haemophilus influenzae meningitis in infant rats after intranasal inoculation. J. Infect. Dis. 129 (2), 154-162 (1974).
  21. Bortolussi, R., Ferrieri, P., Björkstén, B., Quie, P. G. Capsular K1 polysaccharide of Escherichia coli: relationship to virulence in newborn rats and resistance to phagocytosis. Infect. Immun. 25 (1), 293-298 (1979).
  22. Glode, M. P., Sutton, A., Moxon, E. R., Robbins, J. B. Pathogenesis of neonatal Escherichia coli meningitis: induction of bacteremia and meningitis in infant rats fed E. coli K1. Infect. Immun. 16 (1), 75-80 (1977).
  23. Pluschke, G., Mercer, A., Kusećek, B., Pohl, A., Achtman, M. Induction of bacteremia in newborn rats by Escherichia coli K1 is correlated with only certain O (lipopolysaccharide) antigen types. Infect. Immun. 39 (2), 599-608 (1983).
  24. Zelmer, A., et al. Administration of capsule-selective endosialidase E minimizes changes in organ gene expression induced by experimental systemic infection with Escherichia coli K1. Microbiology. 156 (7), 2205-2215 (2010).
  25. Zelmer, A., et al. Differential expression of the polysialyl capsule during blood-to-brain transit of neuropathogenic Escherichia coli K1. Microbiology. 154 (8), 2522-2532 (2008).
  26. Mushtaq, N., Redpath, M. B., Luzio, J. P., Taylor, P. W. Prevention and cure of systemic Escherichia coli K1 infection by modification of the bacterial phenotype. Antimicrob. Agents Chemother. 48 (1), 1503-1508 (2004).
  27. Achtman, M., et al. Six widespread bacterial clones among Escherichia coli K1 isolates. Infect. Immun. 39 (1), 315-335 (1983).
  28. Mushtaq, N., Redpath, M. B., Luzio, J. P., Taylor, P. W. Treatment of experimental Escherichia coli. infection with recombinant bacteriophage-derived capsule depolymerase. J. Antimicrob. Chemother. 56 (5), 160-165 (2005).
  29. Gross, R. J., Cheasty, T., Rowe, B. Isolation of bacteriophages specific for the K1 polysaccharide antigen of Escherichia coli. J. Clin. Microbiol. 6 (6), 548-550 (1977).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Noworodkowy model szczuraEscherichia coli K1podanie doustnewymaz oko oanodowypobieranie tkanekoznaczanie ywotno cianaliza qPCRmikroskopia fluorescencyjnarozcie czenia seryjneagar MacConkeya
Nieinwazyjny model neuropatogennego zakażenia Escherichia coli u nowonarodzonego szczura
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.