Ilościowy test immunofluorescencyjny do pomiaru zmienności poziomów białek w centrosomach

Centrosomy składają się z pary centrioli otoczonych materiałem okołocentrycznym (PCM). Będąc głównymi centrami organizowania mikrotubul (MTOC) w komórkach ssaków, centrosomy służą jako dwa bieguny wrzecion mitotycznych w dzielących się komórkach, a tym samym pomagają utrzymać integralność genomu¹. W komórkach w stanie spoczynku (np. podczas fazy G0) jedna z dwóch centrioli centrosomu, a mianowicie centriola macierzysta, jest przekształcana w ciało podstawne w celu złożenia rzęski pierwotnej, organelli czuciowej wystającej z powierzchni komórki². Gdy komórki ponownie wejdą w cykl komórkowy, rzęski pierwotne są demontowane, a każda centriola kieruje złożeniem procentriolu na jego bliższym końcu, który stopniowo wydłuża się, tworząc dojrzałą centriolę³. Na początku fazy S na powierzchni każdej istniejącej centrioli tworzy się struktura przypominająca koło wozu, która zapewnia 9-krotną symetrię centrioli, która stanie się podstawą każdej procentiroli. Sas6, który jest niezbędny do montażu centrioli, jest rekrutowany do utworzenia piasty koła wozu^4-6. Inne białka centriolarne są następnie montowane na kole wozu w wysoce regulowany, proksymalny do dystalnego sposób⁷. Po dokładnym zakończeniu duplikacji centrioli komórki gromadzą dodatkowe materiały pericentriolne, aby zbudować dwa funkcjonalne centrosomy pod koniec fazy⁸ G2. Oprócz podstawowych składników centriolarnych^9-11, kilka innych białek, w tym kinazy, fosfatazy, białka opiekuńcze, składniki rusztowania, białka związane z błoną i maszyneria degradacji, są związane z centriolami, ciałami podstawnymi i PCM w różnych momentach cyklu komórkowego^12-16. Często zauważa się, że poziomy centrosomalne wielu białek są czasowo regulowane przez centrosomalne mechanizmy celowania i/lub degradację proteasomalną w centrosomach. Co ważne, wahania poziomu centrosomalnego kilku białek, takich jak Plk4, Mps1, Sas6 i CP110 w różnych punktach cyklu komórkowego, wydają się być kluczowe dla regulacji składania centrioli^5,17-22, a w przypadku Mps1 zapobieganie tej degradacji centrosomalnej prowadzi do powstania nadmiaru centrioli¹⁹. Z drugiej strony frakcje centrosomalne kilku białek są mniej labilne w porównaniu z basenami cytozolowymi. Na przykład regulacja w dół Centrin 2 (Cetn2) za pośrednictwem siRNA doprowadziła tylko do umiarkowanego spadku poziomu białka w centriolach, pomimo znacznego obniżenia poziomu w całych komórkach²³. Dlatego tak ważne jest mierzenie zmian poziomu białek centrosomalnych w centrosomie, a nie mierzenie poziomów białek w całej komórce podczas oceny ich funkcji specyficznych dla centrosomów.

W tym badaniu opracowaliśmy test wykorzystujący immunofluorescencję pośrednią (IIF) do ilościowego określenia względnego poziomu białka w centrosomach. Test ten został opracowany specjalnie do analizy komórek, które pochodzą z różnych próbek, a zatem nie mogą być obrazowane w tym samym czasie. Próbki te mogą być komórkami, które zostały potraktowane różnymi odczynnikami (tj. lek kontra kontrola), zebrane w różnych punktach czasowych (tj. impuls kontra pościg) lub znajdują się w różnych fazach cyklu komórkowego. Zasada tego testu polega na pomiarze skorygowanej intensywności fluorescencji tła odpowiadającej białku w małym regionie i znormalizowaniu tej wartości względem tego samego dla innego białka, którego poziomy nie zmieniają się w wybranych warunkach eksperymentalnych. W kilku badaniach z zakresu biologii centrosomów wykorzystano ostatnio różne techniki mikroskopii ilościowej, zarówno w żywych, jak i utrwalonych komórkach, w celu określenia specyficznej dla centrosomów funkcji białek kandydujących^24-27. Podobnie jak w przypadku tych testów, niniejsza technika mierzy również intensywność fluorescencji badanego białka skorygowaną o tło. Jednak włączenie normalizacji przy użyciu wzorca wewnętrznego do tego testu prawdopodobnie zapewniłoby większą dokładność i pewność w analizie dwóch różnych próbek, które znajdują się na dwóch różnych szkiełkach nakrywkowych. Co więcej, oprócz badania poziomu białka w centrosomach, z niewielkimi korektami, metoda ta może być stosowana do różnych warunków eksperymentalnych lub w innych miejscach komórkowych.

