Analiza przebudowy nerwowo-naczyniowej w organotypowych kulturach entorhino-hipokampowych plastrów

Podsumowanie

Przedstawiono protokół dla organotypowych kultur entorhino-hipokampowych, który pozwala na odtworzenie wielu aspektów niedokrwiennego uszkodzenia mózgu. Badając zmiany układu nerwowo-naczyniowego oprócz zmian w neuronach, protokół ten jest wszechstronnym narzędziem do badania zmian plastycznych w tkance nerwowej po urazie.

Streszczenie

Niedokrwienne uszkodzenie mózgu jest jednym z najczęstszych i najbardziej wyniszczających stanów zagrażających prawidłowemu funkcjonowaniu mózgu i często prowadzi do utrzymujących się deficytów funkcjonalnych u dotkniętych nim pacjentów. Pomimo intensywnych wysiłków badawczych nadal nie ma skutecznej opcji leczenia, która zmniejszałaby uszkodzenie neuronów i chroniła neurony w obszarach niedokrwionych przed opóźnioną wtórną śmiercią. Badania w tej dziedzinie zazwyczaj obejmują wykorzystanie skomplikowanych i problematycznych modeli zwierzęcych. Organotypowe hodowle warstwowe entorhino-hipokampa z deprywacją tlenu i glukozy (OGD) są tworzone in vitro, które naśladują niedokrwienie mózgu. Nowatorskim aspektem tego badania jest to, że oprócz zmian neuronalnych badane są zmiany naczyń krwionośnych mózgu, a reakcja zarówno przedziału neuronalnego, jak i przedziału naczyniowego może być porównywana i korelowana. Metody przedstawione w niniejszym protokole znacznie poszerzają potencjalne zastosowania podejścia opartego na organotypowej hodowli plastrów. Sama indukcja OGD lub hipoksja może być zastosowana dość prostymi środkami w organotypowych kulturach plastrów i prowadzi do wiarygodnych i powtarzalnych uszkodzeń tkanki nerwowej. Stoi to w jaskrawym kontraście ze skomplikowanymi i problematycznymi eksperymentami na zwierzętach wywołującymi udar i niedokrwienie in vivo. Poszerzenie analizy o badanie reakcji układu krwionośnego może dostarczyć nowych sposobów na zachowanie i przywrócenie funkcji mózgu. Przedstawione tutaj podejście oparte na hodowli warstw może stać się atrakcyjnym i ważnym narzędziem do badania niedokrwiennego uszkodzenia mózgu i może być przydatne do testowania potencjalnych środków terapeutycznych mających na celu neuroprotekcję.

Wprowadzenie

Ośrodkowy układ nerwowy jest szczególnie wrażliwy na utratę lub zmniejszenie dopływu tlenu i glukozy przez układ naczyniowy. Nawet dość krótka przerwa w dopływie krwi do mózgu może wywołać trwałą utratę funkcji odpowiednich obszarów mózgu, prowadząc do typowych zespołów udaru. Oprócz utraty neuronów w pierwotnych obszarach dotkniętych chorobą, zazwyczaj występuje dodatkowa opóźniona utrata neuronów poprzez wtórne uszkodzenie. Niestety, do tej pory nie było dostępnego leczenia neuroprotekcyjnego w celu zmniejszenia wtórnej śmierci neuronów¹. Wysiłki badawcze mające na celu zbadanie mechanizmów wtórnego uszkodzenia opierają się na wykorzystaniu zwierzęcych modeli niedokrwienia mózgu, takich jak niedrożność tętnicy środkowej mózgu i różne techniki zakrzepowej niedrożności (niedawny przegląd patrz²). Równolegle, również ze względu na ograniczenia i obawy etyczne związane z wykorzystaniem modeli zwierzęcych, zastosowano organotypową hodowlę plastrów różnych tkanek OUN, które umożliwiają badanie reakcji neuronalnych na różnego rodzaju urazy^3-5.