Tutaj łączymy nasz ilościowy test mikroskopowy ze strategią pościgu za impulsami BrdU, aby porównać komórki z różnych etapów cyklu komórkowego. Zamiast używać standardowych technik zatrzymywania i uwalniania cyklu komórkowego do badania różnych punktów czasowych cyklu komórkowego, asynchronicznie rosnące komórki są inkubowane z BrdU w celu znakowania komórek w fazie S, a znakowane komórki są ścigane przez różne czasy (zwykle 4-6 godzin). Większość znakowanych komórek będzie w fazie S bezpośrednio po impulsie. Długość pościgu dobiera się tak, aby po pościgu znakowane komórki znajdowały się w późnym S, G2 lub mitozie, co można zweryfikować za pomocą cech morfologicznych, takich jak położenie centrosomów w stosunku do jąder, odległość między centrosomami, kondensacja chromosomów itp. Zatem długość pościgu zależy od średniego czasu trwania S, Faza G2 i M określonego typu komórki. Ponieważ takie podejście pozwala uniknąć inhibitorów cyklu komórkowego, takich jak hydroksymocznik, afidikolina, nokodazol itp., Pozwala na bardziej fizjologicznie istotną analizę cyklu komórkowego.

Pokazujemy tutaj, że ilościowy test mikroskopii fluorescencyjnej sam w sobie, lub w połączeniu z testem BrdU pulse-chase, jest prostą, ale potężną techniką dokładnego pomiaru względnych zmian w poziomie centrosomalnym białka kandydującego podczas niezakłóconego cyklu komórkowego. Zmierzyliśmy poziom centrosomalny VDAC3, białka, które niedawno zidentyfikowaliśmy w centrosomach oprócz mitochondriów^16,28, za pomocą tych testów. Uzyskane tutaj wyniki potwierdzają naszą wcześniejszą obserwację, że pula centrosomalna VDAC3 jest regulowana przez degradację, a także zmienia się w sposób zależny od cyklu komórkowego¹⁶, co dodatkowo potwierdza możliwość zastosowania tej metody.

1. Hodowla komórkowa

1. Użyj ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z odwrotną transkryptazą telomerazy (hTERT) (hTERT-RPE1; określanych tutaj jako RPE1).
   UWAGA: Komórki RPE1 to prawie diploidalne, nieprzekształcone komórki ludzkie, które są powszechnie używane do badania składania centrioli i ciliogenezy. Komórki te podlegają normalnemu cyklowi duplikacji centrioli skoordynowanemu z regulowanym cyklem komórkowym.
2. Przejście przez prawie zlewające się 100 mm naczynie do hodowli komórkowej komórek RPE1 w rozcieńczeniu 1:5 oryginalnej kultury do świeżej 100 mm pożywki zawierającej 10 ml pożywki DME/F-12 (1:1) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 U/ml penicyliny G i 100 μg/ml streptomycyny (kompletna pożywka jest określana jako pożywka DME/F-12). Hodować komórki w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO_{2 .}
   1. Inkubować okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm w 50 ml 1 N HCl w zakrytej szklanej zlewce, O/N bez wstrząsania, w temperaturze 60 °C w łaźni wodnej lub inkubatorze.
   2. Po odrzuceniu roztworu kwasu, przemyć szkiełka nakrywkowe trzykrotnie w 100 ml wody destylowanej, inkubując przez 15 minut, od czasu do czasu wstrząsając. Powtórz pranie podobnie w 70% etanolu i 95% etanolu.
   3. Wysuszyć szkiełka nakrywkowe, rozprowadzając je pojedynczo na bibułce laboratoryjnej w komorze bezpieczeństwa biologicznego, a następnie sterylizować promieniowaniem UV przez 60 minut.
3. Umieść 2-4 suche szkiełka nakrywkowe w naczyniu do hodowli komórkowych o średnicy 35 mm. Rozcieńczyć roztwór fibronektyny lub polimeru podobnego do fibronektyny (stężenie podstawowe 1 mg/ml) do stężenia 25 μg/ml w PBS hodowli komórkowej.
   1. Umieścić 80-100 μl rozcieńczonego roztworu na każdym szkiełku nakrywkowym i inkubować przez 60 minut, aby pokryć wierzchnią stronę szkiełka nakrywkowego. Umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie za pomocą PBS przed dodaniem pełnego podłoża.