Do badania reakcji neuronalnej w warunkach naśladujących niedokrwienne uszkodzenie mózgu, opracowano modelowy system deprywacji tlenu glukozy (OGD). W tym modelu kultury warstwowe są tymczasowo wystawione na działanie pożywki, która nie zawiera glukozy i została zrównoważona z gazowym azotem przy braku tlenu. Dzięki takiemu leczeniu możliwe jest wywołanie uszkodzenia i utraty neuronów, które są raczej podobne do obserwowanych po uszkodzeniu niedokrwiennym in vivo^{6, 7}. W hipokampie takie leczenie indukuje utratę neuronów specyficznie w CA1, ale nie w obszarze CA3 lub zakręcie zębatym hipokampa. W przeciwieństwie do tego, badania nad reakcjami naczyniowymi w kulturach plastrów nie były do tej pory szeroko prowadzone. Oczywistym powodem jest brak krążenia i perfuzji naczyń krwionośnych w modelu hodowli plastrów. Jednak wykazaliśmy wcześniej, że możliwe jest utrzymanie naczyń krwionośnych w kulturach warstwowych OUN przez kilka dni^{8, 9}.

Ogólnym celem tej metody jest nie tylko monitorowanie losu neuronów po OGD, ale także rozszerzenie badania na los i przebudowę układu krwionośnego, co jest ważną częścią reakcji na uraz. Do tej pory takie badania wymagały stosowania doświadczeń na zwierzętach (De Jong i in., 1999; Cavaglia i wsp., 2001). W przedstawionym tutaj protokole szczegółowo opiszemy, w jaki sposób takie badania można przeprowadzić w organotypowych kulturach warstw entorhino-hipokampa, którym poddawano się niedotlenieniu lub zmianom ekscytotoksycznym, a następnie analizie zarówno przeżycia neuronów, jak i reakcji naczyń krwionośnych. Protokół ten opiera się na wcześniej opublikowanym badaniu na ten temat¹⁰ i może być przydatny dla każdego laboratorium zainteresowanego interakcjami nerwowo-naczyniowymi w OUN.

Protokół

Doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Dyrektywą Rady Wspólnot Europejskich z 22 września 2010 roku (2010/63/UE) i zostały zweryfikowane i zatwierdzone przez władze szwajcarskie.

1. Konfiguracja organotypowych kultur entorhino-hipokampowych plastrów

1. Przygotować organotypowe kultury warstwowe entorhino-hipokampa (EHOSC) od młodych myszy w 4. dniu po urodzeniu (P4) przy użyciu metody inkubacji statycznej^4,11. Tutaj użyj myszy C57Bl6 i CB6F1.
   1. Poświęć około 30 minut na młode myszy na przygotowanie kultur plastrowych, tj. 3 godziny na miot 6 młodych myszy. Wszystkie kroki należy wykonywać w sterylnych warunkach na stole warsztatowym z przepływem laminarnym ze sterylizowanymi narzędziami chirurgicznymi.
   2. Aby uniknąć możliwej ingerencji w położenie plasterka wzdłuż osi przegrodowo-skroniowej, należy używać wyłącznie wycinków hipokampa w połowie przegrody. Jeśli nie zaznaczono inaczej, wykonaj wszystkie czynności w RT.
2. Odetnij głowę szczeniaka myszy P4 nożyczkami chirurgicznymi. Na tym etapie nie jest wymagane znieczulenie.
   1. Usuń czaszkę wokół mózgu i zidentyfikuj szczelinę między ogonowym końcem półkul mózgowych a śródmózgowiem. Ostrożnie usuń część mózgu od śródmózgowia do śródmózgowia z czaszki i umieść ją w lodowatym pożywce składającej się z MEM uzupełnionego stabilizowaną formą L-glutaminy.
3. Kontynuuj sekcję pod mikroskopem stereoskopowym z mózgiem zanurzonym w lodowatym pożywce przygotowawczej. Usuń pozostałe opony mózgowe z półkul korowych. Zidentyfikuj hipokamp na przyśrodkowej powierzchni ogonowej półkuli i oddziel go wraz z sąsiednią korą śródwęchową od pozostałej części mózgu.
   1. Przenieś tkankę do rozdrabniacza tkanek i pokrój plastry o grubości 400 μm w warunkach aseptycznych, poprzecznie do osi przegrodowo-skroniowej hipokampa.
4. Umieścić plastry na wkładkach do hodowli komórkowych (około 6 plastrów na wkładkę) i inkubować je na płytkach 6-dołkowych z 1 ml pożywki inkubacyjnej na dołek (47 ml MEM, 25 ml Eagle Medium, 25 ml surowicy końskiej, 1 ml glutamax I, 1 ml sterylnego 10% roztworu glukozy, pH 7,3) w wilgotnej atmosferze z 5% CO₂ w temperaturze 37 °C. Zmienić pożywkę następnego dnia, a następnie co drugi dzień do 1 tygodnia.