2. Hodowla komórek i leczenie komórek inhibitorami proteasomów

1. Pasaż 2 x 10⁵ asynchronicznie rosnących komórek RPE1 w każdej 35-milimetrowej szalce zawierającej szkiełka nakrywkowe i hodować komórki w 2 ml kompletnej pożywki. Pożywkę należy wymieniać co 24 godziny na świeżą, wstępnie podgrzaną, kompletną pożywkę.
   1. Aby przeanalizować wpływ hamowania proteasomu na poziom centrosomalny badanego białka (w tym przypadku VDAC3 lub γ-tubuliny), należy hodować komórki na dwóch szalkach o średnicy 35 mm przez 44 godziny. Zastąp pożywkę kompletną pożywką i dodaj MG115 lub DMSO jako rozpuszczalnik kontrolny o końcowym stężeniu odpowiednio 5 μM lub 0,05%. W tym samym czasie dodać BrdU do komórek w końcowym stężeniu 40 μM i inkubować komórki przez 4 godziny.
   2. Przenieść każde szkiełko nakrywkowe do płytki 24-dołkowej. Dodać 500 μl schłodzonego metanolu do każdej studzienki i inkubować płytkę w temperaturze -20 °C przez 10 minut w celu utrwalenia komórek na szkiełkach nakrywkowych. Szkiełka nakrywkowe należy natychmiast trzykrotnie zmyć 500 μl buforu do przemywania (1x PBS zawierający 0,5 mM MgCl₂ i 0,05% Triton-X 100).
2. Zebrać pozostałe komórki z szalki o średnicy 35 mm i odwirować komórki w sile 1 000 x g przez 5 minut. Użyj osadu komórkowego do analizy całkowitego białka metodą western blot (krok 6).

3. Test BrdU Pulse i Chase do analizy poziomów białek w różnych fazach cyklu komórkowego

1. Aby przeanalizować zmienność poziomu białka (tutaj VDAC3, Sas6 lub Cep135) w centrosomach w różnych fazach cyklu komórkowego, hoduj komórki na dwóch 35-milimetrowych szalkach zawierających szkiełka nakrywkowe przez 44 godziny. Zastąp pożywkę hodowlaną kompletną pożywką zawierającą 40 μM BrdU i inkubuj komórki przez 4 godziny w inkubatorze do hodowli komórkowych.
2. Z jednego naczynia przenieść szkiełka nakrywkowe na płytkę 24-dołkową w celu utrwalenia komórek za pomocą schłodzonego metanolu, jak opisano w kroku 2.1.2.
3. Po 4-godzinnym impulsie BrdU usuń pożywkę zawierającą BrdU, umyj komórki raz PBS i raz kompletną pożywką, dodaj świeżą pożywkę, a następnie hoduj komórki pod nieobecność BrdU przez różne czasy (zwykle kolejne 4 godziny dla komórek RPE1) przed utrwaleniem komórek zgodnie z opisem w kroku 2.1.2.
   UWAGA: W przypadku komórek RPE1 większość komórek BrdU-dodatnich znajduje się w późnej fazie S lub G2 po 4-godzinnym pościgu. Należy to określić niezależnie dla każdego typu komórki.

4. Barwienie immunologiczne

1. Inkubować utrwalone komórki na szkiełkach nakrywkowych w 200 μl buforu blokującego (2% BSA i 0,1% TritonX-100 w 1x PBS) przez 30 minut.
   1. Inkubować komórki z mieszaniną pierwszorzędowych przeciwciał (zazwyczaj jednego hodowanego u królika, a drugiego hodowanego u myszy) rozcieńczonego w buforze blokującym O/N w temperaturze 4 °C w wilgotnej komorze.
   2. Aby przygotować nawilżoną komorę, umieść mokry ręcznik papierowy w dolnej połowie pustego pudełka na końcówki do pipet o pojemności 1,000 μl. Położyć pasek Parafilmu na powierzchni stojaka i nanieść kropelkę (15-20 μl) roztworu przeciwciała na Parafilm na każde szkiełko nakrywkowe, które ma być inkubowane. Odwrócić szkiełko nakrywkowe na kroplę roztworu przeciwciała (tak, aby komórki były zanurzone) i zamknąć pokrywę pudełka z końcówką.
   3. Ponownie odwróć szkiełka nakrywkowe i włóż je z powrotem do naczynia 24-dołkowego. Umyć szkiełka nakrywkowe, a następnie inkubować je w 150 μl mieszaniny przeciwciał drugorzędowych (tutaj barwnik zielonofluorescencyjny sprzężony z barwnikiem anty-króliczym i barwnik czerwono-fluorescencyjny sprzężony z barwnikiem anty-myszym, rozcieńczony w buforze blokującym) przez 1 godzinę w temperaturze słonecznej. Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy.
      UWAGA: Przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluoroforem są wrażliwe na światło. Chronić próbki przed światłem podczas wykonywania czynności 4.1.3–5.1.2.
2. Przygotować się do barwienia anty-BrdU, ponownie utrwalając wybarwione komórki RPE1 za pomocą 500 μl schłodzonego metanolu w temperaturze -20 °C przez 10 minut, jak opisano w kroku 2.1.2. Umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie.
   UWAGA: To utrwalenie zabezpiecza pierwszorzędowe i wtórne znakowanie przeciwciał białka (białek) będącego przedmiotem zainteresowania podczas procesu hydrolizy kwasowej w następnym etapie.
   1. Inkubować komórki w 200 μl 2 N HCl przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Zneutralizować 300 μl 1 M Tris-Cl, pH 8 i przemyć komórki trzykrotnie za pomocą buforu do przemywania wodą.
   2. Ponownie zablokować komórki za pomocą buforu blokującego o pojemności 200 μl na 30 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Inkubować komórki z szczurzym przeciwciałem anty-BrdU (rozcieńczonym w buforze blokującym) przez 45 minut w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze. Umieścić szkiełka nakrywkowe z powrotem w naczyniu 24-dołkowym, umyć je, a następnie inkubować z przeciwciałem drugorzędowym przeciwko szczurom sprzężonym z barwnikiem niebiesko-fluorescencyjnym (rozcieńczonym w 150 μl buforu blokującego w naczyniu 24-dołkowym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej).
3. Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy. Na szklanym szkiełku mikroskopowym narysować kroplę (około 3-6 μl) roztworu montażowego zawierającego odczynnik zapobiegający blaknięciu. Odwróć szkiełko nakrywkowe, stroną z komórką skierowaną w dół, na roztwór montażowy. Wytrzyj nadmiar płynu, delikatnie dociskając szkiełko nakrywkowe do szkiełka za pomocą miękkiej chusteczki czyszczącej. Nałóż przezroczysty lakier do paznokci wzdłuż krawędzi szkiełka nakrywkowego, aby uszczelnić go na szkiełku mikroskopowym.

5. Akwizycja i analiza obrazu immunofluorescencji

1. Użyj obiektywu zanurzeniowego 100X Plan Apo (z aperturą numeryczną 1.4), aby uzyskać obrazy komórek BrdU-dodatnich RPE1 w temperaturze otoczenia.
   1. Umieść szkiełko na mikroskopie (patrz wyposażenie) dołączonym do aparatu zdolnego do obrazowania cyfrowego. Dla każdego fluoroforu określ odpowiedni czas ekspozycji (zwykle między 300-1,000 ms), ręcznie badając wszystkie próbki eksperymentu. Przed uzyskaniem obrazów komórki należy ręcznie określić odpowiednią górną i dolną płaszczyznę ogniskowej wzdłuż osi Z (zwykle rozmiar kroku 0,2 μm). Uzyskuj obrazy różnych próbek, które znajdują się na oddzielnych szkiełkach nakrywkowych, przy użyciu identycznego czasu naświetlania dla różnych fluoroforów wzdłuż osi Z, korzystając z pakietu oprogramowania do obrazowania mikroskopii cyfrowej.
2. Wykonaj dekonwolucję (w tych przypadkach przy użyciu algorytmu No neighbor) wszystkich stosów obrazów uzyskanych wzdłuż osi Z.
   1. Uzyskaj projekcję całkowitej intensywności każdego stosu obrazów wzdłuż osi Z.
3. W komórkach, w których centrosomy są blisko siebie (odległość między dwoma centrosomami jest mniejsza niż 2 μm), narysuj mały kwadrat (zwykle 20-30 pikseli z każdej strony) wokół obu centrosomów i zaznacz wybrany obszar.
   1. Narysuj większy kwadrat (zwykle 24-35 pikseli na bok) otaczający pierwszy kwadrat i zaznacz zaznaczony obszar dużego kwadratu.
   2. Uzyskaj powierzchnię (A) i całkowitą intensywność fluorescencji (F) każdego fluoroforu w każdym pudełku (S oznacza małe pudełko, a L oznacza duże pudełko).
   3. Przeanalizuj skorygowaną intensywność fluorescencji tła każdego fluoroforu przy użyciu wzoru opisanego przez Howella i wsp. ²⁹: F= F_S – [( F_L– F_S) x A_S /(_{A L} –_{A S})].
   4. Uzyskaj znormalizowaną intensywność fluorescencji interesującego białka (tutaj VDAC3 lub Sas6), obliczając stosunek intensywności fluorescencji skorygowanej o tło jego fluoroforu do intensywności fluoroforu użytego dla wybranego wzorca wewnętrznego (tutaj γ-tubulina, Sas6 lub Cep135).
4. W przypadku analizy komórek, w których centrosomy są dobrze oddzielone (odległość między dwoma centrosomami jest większa niż 2 μm), należy przeanalizować każdy centrosom osobno, rysując dwa oddzielne zestawy pól. Narysuj mały kwadrat (zwykle 15-25 pikseli z każdej strony) wokół każdego centrosomu i zaznacz wybrany obszar. Narysuj większy kwadrat (20-30 pikseli na bok) otaczający pierwszy kwadrat i zaznacz wybrany obszar.
   1. Uzyskać powierzchnię (A) i całkowitą intensywność fluorescencji (F) każdego fluoroforu w każdym pudełku i obliczyć intensywności fluorescencji skorygowane o tło każdego fluoroforu, oddzielnie dla każdego centrosomu, jak opisano w kroku 5.3.3.
   2. Połącz skorygowane w tle intensywności fluorescencji każdego białka z dwóch centrosomów, aby uzyskać całkowity poziom centrosomalny tego białka w tej komórce.
   3. Uzyskaj znormalizowaną intensywność dla białka będącego przedmiotem zainteresowania, obliczając stosunek jego całkowitej intensywności centrosomalnej do całkowitej intensywności centrosomalnej wzorca wewnętrznego.
5. Przeanalizuj co najmniej 15-25 komórek dla każdego warunku eksperymentalnego i narysuj wykres w arkuszu kalkulacyjnym.