2. Niedotlenienie in vitro i deprywacja tlenu i glukozy z reperfuzją

1. Dokładny harmonogram zabiegu znajduje się w Tabeli 1. Hodowla EHOSC przez 5 dni (DIV5) przed ekspozycją na niedotlenienie lub OGD. W tym momencie należy zmienić pożywkę z pożywki inkubacyjnej zawierającej 25% surowicy końskiej na pożywkę wolną od surowicy o następującym składzie: Pożywka neurobazalna z 2% suplementem B27, 1% glutamax i dodatkowym 0,1% glukozy.
2. Przygotować pożywkę OGD zgodnie z opisem w Bibliografii 7 . Końcowe stężenia składników będą następujące: 0,3 mM CaCl₂, 70 mM NaCl, 5,25 mM NaHCO₃, 70 mM KCl, 1,25 mM NaH₂PO₄, 2 mM_MgSO4 i 10 mM sacharozy przy pH 6,8. Dodać 1 ml pożywki OGD do każdego dołka z dwóch 6-dołkowych płytek do hodowli tkankowych.
   1. Perfundować pożywkę OGD z_N2 przez 1 godzinę w komorze do hipoksji, a następnie uszczelnić i przechowywać O/N w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
   2. Użyj pasków beztlenowych jako wskaźników niedotlenienia. Uznaj, że podłoże jest beztlenowe, gdy kolor pasków zmienił się z różowego na biały.
   3. Do indukcji hipoksji należy użyć pożywki wolnej od surowicy z glukozą zamiast pożywki OGD. Przed użyciem należy perfaktorować pożywkę z_N2 w komorze hipoksji, jak opisano powyżej dla pożywki OGD.
3. Zanim plastry zostaną wystawione na działanie OGD, należy ponownie przetoczyć pożywkę OGD z_N2 przez 30 minut. Dodać 2 μl roztworu jodku propidyny (PI) o stężeniu 1 mg/ml na studzienkę (dla końcowego stężenia 2 μg/ml) do plasterków przez 30 minut i wybierać tylko zdrowe plastry do eksperymentów, na co wskazuje mała liczba komórek PI dodatnich.
4. Należy postępować zgodnie z harmonogramem ekspozycji na OGD i reperfuzji wskazanym na rysunku 1. Pozbawić plastry samego tlenu (hipoksja) lub tlenu i glukozy (OGD) przez 15 minut.
   1. W celu indukcji hipoksji lub OGD przenieś plastry do pożywki OGD i trzymaj przez 15 minut w komorze hipoksji. Upewnij się, że wszystkie płyny, które pozostały po bokach wkładki, zostały odessane po przełączeniu kultur ze zwykłej pożywki na pożywkę OGD i z powrotem.
   2. Po niedotlenieniu lub OGD zastąpić pożywkę OGD natlenioną pożywką wolną od surowicy i pozostawić hodowle do regeneracji przez 3, 24 lub 48 godzin w pożywce wolnej od surowicy w zwykłym inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂ . Dodaj PI ponownie przed utrwaleniem w celu określenia śmierci komórki.