6. Analiza całkowitego białka za pomocą Western Blotting

1. Ponownie zawiesić komórki w buforze testu radioimmunoprecypitacji (RIPA) zawierającym 50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 1% deoksycholan sodu, 0,1% dodecylosiarczan sodu (SDS) i inkubować przez 10 minut na lodzie w celu lizy komórek.
   1. Odwirować mieszaninę przy 10 000 x g przez 10 minut, oddzielić lizat od frakcji osadu i zmierzyć całkowite stężenie białka w każdym lizacie za pomocą zestawu do oznaczania kwasu bicinchoninowego (BCA).
2. Wymieszaj 40 μg lizatu z 4x buforem ładującym SDS-PAGE (50 mM Tris-Cl, pH 6,8, 2% SDS, 10% glicerol, 100 mM ditiotreitol, 0,1% błękitu bromofenolowego).
   1. Gotować próbki przez 10 minut i uruchomić je na 12,5% denaturującym SDS-PAGE przy stałym napięciu 200 V.
3. Przenieść białka wydzielone na SDS-PAGE na membranę nitrocelulozową za pomocą techniki western blotting (przy stałym napięciu 90 V przez 1 godzinę w niskiej temperaturze).
   1. Zablokuj błonę 3% beztłuszczowym mlekiem w 1x PBS, a następnie inkubuj błonę z roztworami rozcieńczonych przeciwciał pierwszorzędowych (w tym przypadku króliczej anty-VDAC3, króliczej anty-γ-tubuliny i mysiej anty-α-tubuliny) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   2. Po trzykrotnym umyciu membrany (co 5 minut inkubacji pod wstrząsaniem) przy użyciu buforu PBS-T (1x PBS i 0,2% Tween-20), inkubować membranę w mieszaninie przeciwciał anty-króliczych sprzężonych z barwnikiem fluorescencyjnym bliskiej podczerwieni (IR) i sprzężonych z barwnikiem fluorescencyjnym IR (rozcieńczonych w PBS-T) przez 1 godzinę.
   3. Umyj membranę trzy razy, a następnie zeskanuj membranę, aby przeanalizować pasma za pomocą systemu obrazowania fluorescencyjnego w podczerwieni odpowiedniego do wykrywania immunoblotów.

Nasze ostatnie badania zidentyfikowały nową lokalizację i funkcję centrosomalną VDAC3, jednej z mitochondrialnych porin16,28. Barwienie immunologiczne kilku komórek ssaków, w tym komórek RPE1, przy użyciu przeciwciała specyficznego dla VDAC3, wykazało wyraźne barwienie centrosomalne i stosunkowo słabe barwienie mitochondrialne. Wykazaliśmy również, że centrosomalny VDAC3 jest preferencyjnie związany z macierzystym centriolem, a pula centrosomalna zarówno endogennego, jak i ektopowo wyrażonego VDAC3 jest regulowana przez degradację16. Aby zwalidować ilościowy test IIF, zbadaliśmy zmiany w puli VDAC3 związanej z centrosomami w komórkach znajdujących się w fazie S.

Tutaj, asynchronicznie rosnące komórki RPE1 były traktowane albo inhibitorem proteasomu MG115, albo kontrolnym rozpuszczalnikiem DMSO przez 4 godziny. Aby ograniczyć naszą analizę do komórek, które są w fazie S i przechodzą składanie centrosomów, zbadaliśmy tylko komórki, które zawierały BrdU podczas tych samych 4 godzin i miały dwa blisko rozmieszczone centrosomy (oddalone od siebie w odległości 2 μm). Zbadaliśmy wiele losowych pól komórek barwionych pod kątem BrdU i jąder zarówno z kontroli, jak i leczenia MG115 (Figura 1A), aby stwierdzić, że krótkie leczenie MG115 nie wpłynęło na inkorporację BrdU (około 58%) w porównaniu z leczeniem kontrolnym (około 56%) w komórkach RPE1. Ponieważ porównywaliśmy tylko komórki, które znajdowały się w fazie S (ocenianej na podstawie obecności dwóch ognisk γ-tubuliny oddalonych od siebie w odległości 2 μm), rozważyliśmy γ-tubulinę jako potencjalny wewnętrzny standard normalizacji. Dlatego najpierw sprawdziliśmy, czy poziomy centrosomalnej γ-tubuliny w komórkach BrdU-dodatnich zmieniają się po zahamowaniu proteasomu. Nic dziwnego, że istniała znaczna różnica między komórkami w intensywności fluorescencji γ-tubuliny między komórkami i stwierdziliśmy, że ta zmienność była najlepiej przedstawiona na diagramach pudełkowych i wąsów, które prezentują dostępny zestaw danych jako całość. Na diagramach pudełkowych i wąsów pola reprezentują dolny i górny kwartyl, znacznik w polu wskazuje medianę każdej serii, a wąsy reprezentują wartości minimalne i maksymalne, które często (choć nie zawsze) są wartościami odstającymi. Jak widać na rysunku 1D, poziom centrosomalnej γ-tubuliny nie różnił się znacząco między komórkami BrdU-dodatnimi traktowanymi MG115 lub DMSO, co potwierdza γ-tubulinę jako wewnętrzny standard dla tego eksperymentu. W przeciwieństwie do γ-tubuliny, skorygowana o tło intensywność fluorescencji odpowiadająca centrosomalnemu VDAC3 była około 2,5 razy wyższa w komórkach traktowanych MG115 niż w komórkach kontrolnych (Figura 1C). Kiedy znormalizowaliśmy całkowitą fluorescencję VDAC3 w stosunku do fluorescencji γ-tubuliny, wzrost fałdowania nieznacznie spadł do około dwukrotności (Figura 1E). Chociaż zmiana krotności była większa bez normalizacji, mamy większe zaufanie do dokładności znormalizowanych danych, które uważamy za lepszą kontrolę dla każdego ogólnego efektu leczenia MG115, a także zmienności spowodowanej przetwarzaniem próbki. Hamowanie proteasomu nie miało wpływu na barwienie VDAC3 w miejscach niecentrosomalnych (ryc. 1B) lub całkowity poziom komórkowy VDAC3 (ryc. 1F). W ten sposób ilościowo weryfikujemy naszą wcześniejszą obserwację, że pula centrosomalna VDAC3 jest regulowana przez degradację za pośrednictwem proteasomu.

Aby zmierzyć zmianę w centrosomalnym VDAC3 podczas cyklu komórkowego, oznaczyliśmy komórki 4-godzinnym impulsem BrdU, po którym następuje 4-godzinny pościg za oznaczonymi komórkami. Ponieważ tylko komórki fazy S będą zawierały BrdU podczas impulsu (średnia odległość między dwoma centrosomami wynosi 1,35 ± 0,16 μm), większość komórek RPE1 BrdU-dodatnich po 4 godzinach pościgu będzie w późnej fazie S lub wczesnej fazie G2 (średnia odległość między dwoma centrosomami wynosi 1,55 ± 0,22 μm), z niewielką populacją w późnej fazie G2, w której para centrosomów znacznie się oddzieliła (średnia odległość między dwoma centrosomami > 2 μm)30. γ-tubulina, będąca głównym składnikiem PCM, znacznie gromadzi się w centrosomach podczas dojrzewania centrosomów, które ma miejsce w fazie G231,32, a wzrost ten sprawia, że jest to słaby wewnętrzny standard oceny zmian cyklu komórkowego innych białek centrosomalnych. Z drugiej strony, Sas6 jest rekrutowany do procentrioli we wczesnej fazie S w celu stymulacji składania kół wozu4,5,7 i pozostaje u podstawy nowo utworzonych centrioli, dopóki komórki nie wejdą w mitozę, gdy zaczną ulegać degradacji (ryc. 2 i odniesienie5). Jednak w komórkach HeLa lub U2OS poziom dośrodkowy Sas6 stopniowo wzrasta w miarę przechodzenia komórek z fazy S do fazyG2 5. Dlatego najpierw zmierzyliśmy poziom centrosomalny Sas6 w odniesieniu do poziomu Cep135, innego rdzeniowego białka centriolarnego, które lokalizuje się na proksymalnych końcach centrioli przez cały cykl komórkowy33. Nie zaobserwowaliśmy żadnej znaczącej różnicy w skorygowanych o tło całkowitych intensywnościach fluorescencji Cep135 lub Sas6 w BrdU-dodatnich komórkach RPE1 z impulsu lub pościgu, gdy centrosomy są blisko siebie oddalone (Figura 3A-D; "bliskie" komórki, w których średnia odległość między dwoma centrosomami jest mniejsza niż 2 μm). W związku z tym znormalizowany poziom Sas6 pozostał podobny w tych komórkach (Figura 3E). Zaobserwowaliśmy jednak niewielki wzrost ogólnych wartości intensywności fluorescencji Sas6 i niewielki wzrost tego samego dla Cep135 w komórkach, w których centrosomy są dobrze oddzielone (odległość między dwoma centrosomami> 2 μm; "odległe" komórki). W związku z tym znormalizowany całkowity poziom centrosomalnego Sas6 w komórkach z dwoma dobrze oddzielonymi centrosomami był nieznacznie, ale statystycznie znacznie wyższy niż w komórkach z blisko rozmieszczonymi centrosomami. Jest to prawdopodobnie spowodowane nieodłączną regulacją poziomu Sas6 wraz z progresją cyklu komórkowego5. Jednak możliwe jest również, że niewielkie wzrosty (które lub o mniejszej istotności statystycznej) wynikają z dodania intensywności fluorescencji dwóch centrosomów, które były analizowane osobno, w porównaniu z analizą dwóch centrosomów w tym samym czasie w komórkach z blisko rozmieszczonymi centrosomami. Niemniej jednak, gdy intensywność fluorescencji VDAC3 została znormalizowana do intensywności samego Sas6, poziom VDAC3 w dwóch blisko rozmieszczonych centrosomach wzrósł około 1,5 razy w komórkach znajdujących się w późnej fazie S / wczesnej fazie G2 w porównaniu z wczesnymi komórkami fazy S (Figura 4A-C, F; "bliskie" komórki). Kiedy komórki te przechodzą do późnej fazy G2, znormalizowany poziom VDAC3 w dwóch centrosomach został zmniejszony 2,4-krotnie w porównaniu z późnym etapem S (Figura 4C, F).