3. Leczenie farmakologiczne organotypowych kultur warstwowych entorhino-hipokampa

1. Hodowla EHOSC przez 5 dni (DIV5) w pożywce inkubacyjnej przed ekspozycją na leczenie farmakologiczne. Leczenie farmakologiczne należy rozpocząć w trakcie OGD lub bezpośrednio po OGD, gdy plastry są przenoszone do pożywki wolnej od surowicy.
2. Zabiegi chroniące przed OGD.
   1. Dodać 100 μM 6-cyjano-7-nitrochinoksalino-2,3-dionu (CNQX) lub 1 μM tetrodotoksyny (TTX) do pożywki podczas indukcji OGD (przez 15 min) lub bezpośrednio po indukcji OGD przez 30 min. Następnie inkubować w pożywce wolnej od surowicy normoksycznej przez 48 godzin przed utrwaleniem.
3. Leczenie indukcji śmierci ekscytotoksycznej.
   1. Po 5 dniach w pożywce inkubacyjnej zmienić kultury na pożywkę wolną od surowicy zawierającą 100 μM (RS)-α-amino-3-hydroksy-5-metylo-4-izoksazolopropionowego kwasu (AMPA) na 30 min.
   2. Usunąć pożywkę hodowlaną zawierającą AMPA przez aspirację (należy uważać, aby usunąć wszelkie pozostałości pożywki z wkładek), a następnie przenieść plastry na świeże płytki z normalną pożywką wolną od surowicy i przechowywać je przez 48 godzin do utrwalenia.

4. Utrwalenie i barwienie immunologiczne organotypowych kultur warstwowych entorhino-hipokampa

1. Barwienie jodkiem propidyny (PI).
   1. Dodawać PI przez 30 minut do pożywki z żywych wycinków o stężeniu 2 μg/ml. Oglądaj żywe kultury za pomocą odwróconego mikroskopu wyposażonego w optykę fluorescencyjną i wybierz wycinki do dalszych zabiegów. W przypadku barwienia PI w połączeniu z immunohistochemią, należy dodać roztwór PI 30 minut przed utrwaleniem kultur.
2. Utrwalenie plastrów.
   1. Usunąć pożywkę hodowlaną z płytki 6-dołkowej i dodać 3 ml świeżo przygotowanego 4% paraformaldehydu (PFA) do każdej studzienki. Następnie umieścić płytkę 6-dołkową w lodówce i ustabilizować O/N w temperaturze 4 °C.
   2. Następnego dnia usuń roztwór PFA i umyj plastry 3-4 razy solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
3. Usunięcie wycinków z wkładki do hodowli komórkowej i procedura blokowania immunohistochemii swobodnie pływających skrawków.
   1. Ostrożnie oderwij i usuń plastry z wkładek kulturowych za pomocą pędzla artystycznego o rozmiarze 0 lub mniejszym. Przenieś każdą pojedynczą cząstkę do dołka na 96-dołkowej płytce wypełnionej buforem blokującym (PBS z 3% normalną surowicą kozią (NGS) i 2% Triton-X100). Przechowywać plastry w buforze blokującym przez 2 godziny w temperaturze pokojowej pod stałym mieszaniem za pomocą wytrząsarki orbitalnej.
4. Barwienie immunologiczne kultur plastrów
   1. Do znakowania naczyń krwionośnych należy użyć poliklonalnej antylamininy w rozcieńczeniu 1:200 w PBS zawierającym 1% NGS i 0,5% Triton-X100.
   2. Do znakowania neuronów należy użyć białka związanego z antymikrotubulami 2 (MAP2) w rozcieńczeniu 1:500 w PBS zawierającym 1% NGS i 0,5% Triton-X100.
   3. Inkubować plastry z pierwszorzędowymi przeciwciałami przez 48 godzin w temperaturze 4 °C przy stałym mieszaniu. Po okresie inkubacji umyj je w PBS z 0,5% Triton-X100 3-4 razy.
   4. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w stosunku 1:500 w PBS zawierającym 1% NGS i 0,5% Triton-X100. Inkubuj plastry przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem Alexa. Użyj odpowiedniego koziego przeciwciała anty-królika lub kozy anty-myszy sprzężonego z Alexa 350 lub 488.
   5. Usunąć roztwór przeciwciała drugorzędowego i przemyć plastry trzykrotnie solą fizjologiczną buforowaną Tris (TBS); zamontować je na szkiełkach podstawowych i nakryć szkiełka preparatami Mowiol.
5. Mikroskopia barwionych plastrów
6. Zobacz wybarwione plastry albo pod standardowym mikroskopem ze sprzętem do epifluorescencji, albo za pomocą mikroskopu konfokalnego. Rób zdjęcia odpowiednim aparatem. W przypadku niektórych obrazów należy odwrócić kontrast fluorescencji, aby uzyskać ciemne zabarwione naczynia na jasnym tle (ryc. 5 i 6).