Ponieważ poziomy Sas6 nieznacznie wzrastają od późnej fazy S do G2, użycie Sas6 jako wewnętrznego standardu prowadzi do lekkiego przeszacowania spadku poziomów VDAC3 w późnych komórkach fazy G2 (centrosomy są oddzielone od siebie o więcej niż 2 μm). Chociaż nasze dane sugerują, że Cep135 jest lepszym wyborem jako wewnętrzny standard do oceny zmian cyklu komórkowego, nie możemy go użyć do VDAC3, ponieważ dostępne dla nas przeciwciała VDAC3 i Cep135 pochodzą od królika. Jednak pomnożenie wartości mediany dla VDAC3 znormalizowanego Sas6 (FVDAC3/FSas6) przez medianę wartości znormalizowanego Sas6 znormalizowanego Cep135 daje nam przybliżoną wartość dla VDAC3 znormalizowanego przez Cep135 [(FVDAC3/FSas6) x (FSas6/FCep135) = FVDAC3/FCep135]. Kiedy przeprowadziliśmy tę analizę, zmiana poziomów VDAC3 między późnym S/wczesnym G2 a późnym G2 spada nieznacznie do 2-krotnie. Komórki BrdU-dodatnie, które znajdują się na dowolnym etapie mitozy, oceniane na podstawie skondensowanych chromosomów i słabego barwienia Sas6, są wykluczone z naszej analizy ze względu na dramatyczny spadek poziomów Sas6. Zauważyliśmy jednak, że poziom centrosomalny VDAC3 pozostał niski podczas mitozy (dane nie pokazane). Ponieważ poziomy Cep135 nie spadają podczas mitozy (dane nie pokazane), możemy w zasadzie powtórzyć procedurę renormalizacji, aby oszacować znormalizowane przez Cep135 poziomy VDAC3 w mitozie. Jednak w rzeczywistości centrosomalne poziomy Sas6 w mitozie były zbyt zmienne, aby umożliwić dokładne określenie znormalizowanych przez Sas6 poziomów VDAC3 w pierwszej kolejności. Niezależnie od tego, ogólnie rzecz biorąc, nasze dane potwierdziły, że pula centrosomalna VDAC3 jest regulowana w centrosomach podczas cyklu komórkowego.