5. Określanie regionalnego zagęszczenia naczyń w kulturach

1. Określić ilościowo gęstość statku na podstawie przekroczeń statku, jak opisano w pozycji referencyjnej 8.
2. Do tych pomiarów użyj plastrów barwionych na lamininę. Na nagrane obrazy o 10-krotnym powiększeniu nałożyć siatkę 6 x 6, gdzie każda siatka jest równa 100 x 100 μm na kwadrat, całkowite pole 0,25 mm².
3. Nałóż na siebie trzy takie siatki w regionie CA1, CA3, DG i EC (Rysunek 2). Policz statki przecinające linie siatki.
4. Aby uzyskać wyniki o dobrej istotności statystycznej, wykonaj pomiary w co najmniej 3 niezależnych eksperymentach, z których każdy zawiera dane z 3 szczeniąt myszy z 3 plasterkami na szczeniak myszy.
5. Określić średnią wartość przekroczeń statków z sieci dla każdego regionu i przeprowadzić analizę statystyczną za pomocą ANOVA z poprawką Bonferroniego jako test post hoc (p<0,05 zdefiniowany jako istotny) przy użyciu odpowiedniego oprogramowania statystycznego.

Wyniki

Pozbawienie tlenu i glukozy oraz hipoksja indukują śmierć neuronów i redukcję naczyń krwionośnych specyficznie w obszarze CA1 hipokampa.
OGD lub samo pozbawienie tlenu przez 15 min wywołało silną indukcję śmierci komórek, co widoczne było w barwieniu jodkiem propidium specyficznie w obszarze CA1 hipokampa (Rycina 3), podobnie jak opisano poprzednio⁷. Przy zastosowaniu markerów do wizualizacji sieci naczyń krwionośnych stwierdzono, że gęstość i organizacja naczyń krwionośnych w wię...

Dyskusja

Dzięki przedstawionym tu metodom, organotypowe kultury plastrów hipokampa mogą być wykorzystywane jako wszechstronne narzędzie do badania zmian plastycznych w tkance nerwowej po urazie. Podczas gdy organotypowe kultury warstw były wykorzystywane w przeszłości do badania reakcji neuronalnych po niedokrwieniu^{6, 7} , nowy aspekt jednoczesnego badania zmian naczyniowych znacznie zwiększa potencjalne zastosowania tej metody. Sama indukcja OGD lub hipoksja może być zastosowana dość prostymi środkami w organotypowych ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Minimum Essential Medium MEM	Gibco	11012-044
Glutamax	Gibco	35050-061	stabilizowana forma L-glutaminy
Wkłady do hodowli komórkowych Millicell	Millipore	PICM03050
Podłoże bazowe Eagle	Gibco	41010-026
Surowica dla koni	Gibco	26050-088
Pożywka neuropodstawowa	Gibco	21103-049
B27 suplement	Gibco	17504-044
Paski anaerobowe	Sigma-Aldrich	59886
Roztwór jodku propidyny	Sigma-Aldrich	P4864
AMPA	R& Systemy D	0169-10
CNQX	R& Systemy D	0190/10
TTX	R& Systemy D	1078/1
poliklonalna antylaminina	Sigma-Aldrich	L9393
anty-MAP2	Abcam	ab11267
Alexa anty-mysie 350	Sondy molekularne	A11045
Alexa anty-mysie 488	Sondy molekularne	A11001
Alexa anty-króliki 350	Sondy molekularne	A11046
Alexa anty-królik 488	Sondy molekularne	A11008
Oprogramowanie statystyczne	Oprogramowanie GraphPad	GraphPad Prism
McIlwain	Ted Pella	10180
Komora hipoksji	Billups-Rothenberg	MIC-101

Rozdrabniacz tkanek