Rysunek 1. Asynchronicznie rosnące komórki RPE1 inkubowano z BrdU i MG115 (MG) lub DMSO (DM) przez 4 godziny.(A) Pokazano losowe pola komórek traktowanych DMSO lub MG115 wybarwionych przeciwciałem anty-BrdU (czerwony) i Hoechst (DNA; niebieski). Tutaj i na wszystkich innych obrazach pasek reprezentuje 5 μm. (B-E) Komórki traktowane DMSO lub MG115 zostały wybarwione przeciwciałami przeciwko VDAC3, γ-tubulinie i BrdU. Komórki BrdU-dodatnie obrazowano w identycznych warunkach obrazowania (czasy ekspozycji - 400 ms dla niebieskiego fluoroforu/BrdU; 500 ms dla zielonego fluoroforu/VDAC3; 300 ms dla czerwonego fluoroforu/γ-tubuliny) i określono skorygowane o tło intensywności fluorescencji VDAC3 i γ-tubuliny. Reprezentatywne obrazy przedstawiające VDAC3 (VD3; zielony), γ-tubulinę (γ-tubin; czerwony) i BrdU (niebieski) pokazano na (B). Tutaj i na wszystkich innych obrazach wstawki pokazują cyfrowo powiększone centrosomy, jak wskazują kwadraty. Skorygowane o tło intensywności fluorescencji (F; w dowolnych jednostkach) odpowiadające VDAC3 i γ-tubulinie z dwudziestu pięciu komórek są wykreślane na wykresie pudełkowym i wąsowym odpowiednio w (C) i (D). Tutaj i we wszystkich innych przypadkach pola reprezentują dolny i górny kwartyl, znacznik w polu (-) wskazuje medianę każdej serii, a wąsy reprezentują wartości minimalne i maksymalne. Znormalizowane wartości intensywności fluorescencji VDAC3 z tych dwudziestu pięciu komórek są wykreślane w (E). Dla (C-E) wartość p pochodzi z niesparowanego testu T. oznacza p < 10-5, a n.s. oznacza p > 0,05. (F) Immunobloty wykazujące poziomy VDAC3 w całych komórkach (zarówno VDAC3a, jak i VDAC3b16) oraz γ-tubuliny (γ-tubiny), gdzie α-tubulina (α-tuba) kontroluje obciążenie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Asynchronicznie rosnące komórki RPE1, które zostały oznaczone 4-godzinnym impulsem BrdU i ścigane przez kolejne 4 godziny pod nieobecność BrdU, wybarwiono przeciwciałami przeciwko Sas6 (zielony) i γ-tubulinie (γ-tubulina; czerwony). Reprezentatywne obrazy pokazują barwienie Sas6 podczas (A) fazy S (z dwoma bliskimi ogniskami Sas6), (B) metafazy (dwa słabe ogniska Sas6 na biegunach) i (C) telofazy (ogniska Sas6 są tracone z biegunów). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Asynchronicznie rosnące komórki RPE1 znakowano 4-godzinnym impulsem BrdU i ścigano przez kolejne 4 godziny pod nieobecność BrdU. Komórki BrdU-dodatnie wybarwione dla Cep135 i Sas6 zobrazowano w identycznych warunkach obrazowania (czasy ekspozycji - 400 ms dla niebieskiego fluoroforu / BrdU; 400 ms dla zielonego fluoroforu / Cep135; 500 ms dla czerwonego fluoroforu / Sas6) i określono skorygowane tło intensywności fluorescencji Sas6 i Cep135. Odległość między dwoma centrosomami mierzono również we wszystkich komórkach. Komórka, w której odległość między dwoma centrosomami jest mniejsza niż 2 μm, została uznana za "bliską", a której wartość jest większa niż 2 μm, została sklasyfikowana jako "odległa". (A-B) Pokazane są reprezentatywne obrazy przedstawiające Cep135 (C135; zielony), Sas6 (czerwony) i BrdU (niebieski). W (B), C1 i C2 to dwa centrosomy reprezentatywnej "odległej" komórki. (C-D) Skorygowane o tło intensywności fluorescencji (F; w dowolnych jednostkach) odpowiadające Sas6 (C) i Cep135 (D) z piętnastu komórek każdej kategorii są wykreślane na diagramie pudełkowym i wąsowym. (E) Znormalizowane intensywności Sas6 z tych komórek są wykreślane na wykresie pudełkowym i wąsowym. Dla (C-E) wartość p pochodzi z niesparowanego testu T. * oznacza 0,001 < p < 0,05, a n.s. oznacza p > 0,05. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Komórki BrdU-dodatnie z powyższego testu pościgu impulsowego BrdU (Figura 3) barwione dla VDAC3 i Sas6 zostały zobrazowane w identycznych warunkach obrazowania (czasy ekspozycji - 400 ms dla niebieskiego fluoroforu / BrdU; 500 ms dla zielonego fluoroforu / Sas6; 1,000 ms dla czerwonego fluoroforu / VDAC3), a następnie określono skorygowane o tło intensywności fluorescencji Sas6 i VDAC3. Odległość między dwoma centrosomami zmierzono we wszystkich komórkach, a komórki sklasyfikowano jako "bliskie" (odległość między dwoma centrosomami < 2 μm) i "odległe" (odległość między dwoma centrosomami > 2 μm), jak na rysunku 3. (A-C) Pokazane są reprezentatywne obrazy "zamkniętej" komórki w impulsie BrdU (A), w pościgu BrdU (B) i "odległej" komórki w BrdU chase (C) wybarwionej na obecność VDAC3 (VD3; zielony), Sas6 (czerwony) i BrdU (niebieski). W (C) C1 i C2 to dwa centrosomy. [D-E] Skorygowane o tło intensywności fluorescencji (F; w dowolnych jednostkach) odpowiadające VDAC3 (D) i Sas6 (E) z piętnastu komórek każdej kategorii są wykreślane na wykresie pudełkowym i wąsowym. (F) Znormalizowane intensywności VDAC3 z tych komórek są wykreślone na wykresie pudełkowym i wąsowym. Dla (D-F) wartość p pochodzi z niesparowanego testu T. Oznacza p < 10-5, ** oznacza 10-5 < p < 0,001, a N.S. oznacza p > 0,05. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.